CN107586853A

CN107586853A - 基于rpa技术检测牛源性成分的引物、探针、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN107586853A
Application number: CN201710819152.8A
Authority: CN
Inventors: 喻勇新; 荣国光; 刘永军; 顾俊; 秦海棠; 李�禾; 兰蓓蓓
Original assignee: Suzhou Boerda Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Boerda Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2018-01-16

Abstract

本发明公开了一种基于RPA技术检测牛源性成分的引物和探针组合，其正向引物如SEQ ID No.1所示，反向引物如SEQ ID No.2所示，探针如SEQ ID No.3所示。本发明还公开了基于RPA技术检测牛源性成分的试剂盒及其应用。采用本发明的引物和探针进行RPA检测牛源性成分，具有灵敏度高、特异性强及检测时间短的特点，方便快捷，应用前景广泛。

Description

基于RPA技术检测牛源性成分的引物、探针、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于RPA技术检测牛源性成分的引物、探针、试剂盒及其应用。

背景技术

肉及肉制品的掺假现象随着经济快速的增长已成为全球重点关注的对象，该问题的发生不仅侵害消费者利益，也影响消费者对商家的信任度。

目前检测动物源性成分的技术种类多而复杂，其中基于核酸的分子生物学技术手段主要有实时荧光定量PCR法(qPCR)和环介导等温扩增法(LAMP)。

实时荧光定量PCR通过荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算出待测样品模板的初始浓度。检测方法是用一对物种保守区域的特异性引物，配以FQ-Buffer、耐热DNA聚合酶、四种核苷酸等成分，通过qPCR仪进行体外扩增。然而，常规的PCR过程须经过不同温度环节，变性、退火以及延伸；且PCR反应需要2个小时左右才能完成，耗时长，不适于对样品进行快速检测。

LAMP法的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计两对不同的引物，然后再利用链置换反应在一定温度下进行扩增反应。该反应需要将基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下(60℃～65℃)，经一个步骤完成。然而，LAMP法检测所需引物多且设计过程复杂；反应温度较高，反应时间需60分钟左右才能完成；并且易形成假阳性结果等。

RPA技术是近年来开发的核酸扩增技术，由于其反应对温度无特别要求、而且反应简单快速，即37℃～42℃条件下，15～20分钟内即可快速检测待测目标的动物源性核酸成分。目前已有文献公开了采用RPA技术检测动物源性核酸成分，如专利文献CN201710379517.X公开了一种检测猪源性成分的RPA引物、试剂盒及检测方法；专利文献CN201710378244.7公开了一种检测鸭源性成分的RPA引物、试剂盒及检测方法，但是上述公开的文献采用的是RPA-basic方法，其缺陷是反应扩增结束后，还需要通过琼脂糖凝胶电泳步骤才能得到检测结果，因此整个流程耗时长。RPA-exo技术与RPA-basic相比，在扩增反应体系中添加了特异性的荧光探针，探针的加入既增强了反应的特异性，也实现了对反应过程的实时监控。

综上所述，基于RPA-exo技术的关键点是引物和探针的设计。在RPA-exo扩增反应中，可通过对荧光信号的实时采集实现对反应过程的实时监控，反应结束即可通过生成的扩增曲线图对结果进行判断，无琼脂糖凝胶电泳的步骤，整个流程简单，耗时短。因此本发明提出一种基于RPA-exo方法快速检测肉及肉制品中牛肉成分的引物、探针具有重要的意义。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出基于RPA技术检测牛源性成分的引物、探针，实现对牛源性成分的快速、灵敏和特异性的检测。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种基于RPA技术检测牛源性成分的引物和探针组合，包括正向引物、反向引物和探针，其中，正向引物如SEQ ID No.1所示，反向引物如SEQ ID No.2所示，探针如SEQ IDNo.3所示。

本发明的另一个目的是提出基于RPA技术检测牛源性成分的试剂盒，检测方便快捷，应用前景广泛。

一种基于RPA技术检测牛源性成分的试剂盒，包括含有上述的引物和探针组合的RPA-牛源性成分核酸检测试剂。

优选地，上述RPA-牛源性成分核酸检测试剂还包括酶混合液、ddH₂O、再水化缓冲液。

优选地，上述酶混合液包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶。

上述试剂盒还包括280mM醋酸镁溶液和作为阳性对照的模板DNA。

本发明的第三个目的是提出基于RPA技术检测牛源性成分的应用，灵敏度高、特异性强，检测时间短，操作简单，方便快捷，应用前景广泛。

一种利用上述的试剂盒在基于RPA技术检测牛源性成分中的应用。

一种基于RPA技术检测牛源性成分的方法，包括如下步骤：提取待测样品的DNA作为模板，根据含有权利要求1所述的引物和探针的RPA扩增体系，进行RPA扩增反应及实时荧光检测，如得到明显的扩增曲线，则证明所检测样本中含有牛肉成分。

优选地，上述RPA扩增体系为：总体系10μL，包含再水化缓冲液5.9μL，10μM的正向引物0.42μL，10μM的反向引物0.42μL，10μM的探针0.12μL，50～200ng/μL模板DNA 0.5μL，ddH₂O0.14μL，280mM的醋酸镁溶液0.5μL，酶混合液2μL。

优选地，上述RPA扩增反应为温度37℃～42℃，反应15～20分钟。

优选地，上述RPA扩增反应在实时荧光检测仪中进行。

与现有技术相比，本发明提供的一种基于RPA技术检测牛源性成分的引物、探针、试剂盒及其应用，达到的技术效果是：1)相对于qPCR技术，本发明具有如下优点：a.在39℃即可进行RPA扩增反应，甚至人体体温即可提供RPA扩增反应所需要的温度环境，其最适温度在37℃～42℃，且整个扩增反应过程均是等温，而常规PCR扩增反应必须经过不同温度的设置；b.检测时间短：整个检测过程在15分钟左右即可完成，且无需变性，不仅大大缩短了检测反应时间，也无需与PCR仪类似的专门温控设备，从而实现了便携式快速核酸检测；c.RPA技术在缩短反应时间的同时也保持了高特异性和高灵敏性的特点；

2)相对于LAMP法，本发明具有如下优点：a.两者同为等温扩增反应，RPA反应在37℃～42℃即可进行RPA扩增反应，甚至在人体体温即可提供反应所需要的温度环境，而LAMP法的温度要求60℃～65℃，温度要求较高；b.RPA反应只需设计一对引物以及一个荧光探针，在保证反应灵敏度的同时，也保证了反应的特异性，而LAMP反应需要设计两对引物，引物设计起来较复杂；

3)本发明检测肉及肉制品中的牛源性成分，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短及操作简单等特点，方便快捷，应用前景广泛。

以下便结合实施例及附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

图1是实施例1中本发明RPA扩增原理示意图；

图2是实施例1中本发明荧光探针工作原理示意图；

图3是实施例4中验证本发明设计的引物与探针的特异性图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。

实施例1RPA引物、探针的设计与筛选

RPA扩增原理如图1所示：在RPA反应中，需要三种酶的参与，分别是重组酶、单链结合蛋白以及DNA聚合酶。在RPA扩增时，重组酶首先与上下游引物结合，寻找同源的双链DNA，一旦定位，发生链交换，单链结合蛋白与亲本链绑定，阻止其与脱离的模板链发生相互作用；接着，DNA聚合酶从上下游引物的3′端启动模板合成，形成两条双链DNA，如此循环往复进而实现扩增。

荧光探针工作原理如图2所示：RPA扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；RPA扩增时，exo核酸酶的内切酶活性将探针上的四氢呋喃(THF)位点切割，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与RPA产物形成完全同步。

为实现RPA检测的特异性需要寻找到牛区别于其他物种的特异性的DNA序列，设计出特异性扩增引物对，同时设计出能够与扩增产物特异性结合的荧光探针。

本发明经过前期大量文献查阅，首先根据查阅文献中所显示的qPCR或LAMP技术中检测牛源性成分设计的引物，再选定特异性的检测基因，并设计本发明的引物以及探针，最后对设计的引物、探针进行RPA-exo实验，鉴定其反应的特异性、灵敏度。

本发明最终得到的检测牛源性成分的引物及探针如表1所示：正向引物序列如SEQID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示探针序列如SEQ ID No.3所示。

表1基于RPA技术检测牛源性成分的引物和探针序列

其中探针序列中的荧光报告基团、荧光淬灭基团、四氢呋喃位点的位置具体如下：GTA CCC TTT CTT CGA GAG(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)CAG AGT GGA CAA CAA GGA GAG AACTGT(phosphate)；

其中，FAM：发光基团；THF：四氢呋喃位点；BHQ1：淬灭基团；phosphate：磷酸基团。

实施例2基于RPA技术检测牛源性成分的试剂盒

本发明的试剂盒包括RPA-牛源性成分核酸检测试剂、280mM醋酸镁溶液、牛标准质粒(阳性对照)；其中RPA-牛源性成分核酸检测试剂包括正向引物、反向引物、探针、ddH₂O、酶混合液(重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶)、再水化缓冲液。

实施例3核酸扩增

RPA扩增体系组成为：总体系10μL，包含RPA-牛源性成分核酸检测试剂9μL，280mM的醋酸镁溶液0.5μL，50～200ng/μL模板DNA 0.5μL；

其中，9μL RPA-牛源性成分核酸检测试剂包含：再水化缓冲液5.9μL，10μM的正向引物0.42μL，10μM的反向引物0.42μL，10μM的探针0.12μL，酶混合液2μL，ddH₂O0.14μL；

上述酶混合液包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶等。

RPA扩增程序为：温度39℃，反应15分钟。

所述RPA扩增反应在荧光检测仪中进行。

实施例4验证设计的引物与探针的特异性

1.试剂与仪器

RPA-牛源性成分核酸检测试剂、280mM的醋酸镁溶液、牛的标准质粒(作为阳性对照)。其中RPA-牛源性成分核酸检测试剂含有酶混合液(重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶)、正向引物、反向引物、探针、再水化缓冲液。

其中，引物对和探针的序列如下：

其中，FAM：发光基团；THF：四氢呋喃位点；BHQ1：淬灭基团；phosphate：磷酸基团；

RNase-free Water(北京全式金生物技术有限公司)；BDA6荧光检测仪；移液器；涡旋振荡仪；酶混合液购自TwistDX公司，名称为核心反应混合物(core reaction mix)；

2、样品

该样品为苏州博尔达生物科技有限公司实验室保存的采用柱提法分别提取鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、马、狐狸、老鼠的DNA。

3、实验方法

3.1样品制备

分别取鹅、鸡、鸭、猪、羊、马、狐狸、老鼠的DNA10μL于一个已灭菌的1.5mL离心管中，涡旋混匀，获得DNA混合液，命名为牛M；

取牛的DNA10μL于一个已灭菌的1.5mL离心管中，涡旋混匀，获得目标样品核酸提取物，命名为牛DNA提取物。

3.2操作步骤

设为四组，分别为：a.阴性对照组：取9μL RPA-牛源性成分核酸检测试剂，分别依次加入0.5μLddH₂O、0.5μL醋酸镁溶液(280mM)，经离心5秒-振荡10秒-离心5秒，得阴性对照组；

b.阳性对照组：取9μL RPA-牛源性成分核酸检测试剂，分别依次加入0.5μL牛标准质粒、0.5μL醋酸镁溶液(280mM)，经离心5秒-振荡10秒-离心5秒，得阳性对照组；

c.牛DNA提取物组：取9μL RPA-牛源性成分核酸检测试剂，分别依次加入0.5μL牛DNA提取物(86ng/μL)、0.5μL醋酸镁溶液(280mM)，经离心5秒-振荡10秒-离心5秒，牛DNA提取物组；

d.牛M组：取9μL RPA-牛源性成分核酸检测试剂，分别依次加入0.5μL牛M、0.5μL醋酸镁溶液(280mM)，经离心5秒-振荡10秒-离心5秒，得牛M组；

将上述四组反应管放入荧光检测仪中进行扩增反应，反应时间15分钟、反应温度39℃，同时实时观察反应的扩增曲线进行结果判断，如得到明显的扩增曲线，则证明所检测样本中含有牛肉成分。

4、实验结果

利用本发明设计的牛特异性正向引物和反向引物，对阴性对照、阳性对照、牛DNA提取物、牛M进行RPA扩增和实时荧光检测，能够快速准确地鉴定出牛肉成分。其中，在阳性对照和牛肉提取物DNA中有明显的扩增曲线，而阴性对照和牛M中均没有扩增曲线，检测结果如图3所示。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 苏州博尔达生物科技有限公司

<120> 基于RPA技术检测牛源性成分的引物、探针、试剂盒及其应用

<130> 2017

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acccgaacgg aagcggaggg aggtcatgca ga 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcaggcat ggttcttgca aagacaaagt tg 32

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaccctttc ttcgagagca gagtggacaa caaggagaga actgt 45

Claims

1.一种基于RPA技术检测牛源性成分的引物和探针组合，包括正向引物、反向引物和探针，其特征在于，所述正向引物如SEQ ID No.1所示，所述反向引物如SEQ ID No.2所示，所述探针如SEQ ID No.3所示。

2.一种基于RPA技术检测牛源性成分的试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求1所述的引物和探针组合的RPA-牛源性成分核酸检测试剂。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-牛源性成分核酸检测试剂还包括酶混合液、ddH₂O、再水化缓冲液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括280mM醋酸镁溶液和作为阳性对照的模板DNA。

6.一种利用权利要求2-5任一项所述的试剂盒在基于RPA技术检测牛源性成分中的应用。

7.一种基于RPA技术检测牛源性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测样品的DNA作为模板，根据含有权利要求1所述的引物和探针的RPA扩增体系，进行RPA扩增反应及实时荧光检测，如得到明显的扩增曲线，则证明所检测样本中含有牛肉成分。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增体系为：总体系10μL，包含再水化缓冲液5.9μL，10μM的正向引物0.42μL，10μM的反向引物0.42μL，10μM的探针0.12μL，50～200ng/μL模板DNA 0.5μL，ddH₂O 0.14μL，280mM的醋酸镁溶液0.5μL，酶混合液2μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增反应为温度37℃～42℃，反应15～20分钟。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增反应在实时荧光检测仪中进行。