CN103757117A - 食品和饲料中貉成分快速检测试剂盒的制备和检测方法 - Google Patents

食品和饲料中貉成分快速检测试剂盒的制备和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食品和饲料中貉成分快速检测试剂盒的制备和检测方法，属于食品和饲料中动物源性成分的定性检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品和饲料中貉成分的试剂盒及方法。试剂盒包括2×PCRMasterMix、上游引物、下游引物、Taqman探针；其中2×PCRMasterMix中含有TaqDNA聚合酶、反应缓冲液、氯化镁、dNTP；貉成分的快速检测方法包括食品和饲料DNA的提取、貉成分的实时荧光PCR扩增和结果判定。本发明的优点是快速、特异性强、操作简便、重复性好，该方法灵敏度很高，可检测含量低至0.00001%的貉成分。

Description

食品和饲料中貉成分快速检测试剂盒的制备和检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行动物源性成分快速检测的方法，具体是一种貉成分的实时荧光PCR检测方法。
背景技术
貉，别名称狸，在动物学分类上属哺乳纲，食肉目，犬科（Canidae），貉属（Nyctereutes）。主要分布于前苏联各国、中国、朝鲜、日本、蒙古、芬兰等国家，在我国几乎各省区均有分布。貉是一种珍贵的毛皮动物，貉皮属大毛细皮、具有坚韧耐磨、轻便柔软、美观保温等优点，是制作大衣、皮领、帽子和皮褥等裘皮制品的优质原料。貉的针毛和尾毛可用于制作高级化妆用毛刷、胡刷和毛笔等。貉可入药，其胆、睾丸是名贵中药材，貉油具有烫伤药用价值，也是开发化妆品的上等原料。貉经济价值高，且适应性较强，易于驯养繁殖，饲养管理较为简单，因此养貉业发展十分迅速，其养殖业已成分现代畜牧业的一个重要组成部分。目前人工养殖的貉，以黑龙江省的乌苏里貉为最多。
貉主要作为一种皮毛经济动物，养殖过程中有时需要添加激素类饲料，并且要定期注射一些抗生素药品，因此体内常残留超标的激素和抗生素，故貉肉不作为人类常用肉类供人食用。近年来，一些不法商贩，受利益驱动，低价收购未经检验检疫的貉肉，加工后冒充狗肉、驴肉，甚至制成肉卷、肉串、香肠等谋取暴利。这种制售假冒制品的行为，不仅可能危害人类健康，还涉及到宗教信仰问题，严重损害了消费者的利益。随着疯牛病和禽流感等疾病的流行和食品贸易的全球化, 消费者迫切地要求知晓食品的确切成分，世界各国都制定了相应的标签制度，要求在食品标签中明确动物源性制品的种类和来源。此外，饲料安全也直接关乎食品安全，包括我国在内的欧盟、美国等很多国家先后颁布多个法规，规定禁止在反刍动物饲料中使用、添加以哺乳类动物为原料的动物性饲料产品，以有效防止哺乳动物的病原体从动物传染到别的动物和人类。鉴于此，尽快建立可靠有效的貉成分检测方法，对于确保食品和饲料标签真实准确，加强食品和饲料标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。
食品和饲料中动物源性成分检测，常采用DNA检测的方法。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样容易受到外界环境因素和加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种貉成分快速检测试剂盒的制备和检测方法，克服基于蛋白的检测方法在某些食品和饲料检测中的局限性，为貉成分检测提供有效工具，从而确保食品和饲料标签的一致性，保护消费者利益。
本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组特异性引物和一条特异性Taqman-MGB探针，经优化反应体系和反应程序，最终建立待测样品的实时荧光PCR检测方法。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman-MGB探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有非荧光性淬灭集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3'→5'外切核酸酶活性就会将探针切断,报告集团远离淬灭集团,其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。
本发明涉及的貉成分快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下：
（1）2×PCR Master Mix
包括0.05 u/µL Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，4 mmol/L氯化镁，0.4 mmol/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)；
其中反应缓冲液含有20 mmol /L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、100 mmol/L氯化钾和2％曲拉通X－100；
（2）上游引物：10 µmol/L，序列为：5'- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3'；
（3）下游引物：10 µmol/L，序列为：5'- CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3'；
（4）Taqman-MGB探针：10 µmol/L，序列为：5'- CATACTACTCCGGGAAAA -3'。
使用上述试剂盒检测食品和饲料中貉成分的方法，依次包括下列步骤（1）-（3）：
（1）待检样品DNA的提取
DNA 提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA 提取试剂盒。
（2）貉成分的实时荧光PCR扩增
A. 在反应管中加入2×PCR Master Mix 12.5 µL，上游引物和下游引物各0.5-1 µL，Taqman探针0.5-1 µL，100 ng/µL待测样品的DNA 1-2 µL，补充双蒸水至25 µL，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
94－95℃　5 min，１个循环，预变性；
94－95℃　10－20 sec；60℃ 40－60 sec，40个循环，PCR扩增。
扩增时，应设立三个对照：阳性对照（取貉肉提取的基因组DNA）、阴性对照（非貉基因组DNA）、空白对照（不含DNA模板，可以水代替）。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
如待测样品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立（即阳性样品出现典型阳性扩增曲线，阴性样品和空白对照无扩增），则可判定该样品检出貉成分。
如待测样品未出现扩增曲线，无Ct值，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则可判定该样品未检出貉成分。
如待测样品Ct值在36-40之间，应重作实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品检出貉成分；再次扩增后的结果为无扩增曲线无Ct值，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品未检出貉成分。
本发明建立了貉成分的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。该发明具有特异性强、灵敏度高、操作简便的特点。使用本试剂盒及检测方法，可检测含量低至0.00001%的貉DNA，其绝对检测限为21 fg；而且与包括同属犬科的貉属、狐属、犬属动物在内的其他近缘物种及非近缘物种没有交叉反应，特别适用于一些成分复杂的加工食品和饲料中貉成分的检测。
附图说明
图1为用实时荧光PCR技术检测蓝狐、赤狐、银黑狐、十字狐、貉、水貂、贵妃犬、金毛猪犬、博美犬、京八犬、西施犬、雪纳瑞犬、可卡犬、泰迪犬、猫、牛、羊、猪、鸡、太平洋鳕鱼、驴、兔、鹿、玉米、大豆、大米DNA，上述样品的扩增图谱。
图2为空白对照（水）的扩增图谱。
图3为阳性对照（貉DNA）扩增图谱。
图4为用实时荧光PCR技术检测不同含量貉成分DNA溶液的扩增图谱。
图5为不同含量貉成分DNA溶液实时荧光PCR扩增的标准曲线。
图6为用实时荧光PCR技术检测某待测肉卷样品DNA，样品的扩增图谱。
图7为阴性对照（狐狸DNA）的扩增图谱；图8为空白对照（水）的扩增图谱。
图9为阳性对照（貉DNA）扩增图谱。
图10为用实时荧光PCR技术检测某待测饲料样品DNA，样品的扩增图谱。
图11为阴性对照（狐狸DNA）的扩增图谱。
图12为空白对照（水）的扩增图谱。
图13为阳性对照（貉DNA）扩增图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
按下列配方制作貉成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：
（1）2×PCR Master Mix
包括0.05 u/µL Taq DNA 聚合酶，反应缓冲液，4 mmol/L 氯化镁，0.4 mmol/L dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)；
其中反应缓冲液含有20 mmol /L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、100 mmol/L氯化钾和2％曲拉通X－100；
（2）上游引物：10 µmol/L，序列为：5'- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3'；
（3）下游引物：10 µmol/L，序列为：5'- CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3'；
（4）Taqman-MGB探针：10 µmol/L，序列为：5'- CATACTACTCCGGGAAAA -3'。
按照以下程序进行检测：
（1） 非貉样品DNA的提取
A. 称取0.1 g样品，加至2 mL离心管中。加入600 µL预热的CTAB裂解缓冲液和40 μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温90 min；
B. 2 000 g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀；
C. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
D. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65℃ 的TE缓冲液溶解沉淀；
E. 加入5 μL RNA酶溶液，37 ℃ 30 min；
F. 加入200 μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡；
G. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
H. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500 μL，涡旋清洗沉淀；
I. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 µL TE缓冲液溶解沉淀，−20℃保存备用。
（2） 非貉样品DNA的实时荧光PCR扩增：
A. 在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCR Master Mix 12.5 µL，上游引物和下游引物各0.5 µL，Taqman探针0.5 µL，100 ng/µL非貉样品的DNA 2 µL，补充双蒸水至25 µL，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃　2 min，１个循环，预变性；
95℃　15 sec；60℃ 40 sec，40个循环，PCR扩增。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
蓝狐、赤狐、银黑狐、十字狐、貉、水貂、贵妃犬、金毛猪犬、博美犬、京八犬、西施犬、雪纳瑞犬、可卡犬、泰迪犬、猫、牛、羊、猪、鸡、太平洋鳕鱼、驴、兔、鹿、玉米、大豆、大米均未出现阳性扩增曲线，上述物种的扩增线平直，在基线下聚集成团，见图1；空白对照（水）无扩增，见图2；阳性对照（貉DNA）产生典型阳性扩增曲线，见图3。
该组引物和探针，经在线BLAST的结果证实，具有很高的特异性，不会与其他物种发生交叉反应。貉为犬科动物，因此在特异性实验中特别选择同属犬科的狐狸、狗以及其他可能作为食品和饲料原料的牛、羊、大豆、大米等进行实验。经验证，除貉的基因组DNA出现阳性扩增曲线外，其他物种均无扩增，与预期相符，表明该组引物和探针有良好的特异性，与上述物种没有交叉反应。
实施例2
按下列配方制作貉成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：
（1）2×PCR Master Mix
包括0.05 u/µL Taq DNA 聚合酶，反应缓冲液，4 mmol/L 氯化镁，0.4 mmol/L dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)；
其中反应缓冲液含有20 mmol /L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、100 mmol/L氯化钾和2％曲拉通X－100；
（2）上游引物：10 µmol/L，序列为：5'- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3'；
（3）下游引物：10 µmol/L，序列为：5'- CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3'；
（4）Taqman-MGB探针：10 µmol/L，序列为：5'- CATACTACTCCGGGAAAA -3'。
按照以下程序进行检测：
（1） 不同含量貉样品DNA的提取
A. 将貉肉和羊肉，加入液氮，研磨成粉末状后，各称取0.1 g，加至2 mL离心管中。各管中分别加入600µL预热的CTAB裂解缓冲液和40 μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温90min；
B. 2 000 g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中；
C. 将貉肉和羊肉样品的DNA抽提缓冲液按比例（100%、10%，1%，0.1%，0.01%，0.001%，0.0001%，0.00001%）进行混合；
D. 加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀；
E. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
F. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65℃ 的TE缓冲液溶解沉淀；
G. 加入5 μL RNA酶溶液，37 ℃ 30 min；
H. 加入200 μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡；
I. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
G. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500 μL，涡旋清洗沉淀；
K. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 µL TE缓冲液溶解沉淀，−20℃保存备用。
（2）不同含量貉样品DNA的实时荧光PCR扩增：
A. 在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCR Master Mix 12.5 µL，上游引物和下游引物各0.5 µL，Taqman探针0.5 µL，100 ng/µL待测样品的DNA 2 µL，补充双蒸水至25 µL，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃　2 min，１个循环，预变性；
95℃　15 sec；60℃ 40 sec，45个循环，PCR扩增。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
含量为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%和0.00001%貉成分的DNA样品均出现典型的阳性扩增，见图4；在10%-0.00001%范围间荧光PCR有良好的线性关系，见图5。
貉肉样品取100 mg，提取得到的核酸浓度为107.6 ng/μL，检测中使用2 μL， DNA总量为215.2 ng。据此可粗略估计当DNA抽提缓冲液中的貉成分含量为0.00001%，貉成分 DNA总量为21.52 fg，即该方法的绝对检测限为21.52 fg。
实施例3
按下列配方制作貉成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：
（1）2×PCR Master Mix
包括0.05 u/µL Taq DNA 聚合酶，反应缓冲液，4 mmol/L 氯化镁，0.4 mmol/L dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)；
其中反应缓冲液含有20 mmol /L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、100 mmol/L氯化钾和2％曲拉通X－100；
（2）上游引物：10 µmol/L，序列为：5'- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3'；
（3）下游引物：10 µmol/L，序列为：5'- CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3'；
（4）Taqman-MGB探针：10 µmol/L，序列为：5'- CATACTACTCCGGGAAAA -3'。
按照以下程序进行检测：
（1）待测肉卷样品DNA的提取
A.称取0.3 g肉卷样品，加至2 mL离心管中。加入600 µL预热的CTAB裂解缓冲液和40 μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温90 min；
B. 2 000 g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀；
C. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
D. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65℃ 的TE缓冲液溶解沉淀；
E. 加入5 μL RNA酶溶液，37 ℃ 30 min；
F. 加入200 μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡；
G. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
H. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500 μL，涡旋清洗沉淀；
I. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 µL TE缓冲液溶解沉淀，−20℃保存备用。
（2）待测肉卷样品DNA的实时荧光PCR扩增
A. 在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCR Master Mix 12.5 µL，上游引物和下游引物各0.5 µL，Taqman探针0.5 µL，100 ng/µL待测样品的DNA 1 µL，补充双蒸水至25 µL，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃　2 min，１个循环，预变性；
95℃　15 sec；60℃ 40 sec，40个循环，PCR扩增。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
样品出现阳性扩增曲线，Ct值为25.22，见图6；阴性对照（狐狸DNA）无扩增，见图7；空白对照（水）无扩增，见图8；阳性对照（貉DNA）产生典型阳性扩增曲线，见图9，据此可判定该样品检出貉成分。
实施例4
按下列配方制作貉成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：
（1）2×PCR Master Mix
包括0.05 u/µL Taq DNA 聚合酶Polymerase，反应缓冲液，4 mmol/L 氯化镁，0.4 mmol/L dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)；
其中反应缓冲液含有20 mmol /L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、100 mmol/L氯化钾和2％曲拉通X－100；
（2）上游引物：10 µmol/L，序列为：5'- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3'；
（3）下游引物：10 µmol/L，序列为：5'- CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3'；
（4）Taqman-MGB探针：10 µmol/L，序列为：5'- CATACTACTCCGGGAAAA -3'。
按照以下程序进行检测：
（1）待测饲料样品DNA的提取
A. 称取0.3 g饲料样品，加至2 mL离心管中。加入600 µL预热的CTAB裂解缓冲液和40 μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温90min；
B. 2 000 g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀；
C. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
D. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65℃ 的TE缓冲液溶解沉淀；
E. 加入5 μL RNA酶溶液，37 ℃ 30 min；
F. 加入200 μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡；
G. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
H. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500 μL，涡旋清洗沉淀；
I. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 µL TE缓冲液溶解沉淀，−20℃保存备用。
（2）待测饲料样品DNA的实时荧光PCR扩增
A. 在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCR Master Mix 12.5 µL，上游引物和下游引物各0.5 µL，Taqman探针0.5 µL，100ng/µL待测样品的DNA 1 µL，补充双蒸水至25 µL，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃　2 min，１个循环，预变性；
95℃　15 sec；60℃ 40 sec，40个循环，PCR扩增。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果
样品未出现阳性扩增曲线，见图10；阴性对照（狐狸DNA）无扩增，见图11；空白对照（水）无扩增，见图12；阳性对照（貉DNA）产生典型阳性扩增曲线，见图13，据此可判定该样品未检出貉成分。
核苷酸序列表
<110> 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 食品和饲料中貉成分快速检测试剂盒的制备和检测方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> 用于扩增貉线粒体细胞色素C氧化还原酶Ｉ亚单位基因的上游引物
<400> 1
AATCTTGCCTGGGTTTGGAA 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
<223> 用于扩增貉线粒体细胞色素C氧化还原酶Ｉ亚单位基因的下游引物
<400> 2
CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA 24
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<223> 用于检测貉线粒体细胞色素C氧化还原酶Ｉ亚单位基因的Taqman探针
<400> 3
CATACTACTCCGGGAAAA 18

Claims (2)

1.一种貉成分快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括（1）－（4）：
（1）2×PCR Master Mix
包括0.05 u/µL Taq DNA 聚合酶，反应缓冲液，4 mmol/L 氯化镁，0.4 mmol/L dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)；
其中反应缓冲液含有20 mmol /L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、100 mmol/L氯化钾和2％曲拉通X－100；
（2）上游引物：10 µmol/L，序列为：5'- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3'；
（3）下游引物：10 µmol/L，序列为：5'- CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3'；
（4）Taqman-MGB探针：10 µmol/L，序列为：5'- CATACTACTCCGGGAAAA -3'。
2.一种使用如权利要求1所述的试剂盒快速检测貉成分的方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）待检样品DNA的提取；
（2）貉成分的实时荧光PCR扩增：
A. 在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCR Master Mix 12.5 µL，上游引物和下游引物各 0.5-1 µL，Taqman探针0.5-1 µL，100 ng/µL待测样品的DNA 1-2 µL，补充双蒸水至25 µL，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
94－95℃　5 min，１个循环，预变性；
94－95℃　10－20 sec；60℃ 40-60 sec，40个循环，PCR扩增；
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349541A (zh) * 2015-12-10 2016-02-24 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光pcr引物和探针
CN110106253A (zh) * 2018-02-01 2019-08-09 东北林业大学 一种基于mgb探针的水貂毛皮制品真伪的鉴定方法
CN110117643A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 东北林业大学 一种貉裘皮制品真伪的荧光pcr检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
詹崇伟等: "貉IL-2基因的克隆与进化关系的分析", 《经济动物学报》 *
闫守庆等: "貉α-卫星DNA的克隆及序列分析", 《中国兽医学报》 *
闫守庆等: "貉微卫星DNA富集文库的构建与鉴定", 《东北林业大学学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349541A (zh) * 2015-12-10 2016-02-24 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光pcr引物和探针
CN110106253A (zh) * 2018-02-01 2019-08-09 东北林业大学 一种基于mgb探针的水貂毛皮制品真伪的鉴定方法
CN110117643A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 东北林业大学 一种貉裘皮制品真伪的荧光pcr检测方法

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