CN104962650A - 一种同步鉴别动物源性成分的pcr方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于肉类及动物源性相关产制品溯源和鉴定技术领域，具体提供一种同步鉴别动物源性成分的PCR方法及试剂盒，包括可以在一次PCR反应中同时鉴定山羊、绵羊、鹿、水牛、家牛、牦牛、猪和骆驼共8种动物源性成分的引物及鉴定方法，以及包含上述引物的试剂盒和应用方法。引物的核苷酸序列如SEQ ID1和SEQ ID2所示。本发明操作简单，特异性强，设备要求不高，能在一次PCR中同时鉴定8种动物源性成分。本发明技术适用于肉类及其产制品的掺假检测和溯源鉴定，方法简单快速，扩大了对未知物种的筛选范围，提高了检测效率。

Description

一种同步鉴别动物源性成分的PCR方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及肉及动物产制品中动物源性成分鉴定的检验技术领域，具体涉及一种利用线粒体DNA鉴定山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛源性成分的PCR方法及试剂盒。

背景技术

动物源性成分鉴定源于对动物饲料中添加牛羊成分的检测。1985年英国发生“疯牛病”，并在随后的几年里传播至欧洲多个国家和地区。“疯牛病”不仅给这些国家带来经济损失，还带来政治上的危机。后来研究证明，饲料中添加的含有“疯牛病”致病因子朊蛋白的牛羊源成分是传播该病的重要媒介，因此世界各国明令禁止在饲料中添加牛羊源性成分，并对此进行严格检测。如今，随着社会经济的发展，肉类及其产制品已经成为人们营养所需和日常消费的重要来源。但另一方面，较高的肉类生产成本和价格致使部分不法商贩以次充好、掺假造假事件及所谓的“挂羊头卖狗肉”时有发生，“假牛肉事件”和“马肉风波”等食品问题便是典型案例，这不仅损害了消费者的利益，同时带来诸多社会问题。当今的食品种类更加丰富多样化，一部分加工食品改变了外观和气味；与之同时，网络销售也给掺假造假带来了可乘之机。

早期肉类鉴别主要依赖于感官和形态学检验，这些检验方法受到仪器、人员经验和样本处理过程等诸多局限性，准确性低，尤其对于深加工的肉类以及饲料中添加的动物源性成分基本无法鉴别。随着分子生物学的发展，鉴定技术发展了形态学分析和成分鉴定方法，在这个过程中基本确立了以特征性的蛋白和核酸作为靶标物质进行检验的思路，如今形成了蛋白检验和DNA分析两个不同的检测方向。经过20多年的发展，两种鉴别技术在精度和灵敏度均有极大提高。但是当肉类经过物理处理如切碎、混合、腌制、蒸煮和熏烤等过程后失去了原有形态和质地，蛋白质鉴定技术很难满足对这些样品检测的需要。而DNA尤其是线粒体DNA(mtDNA)具有耐热性强、不依赖于细胞形态、种间多态性好等特点，表现出更高的准确度和精度以及重复性，成为近年来物种鉴定“DNA条形码”技术发展的首选靶标。

国家监管部门先后颁布多项法律法规来规范动物性食品加工销售的多个环节，在技术上也制定了一系列的方法标准用于常见肉类动物成分的检测。但另一方面，大部分现行国家标准的检测对象为单一物种或同类物种，检测效率低，对于未知物种更是难以鉴定。同时，多数方法基于荧光定量PCR技术，存在对仪器要求高、试剂相对价格高等特点，对大批量样品进行筛选的成本高、耗时长，难以在基层检测部门开展推广应用。因此，建立一种简便易行且可以同时鉴定多种动物源性成分的检测方法以便提高检测工作效率，这对未知动物源性成分的溯源鉴定也具有重要意义。

发明内容

为了解决现有物种鉴定技术中一次只能鉴定一个物种、而多重PCR技术又存在特异性低的不足，本发明提供了一种能在一次PCR操作中鉴别山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8种动物源性成分的方法，及由此获得的物种鉴定检测试剂盒。

申请人经过对多种常见物种的mtDNA全序列做精细对比，获得了山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种的mtDNA特异性插入-缺失片段，因此可在PCR扩增后依据扩增产物同时鉴定这些物种，提高了检测效率。

本发明的方法，包括如下步骤：

1)提取待检测样品的基因组DNA，将提取的样品基因组DNA溶于TE溶液中保存备用；

2)利用PCR引物对检测样品的基因组DNA进行PCR扩增反应；

所用引物序列如下：

上游引物：CCTCCCTAAGACTCAAGGAA(SEQ ID NO：1)、

下游引物：AGCGGGTTGCTGGTTTCACG(SEQ ID NO：2)；

3)对PCR产物进行电泳检测，依据PCR产物条带大小和有无可判定检测样品中是否含有上述8种动物源性成分，其中山羊、绵羊、鹿、水牛、家牛、牦牛、猪和骆驼扩增后获得对应片段大小分别为760bp、737bp、537bp、486bp、481bp、464bp、429bp和359bp。

作为优选，在步骤2)同时设置阳性和阴性对照组。

步骤2)的PCR反应程序如下：

95℃变性5min；95℃变性30s，退火61.5℃35s，72℃延伸30s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持10min。结束后降温至4℃。

所述的阳性对照为完好的山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛基因组DNA样品，阴性对照为双蒸水。

本发明还提供一种适用山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛成分检测的PCR试剂盒，其包含下列试剂及合适浓度：

PCR A液：含有dNTP、MgCl₂、PCR buffer、Taq聚合酶、引物和双蒸水。

PCR B液：含有阳性DNA模板，包括山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼、牦牛的基因组DNA。

本发明与现有技术相比，可以在一次PCR反应中检测山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种，且具有良好的特异性和灵敏性。相对现有检测技术大大提高了检测效率，尤其对于未知物种成分的溯源检测具有重要意义。相比更为复杂的多重PCR技术，本发明在一定程度上提高了灵敏度，更为重要的是一次PCR就可以鉴定8个物种，大大提高了筛选和检测的效率。本发明基于PCR技术平台开发，对实验室设备要求不高，适于绝大多数单位应用。

附图说明

图1是本发明对山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛的DNA样品的PCR扩增电泳检测结果。图中所示为泳道编号1-8和对应产物大小(第二行数字是对应PCR产物大小，单位bp)：1：山羊；2:绵羊；3：鹿；4：水牛；5：家牛；6：牦牛；7：猪；8：骆驼。参照分子量标注依次是1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp和100bp。

图2是本发明对8种动物DNA样品PCR产物SspI酶切鉴定的检测结果。图中各泳道标注了物种名称，其酶切后对应产物片段大小如下：山羊：291bp、192bp、160bp和118bp；绵羊：300bp、213bp和75bp；鹿：391bp和146bp；水牛：486bp；家牛：303bp和178bp；牦牛：214bp、178bp和73bp；猪：300bp和129bp；骆驼：359bp。

具体实施方式

申请人经过对山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种及常见动物(包括鸡、鸭、鼠、兔、狗、马、驴、鱼类)的mtDNA全序列做精细对比，发现了这些物种的保守序列以及所辖区间特有的变异序列，这段变异序列在物种间存在插入-缺失多态性，因此可以用于物种鉴定。在保守区设计引物，经过PCR条件优化后完全能够达到预期效果且扩增片段大小与预期结果一致，特异性和稳定性良好，更为重要的是可在一步PCR中同时鉴定这8个物种，提高了物种溯源研究和检测效率。

下面结合实例对本发明的方法过程做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1引物设计

根据GenBank所公布的基因序列，以山羊(GU229278)、鹿(HQ191428)、水牛(AF702618)、牛(EU177861)、绵羊(KF938337)、牦牛(KM233416)、猪(AF486867)和骆驼(AP003423)的mtDNA全序列为模板，通过比对分析8个物种和常见物种(鸡、鸭、兔、鼠、马、狗)的mtDNA序列，根据其基因序列的特异性和保守性，利用Primer premier 5.0软件，设计多个物种的通用引物，该引物与上述山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种的mtDNA序列配对。引物序列如下所示：

通用下游引物(SEQ ID NO：1)：AGCGGGTTGCTGGTTTCACG、

通用上游引物(SEQ ID NO：2)：CCTCCCTAAGACTCAAGGAA。

实施例2 PCR反应体系的优化

PCR反应体系采用了20μL的基础体系，其中2.0μL的Buffer缓冲液，0.2μL的SEQ ID 1和SEQ ID 2，1.6μL的dNTP mix，1.6μL的MgCl₂缓冲液，3.0μL基因组DNA提取液(约30ng DNA)，Taq DNA聚合酶0.2μL，最后加水补充至20μL。

根据上述PCR体系，在梯度PCR仪上设置温度梯度进行退火温度优化(温度范围45.0～65.0℃)。基本的PCR过程如下：95℃变性5min；95℃变性40s，不同退火温度30s，72℃延伸40s为一个循环，共计30个循环；然后72℃延伸10min。

不同温度下的PCR产物经电泳检测(4S Red琼脂糖核酸染料)后选取电泳结果最佳的温度作为基础体系的温度，然后在该温度下依次进行Mg²⁺浓度(1.5，1.8，2.1，2.5，3.0mM)、dNTP浓度和引物浓度以及PCR程序的优化。

经过上述反应过程并进行结果对比，确定了20μL体积PCR反应体系，其中Buffer缓冲液2.0μL，引物SEQ ID 1和SEQ ID 2各2.0μL，dNTP mix 1.6μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，MgCl₂1.2μL，DNA模板3.0μL(约含30ng DNA)，ddH₂O补充至20.0μL。其优化后的PCR过程如下：95℃变性5min；95℃变性30s，退火61.5℃35s，72℃延伸30s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持5min。

本发明实施中采用2.0％琼脂糖凝胶分离PCR产物，4S Red核酸染料按照说明书添加至融化的凝胶中。90V恒压电泳35min后凝胶成像系统下拍照观察。结果显示，对本发明中PCR产物均可清洗分辨其大小。图1是本发明对山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛的DNA样品的PCR扩增电泳检测结果，图中泳道编号1-8分别展示了上述8个物种的对应PCR产物，其对应产物大小在第二行数字标注(单位bp)。

实施例3 PCR产物酶切鉴定

为了能够更好的区分本发明中8个物种，尤其是PCR产物大小相近的山羊和绵羊，水牛、牦牛和家牛，发明人对扩增序列进行了精细对比并应用生物学软件寻找合适的内切酶，最后选择了SspI内切酶对PCR产物酶切鉴定，结果表明酶切后各物种对应PCR产物产生大小不同的片段，山羊PCR产物分成291bp、192bp、160bp和118bp共4个片段；绵羊PCR产物酶切后分成300bp、213bp和3个75bp的片段；鹿的PCR产物酶切产生391bp和146bp两个片段；水牛和骆驼PCR产物没有切点，因此分别保留原来的486bp和359bp大小；家牛PCR产物酶切后产生303bp和178bp两个片段，而牦牛则有214bp、178bp和73bp三个片段；猪的PCR产物酶切后有300bp和129bp两个片段，依据这些片段数量和大小差异能够清晰鉴别各个物种，具体电泳见图2。

实施例4

为验证引物组合的特异性和灵敏度，对包括上述8个物种和鸡、鸭、鱿鱼、小黄鱼、牛蛙、马、驴、狗、鼠和兔的基因组DNA进行了扩增反应，结果证明除了上述8个物种外其他动物无PCR扩增。同时还证明，本PCR体系对大豆基因组DNA无扩增产物。随后对引物SEQ ID 1和SEQ ID 2组合进行灵敏度检测。把家牛、绵羊、猪、鹿和牦牛基因组DNA模板按照梯度稀释最低浓度至1.0pg/μL，最优条件下添加不同量的DNA模板，扩增后取5.0μL的PCR产物电泳检测。结果表明在20μL体积的PCR反应体系中对家牛DNA的最低检测量为6pg，绵羊DNA的最低检测量为8pg，猪的最低检测量为4pg，鹿的最低检测量为20pg，牦牛的最低检测量为20pg。

实施例5实际检测与应用

根据优化后的PCR实验条件，采用引物SEQ ID 1和SEQ ID 2组合对山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种的样品DNA及其混合物进行PCR扩增，电泳检测，条带清晰，能清晰判读各物种。随后对市场在售的烤肉串、烤鹿肉、猪肉芹菜水饺、熟牛肉、五香驴肉、手撕驼肉、高原牦牛肉、烤羊排各5个样品进行了检测，其中牛肉、羊肉和鹿的鉴定参照GB/T 21104-2007执行，猪肉的检测参照GB/T 21101-2007执行，牦牛、驴肉和驼肉的鉴定均采用PCR产物直接纯化后测序的方法。结果表明，熟牛肉、五香驴肉、手撕驼肉、高原牦牛肉、烤羊肉中存在不同程度的掺入其他肉类的情况，熟牛肉中有3份掺入有水牛肉，五香驴肉有3份完全是牛肉，手撕驼肉有4份完全是牛肉，高原牦牛肉中4份完全是牛肉，烤羊肉中均检测到猪肉成分。牦牛和驼肉的PCR测序结果和GenBank公布的牦牛(KM65859)和驼(JN632608)的序列同源性达到98.2％和99.2％，与其他物种的序列同源性均低于对应比例。因此，本发明建立的方法对物种的鉴定具有很高的可靠性。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述实施说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种鉴别山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8种动物源性成分的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)提取待检测样品的基因组DNA，将提取的样品基因组DNA溶于TE溶液中保存备用；

2)利用PCR引物对检测样品的基因组DNA进行进行PCR扩增反应；

所用引物序列如下：

上游引物：CCTCCCTAAGACTCAAGGAA；

下游引物：AGCGGGTTGCTGGTTTCACG；

PCR反应的一种体系如下：2.0μL的Buffer缓冲液，0.2μL的上游引物和下游引物，1.6μL的dNTP mix，1.4μL的MgCl₂缓冲液，3.0μL基因组DNA提取液，Taq DNA聚合酶0.2μL，最后加水补充至20μL；

3)对PCR产物进行电泳检测，依据PCR产物条带大小和有无可判定检测样品中是否含有上述8种动物源性成分，其中山羊、绵羊、鹿、水牛、家牛、牦牛、猪和骆驼扩增后获得对应片段大小分别为760bp、737bp、537bp、486bp、481bp、464bp、429bp和359bp。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)的PCR反应程序如下：

95℃变性5min；95℃变性30s，退火61.5℃35s，72℃延伸30s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持10min。结束后降温至4℃。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的在步骤2)同时设置阳性和阴性对照组。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的阳性对照为完好的山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛基因组DNA样品。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的阴性对照为双蒸水。

6.一种适用山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛成分检测的PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有：

PCR A液：含有dNTP、MgCl₂、PCR buffer、Taq聚合酶、引物和双蒸水。

PCR B液：含有阳性DNA模板，包括山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼、牦牛的基因组DNA。