CN103642917A - 鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由预混液1和预混液2构成。该试剂盒鉴定鼠源性成分具有良好的特异性，灵敏度可达到1pg/反应，可成功地对肉类及其产品中的鼠源性成分进行鉴定，可用于食品安全检测部门对肉类及其制品掺假的监管与控制，具有显著的实用价值。

Description

鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法
技术领域
本发明涉及鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法，尤其是一种特异性好，灵敏度高的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法。
背景技术
近年来，不法商贩利用廉价的肉类冒充高价牛、羊肉的肉类掺假事件频发。更为严重的是，近期市面上出现了用来源不明的鼠肉冒充羊肉的恶性案例，引起社会各界广泛关注。鼠肉掺假不仅影响了肉类产品市场的正常运行，更造成了严重食品安全隐患。老鼠多生活于潮湿脏乱的环境中，携带多种细菌病毒。死鼠肉极易腐烂而滋生细菌，一些死鼠体内还含有老鼠药等强力毒药成分。因此，一旦老鼠肉被混掺入食用肉类及肉制品，食用后会造成人体中毒，轻则恶心、呕吐，重则可能导致死亡。 
以聚合酶链反应（PCR）为基础的检测技术已成为食品溯源，尤其是肉类种属鉴别的核心技术。该技术针对不同物种基因序列的差异，设计特异性的引物，利用PCR扩增反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，从而鉴别食品中的物种来源。实时荧光PCR的发展和应用提高了食品溯源方法的灵敏度，并为肉类及肉制品定量定性分析提供技术支持。目前，基于线粒体基因设计特异性的引物而建立PCR法和实时荧光PCR的方法已见大量报道，市面上已有许多利用此类方法检测肉及肉制品源性的试剂盒，在肉制品掺假控制与监管中发挥了重要作用。
然而，此类试剂盒多用于对肉制品中牛、羊、猪及禽类等源性的检测，而针对肉制品中鼠源性成分的检测的试剂盒还未有所见。在国外，已有运用普通PCR鉴别啮齿目物种源性的研究，但经过试验验证，该研究中针对啮齿目所设计的引物对猪、牛、羊等常见肉类均可以发生扩增反应，特异性差。在国内，目前市面上出现了针对海狸鼠源性成分的鉴定试剂盒。该试剂盒采用普通PCR方法，操作步骤繁琐，在灵敏度和特异性上都有一定的局限性。同时，在分类学上海狸鼠并不属于鼠科，而在国内某些地区，海狸鼠被视为可食用的肉类，因此使用海狸鼠掺假肉制品的危害性远小于本发明中调研选取的鼠科样本。
为了弥补鼠源性成分鉴定试剂盒的市场空缺，丰富肉制品掺假检测方法，我们开发了肉及肉制品中鼠源性成分检测的高灵敏度试剂盒。本发明针对生活中常见的可能掺假肉制品的鼠类，基于实时荧光定量PCR技术，设计鼠源性引物探针，具有良好的针对3种常见鼠肉的特异性，与其他肉类无交叉反应，灵敏度高达1皮克/反应，且总检测时间可控制在2小时以内，对肉制品掺假的监管和控制有着重要的意义。
发明内容
为了对肉制品掺假进行监管和控制，本发明提供了一种特异性好，灵敏度高的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法。
为实现该目的，本发明提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由以下试剂构成：
预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR 反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM，PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl 2  1.5 mM；储藏条件为4 oC，保质期半年。
预混液2，其包含引物A 2μM, 序列为5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B 2μM， 序列为5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列荧光探针C4μM，序列为5'-FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3', 荧光探针D 4μM，序列为5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及内参核酸 0.005ng/μL；储藏条件为-20 oC，避光，保质期半年。
本发明还提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S21、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序；
S22、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和荧光探针；
S23、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性；
S24、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒；
S25：使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。
优选地，步骤S21具体包括：反应体系为25μL，其中包括12.5μL premix Taq (2X, Takara, version 2.0), 0.5μL 10μM Seq 正、反向引物, 100ng 模板DNA 和ddH 2 O；反应条件为95℃预变性3min；30个循环的95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 1min；72℃延伸7min。
优选地，步骤S22具体包括：探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记；在探针合成中等量分配两种碱基C/T。
优选地，步骤S23具体包括：阳性内参是由质粒pUC57插入一段重组基因构成；重组基因的序列为5’-CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3’。
优选地，步骤S24具体包括：反应体系为20μL，其中包括Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM，PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl 2  1.5 mM, 10μM引物A、B各0.4μL, 0.8μL 10μM 探针C, 0.8μL 10μM 内参探针D, 0.2μL ROX dye II (Takara, version 2.0)，100ng 模板DNA和 ddH2O；反应条件为95℃预变性10min；30个循环的95℃ 5s、55℃ 30s、60℃ 20s。
本发明亦提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S31：取肉或肉产品中提取的DNA 1μL 与17μL 预混液1，2μL预混液2在冰上混合均匀；
S32：将混合好的试剂至于荧光定量PCR仪进行反应；
S33：当内参CY5荧光信号在Ct值35左右发生扩增，说明PCR体系反应良好。
优选地，步骤S32具体包括：反应条件设为：95°C 预变性10 min, 40个循环的95°C 5s、55°C 30s，最后保存于4°C。
本发明基于实时荧光定量PCR技术，设计了食品中鼠源性成分鉴定的试剂盒。提取食品中的总DNA后，应用试剂盒预混液中所包含的鼠源性成分特异引物及探针，进行PCR扩增反应，从而获得对鼠源性成分定性及定量的检测结果。经验证，该试剂盒具有良好的针对3种常见鼠肉的特异性，与其他常见肉类之间无交叉反应，检测方法的灵敏度达到1皮克/反应，且总检测时间可控制在2小时以内。本试剂盒是根据肉类掺假在我国新出现的实际情况，针对可能用于牛羊肉掺假的3种鼠科动物设计荧光定量PCR方法，同时具备对3种目标鼠肉的特异性，能够成功鉴别检测食品中鼠源性成分，是目前灵敏度最高、最快速的鼠源性成分鉴定方法，可用于食品中鼠源性成分掺假的检测和监管。
附图说明
通过下面结合附图对本发明的一个优选实施例进行的描述，本发明的技术方案及其技术效果将变得更加清楚，且更加易于理解。其中：
图1示出了本发明的第二实施例的鼠源性特异引物探针设计图。碱基序列取自于线粒体细胞色素b基因。灰色部分依次分别代表鼠源性特异正向引物、荧光探针、反向引物结合序列的位置。图中黑点表示相同的碱基，黑色方框表示不同的碱基。
图2示出了本发明的第二实施例的阳性内参结构图。阳性内参由质粒pUC57插入一段重组基因构成。重组基因两端是鼠源性正向、反向引物的结合序列，两者之间是一段133bp的随机序列。RS: 随机序列。
图3示出了本发明的第二实施例的实时荧光PCR扩增曲线。以猪、牛、羊、鸡、鸭、实验大鼠（实验用ICR大白鼠）、实验小鼠（实验用昆明种小鼠）、野生小鼠（中国家鼠）的DNA做模板进行PCR反应。反应体系中包含阳性内参，内参的CY5荧光信号在Ct值35-40之间发生扩增。实验大鼠、实验小鼠、野生小鼠在35个反应循环内均产生了显著的扩增曲线，而其他肉类DNA则没有出现特异性扩增。
具体实施方式
以下将结合所附的附图对本发明的优选实施例进行描述。
第一实施例
一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，该基于荧光定量PCR技术鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由以下试剂构成：
预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR 反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM，PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5 mM。储藏条件为4 oC，保质期半年。 
预混液2，其包含引物A 2μM, 序列为5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B 2μM， 序列为5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列荧光探针C4μM,序列为5'-FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3', 荧光探针D 4μM，序列为5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及内参核酸 0.005ng/μL。储藏条件为-20 oC，避光，保质期半年。
 
第二实施例
一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S21、提取常见鼠肉DNA并制作模板,进行扩增反应，对扩增产物进行测序。
步骤S21具体包括：从NCBI数据库中下载大鼠、小鼠的线粒体细胞色素B基因（CYTB），使用DNAMAN (LynnonBiosoft, version 8.0)比对，从而设计鼠类CYTB通用引物Seq。收集日常生活中常见的鼠肉，提取其DNA。采用CYTB通用引物Seq对所提取的鼠肉DNA进行普通PCR扩增，反应体系为25μL，其中包括12.5μL premix Taq (2X, Takara, version 2.0), 0.5μL 10μM Seq 正、反向引物, 100ng 模板DNA 和ddH2O。反应条件为95℃预变性3min；30个循环的95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 1min；72℃ 延伸7min。将扩增得到的产物用切胶回收试剂盒提取并纯化，对扩增产物进行测序，从而获得常见鼠类的线粒体CYTB基因的准确序列。
S22、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和荧光探针。
步骤S22具体包括：下载其他肉类（猪、牛、羊、鸡、鸭等）CYTB基因，应用DNAMAN序列比对软件，和测序得到的常见鼠CYTB基因进行比对，选取出鼠类特有序列，依据此设计鼠类特异的引物和荧光探针。设计时，引物的近3’端碱基和探针5’端至中间碱基是影响特异性的关键碱基，应保证关键碱基的在不同物种间的差异性。探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记。在搜集到的几种常见鼠类中，一种野生小鼠的探针结合区域包含一个不同于其他鼠类的碱基，因此在探针合成中等量分配这两种碱基C/T（Y表示此简并碱基）, 使得探针能够适用于三种老鼠。引物探针设计图参见图1，序列如下：
表1 鼠源性成分鉴定试剂盒所用引物、探针序列
Figure 142461DEST_PATH_IMAGE001
S23、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性。
步骤S23具体包括：在提取肉制品DNA过程中会有脂类、蛋白、铁离子、多糖等物质残留，这些物质可能会抑制PCR反应从而产生阴性结果。因此阳性内参被加入反应体系来防止反应的假阴性。阳性内参是由质粒pUC57插入一段重组基因构成。重组基因两端序列为鼠源性正反引物的结合序列，二者之间为一段随机序列。阳性内参可以被引物A、B扩增，减少了二重反应体系的复杂性。重组基因的序列为5’-CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3’，内参的结构参见图2。针对内参序列，设计内参特异性探针，用荧光基团CY5标记内参探针，异于鼠源性探针，使得内参的荧光信号可以区别于样品DNA。梯度稀释内参，选择合适的内参浓度使得内参的Ct值介于35至40之间而不干扰读取样品的扩增结果。
S24、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒。
步骤S24具体包括：使用猪、牛、羊、鸡、鸭等肉类作为阴性样品，鼠肉做阳性样品，分别取其DNA做模板，进行荧光定量PCR反应来检验方法的特异性。反应体系为20μL，其中包括Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM， PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5 mM, 10μM引物A、B各0.4μL, 0.8μL 10μM 探针C, 0.8μL 10μM 内参探针D, 0.2μL ROX dye II (Takara, version 2.0)，100ng 模板DNA和 ddH2O。反应条件为95℃预变性10min；30个循环的95℃ 5s、55℃ 30s、60℃ 20s。阴性样品反应均未出现特异性的扩增，而阳性样品有显著扩增，参见图3。结果表明此法检测肉及肉制品中鼠源性成分具有良好的特异性。
在验证了此法具有检测鼠源性成分特异性的基础上，我们对PCR的反应体系、条件进行了优化，以设计高灵敏度试剂盒。优化的指标包括：引物浓度、退火温度、反应循环数、延伸时间。
S25：使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。
步骤S25具体包括：取100ng阳性样品（鼠类DNA）进行梯度稀释，以不同梯度的DNA 为模板，使用本试剂盒进行PCR扩增检测。当稀释模板量达到1pg时，仍可以检测到荧光信号FAM的显著扩增，说明本试剂盒对于目标物种的检测灵敏度达到1pg/反应。同时，根据连续梯度的DNA模板量和测得的PCR扩增值，构建该试剂盒对食品中鼠源性成分定量测定的标准曲线。该曲线可以用于定量测定样品中鼠源性成分含量。
 
第三实施例
一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S31：取肉或肉产品中提取的DNA 1μL 与17μL 预混液1，2μL预混液2在冰上混合均匀。
S32：将混合好的试剂至于荧光定量PCR仪进行反应，反应条件设为：95°C 预变性10 min, 40个循环的95°C 5s、55°C 30s，最后保存于4°C。
S33：当内参CY5荧光信号在Ct值35左右发生扩增，说明PCR体系反应良好。在此基础上，FAM荧光信号在35个反应循环内产生显著扩增的视为阳性。
 
材料与试剂：
Taq酶, PH8.5的Tris-HCl，KCl，MgCl2及ROX dye II均购自宝生物工程(大连)有限公司。引物、探针及内参重组质粒均委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
仪器与设备：
PCR仪（Veritee96-well，美国ABI公司）；核酸电泳仪（SUB-cell GT，美国Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（Universal HoodⅡ，美国Bio-Rad公司）；荧光定量PCR仪（7500，美国ABI公司）。
 
本发明的有益效果：
本试剂盒鉴定鼠源性成分具有良好的特异性，灵敏度可达到1pg/反应，可成功地对肉类及其产品中的鼠源性成分进行鉴定。本试剂盒将实时PCR所需的反应试剂集成于预混液1和预混液2，简化了操作步骤，降低了人员要求。本发明是目前唯一鉴别食品中鼠源性成分的试剂盒，方法灵敏快速，在2小时内即能获得鉴定结果，可用于食品安全检测部门对肉类及其制品掺假的监管与控制，具有显著的实用价值。
本发明基于实时荧光定量PCR技术，设计了食品中鼠源性成分鉴定的试剂盒。提取食品中的总DNA后，应用试剂盒预混液中所包含的鼠源性成分特异引物及探针，进行PCR扩增反应，从而获得对鼠源性成分定性及定量的检测结果。经验证，该试剂盒具有良好的针对3种常见鼠肉的特异性，与其他常见肉类之间无交叉反应，检测方法的灵敏度达到1皮克/反应，且总检测时间可控制在2小时以内。本试剂盒是根据肉类掺假在我国新出现的实际情况，针对可能用于牛羊肉掺假的3种鼠科动物设计荧光定量PCR方法，同时具备对3种目标鼠肉的特异性，能够成功鉴别检测食品中鼠源性成分，是目前灵敏度最高、最快速的鼠源性成分鉴定方法，可用于食品中鼠源性成分掺假的检测和监管。
对于所属技术领域的技术人员而言，随着技术的发展，本发明构思可以不同方式实现。本发明的实施方式并不仅限于以上描述的实施例，而且可在权利要求的范围内进行变化。

Claims (8)

1.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，其特征在于，由以下试剂构成：
预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR 反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM， PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5 mM；储藏条件为4 oC，保质期半年； 
预混液2，其包含引物A 2μM, 序列为5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B 2μM， 序列为5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列荧光探针C4μM，序列为5'-FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3', 荧光探针D 4μM，序列为5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及内参核酸 0.005ng/μL；储藏条件为-20 oC，避光，保质期半年。
2.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S21、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序；
S22、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和荧光探针；
S23、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性；
S24、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒；
S25：使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。
3.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤S21具体包括：反应体系为25μL，其中包括12.5μL premix Taq (2X, Takara, version 2.0), 0.5μL 10μM Seq 正、反向引物, 100ng 模板DNA 和ddH2O；反应条件为95℃预变性3min；30个循环的95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 1min；72℃ 延伸7min。
4.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤S22具体包括：探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记；在探针合成中等量分配两种碱基C/T。
5.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤S23具体包括：阳性内参是由质粒pUC57插入一段重组基因构成；重组基因的序列为5’-CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3’。
6.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤S24具体包括：反应体系为20μL，其中包括Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM， PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5 mM, 10μM引物A、B各0.4μL, 0.8μL 10μM 探针C, 0.8μL 10μM 内参探针D, 0.2μL ROX dye II (Takara, version 2.0)，100ng 模板DNA和 ddH2O；反应条件为95℃预变性10min；30个循环的95℃ 5s、55℃ 30s、60℃ 20s。
7.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S31：取肉或肉产品中提取的DNA 1μL 与17μL 预混液1，2μL预混液2在冰上混合均匀；
S32：将混合好的试剂至于荧光定量PCR仪进行反应；
S33：当内参CY5荧光信号在Ct值35左右发生扩增，说明PCR体系反应良好。
8.如权利要求７所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的的检测方法，其特征在于，
步骤S32具体包括：反应条件设为：95°C 预变性10 min, 40个循环的95°C 5s、55°C 30s，最后保存于4°C。
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