CN105132569A - 鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物及其应用。该鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物由SEQ？ID？No.1-8所示的引物F2-1、引物B2-1、引物F1c-1、引物B1c-1、引物F3-1、引物B3-1、引物loopF-1和引物loopB-1这八条引物组成。本发明的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物可特异性检测鼠源成分，对牛源成分，猪源成分，羊源成分，鸡源成分，鸭源成分，犬源成分，狐狸源成分，貉子源成分，水貂源成分和驴源成分均无交叉反应。

Description

鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域中鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物及其应用。

背景技术

目前在国内生肉和肉制品的生产和销售领域，一些不法商贩为了牟取暴利，利用掺杂掺假等手段欺骗消费者的事件时有发生。因此一套快速、准确鉴别肉种类，并且能够适应混合肉制品鉴定的方法，无疑会为执法人员提供了强大的技术支撑。

传统的肉制品鉴定的方法主要是基于蛋白质水平的分析，包括电泳法、免疫法、ELISA等技术。操作过程中首先需制备相应物种的抗体，然后抗原和抗体间进行免疫反应，最后通过电泳或者显色等方法进行鉴别。这类鉴别技术受蛋白质(主要起作用的部分为抗原决定簇)结构的影响很大，实际应用中经常出现的问题包括：1.热加工过程会改变蛋白质(抗原决定簇)的结构，因而无法检测热加工的肉类；2.对混合肉类的检测可能出现交叉反应，因为不同物种蛋白质的结构可能具有某种程度的相似性，检验的灵敏程度取决于制备的抗体的特异性强弱。

环介导核酸等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可特异性检测鼠源成分的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物由引物F2-1、引物B2-1、引物F1c-1、引物B1c-1、引物F3-1、引物B3-1、引物loopF-1和引物loopB-1这八条引物组成；

所述引物F2-1是SEQIDNo.1所示的单链DNA，所述引物B2-1是SEQIDNo.2所示的单链DNA，所述引物F1c-1是SEQIDNo.3所示的单链DNA，所述引物B1c-1是SEQIDNo.4所示的单链DNA，所述引物F3-1是SEQIDNo.5所示的单链DNA，所述引物B3-1是SEQIDNo.6所示的单链DNA，所述引物loopF-1是SEQIDNo.7所示的单链DNA和所述引物loopB-1是SEQIDNo.8所示的单链DNA。

上述环介导等温扩增成套引物中，各引物的摩尔比可为4-8mol引物F2-1：4-8mol引物B2-1：4-8mol引物F1c-1：4-8mol引物B1c-1：1mol引物F3-1：1mol引物B3-1：2mol引物loopF-1：2mol引物loopB-1，如8mol引物F2-1：8mol引物B2-1：8mol引物F1c-1：8mol引物B1c-1：1mol引物F3-1：1mol引物B3-1：2mol引物loopF-1：2mol引物loopB-1。

上述环介导等温扩增成套引物中的八条引物可分别单独包装，使用前混合在一起。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增试剂或试剂盒。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增试剂或试剂盒包括甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg²⁺和上述环介导等温扩增成套引物。

上述环介导等温扩增成套引物在制备鉴定或辅助鉴定鼠源成分试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

上述环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定鼠源成分中的应用也属于本发明的保护范围。

上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定鼠源成分中的应用也属于本发明的保护范围。

上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物和上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分试剂或试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。

上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物的制备方法，包括将各条引物分别单独包装或按照所述摩尔比混合在一起的步骤。

上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分试剂或试剂盒的制备方法，均包括将各条引物分别单独包装或按照所述摩尔比混合在一起的步骤。

上述环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否掺杂鼠源成分中的应用也属于本发明的保护范围；所述待测动物组织和/或器官含有下述至少一种动物的组织和/或器官：牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂和驴。

上述环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否掺杂鼠源成分中的应用也属于本发明的保护范围；所述待测动物组织和/或器官为下述至少一种动物的组织和/或器官：牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂和驴。

本发明中，所述鼠源成分可为来自鼠的组织和/或器官和/或细胞，具体可为肌肉组织、结缔组织(如血液)、毛和/或皮。

实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物可特异性检测鼠源成分，对牛源成分，猪源成分，羊源成分，鸡源成分，鸭源成分，犬源成分，狐狸源成分，貉子源成分，水貂源成分和驴源成分均无交叉反应。本发明的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物可灵敏地检测掺杂鼠源成分的动物样品，在牛源成分和羊源成分中添加微量的鼠源成分(鼠源成分含量为0.5％)也可有效地检测出鼠源成分。

附图说明

图1为成套LAMP引物1与靶序列的匹配图。

图2为成套LAMP引物2与靶序列的匹配图。

图3为成套LAMP引物1对11种纯肉样品DNA的扩增结果。

图4为成套LAMP引物3对11种纯肉样品DNA的扩增结果。

图5为成套LAMP引物1对牛肉+5％鼠肉样品DNA、牛肉+1％鼠肉样品DNA、牛肉+0.5％鼠肉样品DNA和牛肉(纯肉)样品DNA的扩增结果。

图6为成套LAMP引物1对羊肉+5％鼠肉样品DNA、羊肉+1％鼠肉样品DNA和羊肉+0.5％鼠肉样品DNA羊肉(纯肉)样品DNA的扩增结果。

图7为成套LAMP引物2对11种纯肉样品DNA的扩增结果。

图8为成套LAMP引物4对11种纯肉样品DNA的扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的鼠肉为昆明种小白鼠肉，牛肉为黄牛肉，猪肉为东北民猪肉，羊肉为小尾寒羊肉，鸡肉为白羽鸡肉，鸭肉为北京鸭肉，狗肉为松狮犬肉，狐狸肉为蓝狐肉，貉肉为乌苏里貉肉，貂肉为美国短毛黑貂肉，驴肉为新疆驴肉。

实施例1、环介导等温扩增检测鼠源成分

一、制备鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物

比较鼠、猪、牛、羊、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂和驴的线粒体DNA序列，用软件设计LAMP引物，选出针对SEQIDNo.9的鼠特异保守序列(靶序列)的4套候选的LAMP引物，分别命名为成套LAMP引物1、成套LAMP引物2、成套LAMP引物3和成套LAMP引物4。

成套LAMP引物1(简称八引物组1)由表1中的引物F2(简称F2-1)、引物B2(简称B2-1)、引物F1c(简称F1c-1)、引物B1c(简称B1c-1)、引物F3(简称F3-1)、引物B3(简称B3-1)、引物loopF(简称loopF-1)和引物loopB(简称loopB-1)这八条引物组成，这八条引物的摩尔比为8:8:8:8:1:1:2:2。

成套LAMP引物2(简称八引物组2)由表2中的引物F2(简称F2-2)、引物B2(简称B2-2)、引物F1c(简称F1c-2)、引物B1c(简称B1c-2)、引物F3(简称F3-2)、引物B3(简称B3-2)、引物loopF(简称loopF-2)和引物loopB(简称loopB-2)这八条引物组成，这八条引物的摩尔比为8:8:8:8:1:1:2:2。

成套LAMP引物3(八引物组1的对照)由表1中的引物FIP、引物BIP、引物F3(简称F3-1)、引物B3(简称B3-1)、引物loopF(简称loopF-1)和引物loopB(简称loopB-1)这六条引物组成。这六条引物的摩尔比为8:8:1:1:2:2。

成套LAMP引物4(简称八引物组2的对照)由表2中的引物FIP、引物BIP、引物F3(简称F3-2)、引物B3(简称B3-2)、引物loopF(简称loopF-2)和引物loopB(简称loopB-2)这六条引物组成。这六条引物的摩尔比为8:8:1:1:2:2。

引物的具体序列如表1-表2。其中，成套LAMP引物1和成套LAMP引物2相比，F3、loopF、loopB和FIP这四条引物的序列不同，B3和BIP这两条引物序列相同(图1和图2)。成套LAMP引物3与成套LAMP引物1相比，用表1的FIP替换F1c和F2，用表1的BIP替换B1c和B2。

表1、成套LAMP引物1及成套LAMP引物3的相关引物信息

表2、成套LAMP引物2和成套LAMP引物4的信息

二、检测动物肌肉样品

1、检测样品的制备

实验动物分别是昆明种小白鼠，黄牛，东北民猪，小尾寒羊，白羽鸡，北京鸭，松狮犬，蓝狐，乌苏里貉，美国短毛黑貂，新疆驴。每种动物分别取10个个体，将每个个体的肌肉作为检测样品，得到11种纯肉样品。

将羊肉、牛肉和鼠肉分别于小型食品加工机中绞碎后备用。按表3所示重量比称取羊肉、牛肉和鼠肉于离心管中，制成5％、1％和0.5％的掺杂鼠肉样品，每种掺杂鼠肉样品设两次重复。

表3、掺杂鼠肉样品的鼠肉和羊肉或鼠肉和牛肉的配比

2.1样品总DNA提取

通过动物血液/细胞/组织DNA提取试剂盒，提取实验选取的11种纯肉样品DNA和表1中6种掺杂鼠肉样品DNA，操作过程详见说明书。DNA模板可以在-20℃保存数月。

2.3DNA含量测定

总DNA通过Nanodrop2000全波长紫外/可见光扫描分光光度计进行含量测定。

2.4LAMP反应体系

成套LAMP引物1和成套LAMP引物2采用如下25μLLAMP反应体系进行。25μLLAMP反应体系的组成及浓度均如下：20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH₄)SO₄，0.1％TritonX-100，0.8M甜菜碱，8mMMgSO₄，1.4mMdNTP，8UBst聚合酶，1μl10×荧光染料SYBgreen(广州迪澳生物科技有限公司恒温扩增反应液R105)20pmolF2，20pmolB2，20pmolF1c，20pmolB1c，5pmolLoopB，5pmolLoopF，2.5pmolF3，2.5pmolB3，1ngDNA，用灭菌超纯水补充体积至25μL。反应温度为63℃，反应时间为60min。

成套LAMP引物3和成套LAMP引物4的25μLLAMP反应体系的组成及浓度均如下：20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH₄)SO₄，0.1％TritonX-100，0.8M甜菜碱，8mMMgSO₄，1.4mMdNTP，8UBst聚合酶，1μl10×荧光染料SYBgreen(广州迪澳生物科技有限公司恒温扩增反应液R105)20pmolFIP，20pmolBIP，5pmolLoopB，5pmolLoopF，2.5pmolF3，2.5pmolB3，1ngDNA，用灭菌超纯水补充体积至25μL。反应温度为63℃，反应时间为60min。

2.5LAMP反应产物检测

利用荧光染料SYBgreen与DNA双链结合时发出荧光，采用迪奥LA-320C对反应在650nm处产生的荧光进行实时监测，收集电信号并每隔45s进行一次采集，通过形成S型曲线判断是否出现指数扩增。

实验时间:60min；温度:63.0℃；扫描间隔:30s；阈值设置:时间区域：3-6min阈值：基值+10×SD。

成套LAMP引物1-4对步骤2.1的11种生肉样品DNA进行LAMP的检测结果表明成套LAMP引物1-4中，只有成套LAMP引物1对鼠具有特异性，只对鼠肉得到了S型曲线，出现了指数扩增，对阴性对照(超纯水)和其它10种动物肌肉均没有得到S型曲线(图3和表4)；成套LAMP引物2对鼠不具有特异性，对鼠肉、阴性对照(超纯水)、貉子和狐狸均得到了S型曲线，出现了指数扩增(表5和图7)；成套LAMP引物3对鼠不具有特异性，对鼠肉、阴性对照(超纯水)、猪、牛、羊、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂肉均得到了S型曲线，出现了指数扩增(图4和表6)；成套LAMP引物4对鼠不具有特异性，对鼠肉、阴性对照(超纯水)、狐狸、貉子和貂肉均得到了S型曲线，出现了指数扩增(图8和表7)。

表4、成套LAMP引物1的扩增结果

通道

A1

A2

A3

A4

A5

A6

样品名

阴性对照

鼠肉

猪肉

牛肉

羊肉

鸡肉

Tt

/

22.5min

/

/

/

/

通道

A7

A8

B1

B2

B3

B4

样品名

鸭肉

狗肉

狐狸肉

貉子肉

貂肉

驴肉

Tt

/

/

/

/

/

/

表5、成套LAMP引物2的扩增结果

通道

A1

A2

A3

A4

A5

A6

样品名

阴性对照

鼠肉

猪肉

牛肉

羊肉

鸡肉

Tt

41min

16min

/

/

/

/

通道

A7

A8

B1

B2

B3

B4

样品名

鸭肉

狗肉

狐狸肉

貉子肉

貂肉

驴肉

Tt

/

/

17min

13min

/

/

表6、成套LAMP引物3的扩增结果

通道

A1

A2

A3

A4

A5

A6

样品名

阴性对照

鼠肉

猪肉

牛肉

羊肉

鸡肉

Tt

15min

10.3min

12.3min

10.3min

11.3min

17.3min

通道

A7

A8

B1

B2

B3

B4

样品名

鸭肉

狗肉

狐狸肉

貉子肉

貂肉

驴肉

Tt

20.3min

12min

15min

22min

12min

/

表7、成套LAMP引物4的扩增结果

通道

A1

A2

A3

A4

A5

A6

样品名

阴性对照

鼠肉

猪肉

牛肉

羊肉

鸡肉

Tt

15min

9min

/

/

/

/

通道

A7

A8

B1

B2

B3

B4

样品名

鸭肉

狗肉

狐狸肉

貉子肉

貂肉

驴肉

Tt

/

/

13min

14min

13min

/

表4-7中Tt为开始出现指数扩增的时间、“/”表示没有得到S型曲线，没有出现指数扩增。

用成套LAMP引物1对步骤2.1的6种掺杂鼠肉样品DNA、牛肉DNA、羊肉DNA进行LAMP，检测结果表明成套LAMP引物1对牛肉+5％鼠肉样品DNA、牛肉+1％鼠肉样品DNA、牛肉+0.5％鼠肉样品DNA、羊肉+5％鼠肉样品DNA、羊肉+1％鼠肉样品DNA和羊肉+0.5％鼠肉样品DNA得到了S型曲线，出现了指数扩增，牛肉(纯肉)样品DNA和羊肉(纯肉)样品DNA均未得到S型曲线，均未出现指数扩增(图5和图6)。图5和图6中，阴性为阴性对照(超纯水)，牛为牛肉样品DNA，羊为羊肉样品DNA。图5中，阳性为鼠肉，5％、1％和0.50％分别表示牛肉+5％鼠肉样品DNA、牛肉+1％鼠肉样品DNA、牛肉+0.5％鼠肉样品DNA。图6中，阳性为鼠肉，5％、1％和0.50％分别表示羊肉+5％鼠肉样品DNA、羊肉+1％鼠肉样品DNA、羊肉+0.5％鼠肉样品DNA。

Claims (10)

1.鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物，其特征在于：所述环介导等温扩增成套引物由引物F2-1、引物B2-1、引物F1c-1、引物B1c-1、引物F3-1、引物B3-1、引物loopF-1和引物loopB-1这八条引物组成；

所述引物F2-1是SEQIDNo.1所示的单链DNA，所述引物B2-1是SEQIDNo.2所示的单链DNA，所述引物F1c-1是SEQIDNo.3所示的单链DNA，所述引物B1c-1是SEQIDNo.4所示的单链DNA，所述引物F3-1是SEQIDNo.5所示的单链DNA，所述引物B3-1是SEQIDNo.6所示的单链DNA，所述引物loopF-1是SEQIDNo.7所示的单链DNA和所述引物loopB-1是SEQIDNo.8所示的单链DNA。

2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述环介导等温扩增成套引物中，各引物的摩尔比为4-8mol引物F2-1：4-8mol引物B2-1：4-8mol引物F1c-1：4-8mol引物B1c-1：1mol引物F3-1：1mol引物B3-1：2mol引物loopF-1：2mol引物loopB-1。

3.鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg²⁺和权利要求1或2所述的环介导等温扩增成套引物。

4.权利要求1或2所述的环介导等温扩增成套引物在制备鉴定或辅助鉴定鼠源成分试剂或试剂盒中的应用。

5.权利要求1或2所述的环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定鼠源成分中的应用。

6.权利要求3所述的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定鼠源成分中的应用。

7.权利要求1或2所述环介导等温扩增成套引物的制备方法，均包括将各条引物分别单独包装或按照所述摩尔比混合在一起的步骤。

8.权利要求3所述的试剂或试剂盒的制备方法，均包括将各条引物分别单独包装或按照所述摩尔比混合在一起的步骤。

9.权利要求1或2所述的环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否掺杂鼠源成分中的应用；所述待测动物组织和/或器官含有下述至少一种动物的组织和/或器官：牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂和驴。

10.权利要求1或2所述的环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否掺杂鼠源成分中的应用；所述待测动物组织和/或器官为下述至少一种动物的组织和/或器官：牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂和驴。