CN111139302B

CN111139302B - 牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法及检测试纸条

Info

Publication number: CN111139302B
Application number: CN202010004478.7A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 付明; 周翔; 张庆德; 张全旺
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-01-03
Filing date: 2020-01-03
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2040-01-03
Also published as: CN111139302A

Abstract

本发明提供了一种牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法及试剂盒，属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒提供了牛、鸭特异性RPA标记引物和探针组合，其序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3和SEQ ID No.4～SEQ ID No.6所示。本发明试剂盒还提供了一种检测试纸条，可针对RPA扩增产物进行多重检测。采用本发明的RPA引物探针组合分别扩增样品DNA，通过试纸条对扩增产物进行检测，可判定样品中是否含有牛、鸭源性成分。本发明建立的检测方法灵敏度高，特异性强，无需特殊设备，且反应时间仅需30min。本发明为牛源性、鸭源性成分的检测提供了有效、精准、可靠的手段，具有简便、快速、特异性强的特点，且适用于现场检测。

Description

牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法及检测试纸条

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一种牛源性、鸭源性成分现场快速检测试纸条。

背景技术

随着人民生活水平的逐步提高，人们对肉品的消费量日益增加，肉类价格差异也逐步拉大，低价肉冒充高价肉的现象越来越常见。目前，国内外市场上在牛肉制品的生产与销售中，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者的事件屡屡出现。其中，用低廉的鸭肉伪造牛肉是目前主要的掺假手段。这种掺假行为不仅涉及营养价值和食品安全等问题，还会严重侵犯消费者合法权益。因此肉制品来源的安全性成为消费者关心的焦点问题之一，而对肉制品的来源进行鉴定并建立快速简便的检测方法就显得尤为重要。

现有技术中对于动物源性成分的鉴定主要采用的是基于DNA的核酸检测法，其中运用最为广泛的是常规PCR检测技术，但是PCR检测技术需要依赖精密的仪器和繁琐的实验程序，基层实验室及商场质量检测部门难以使用，并且该方法需要专业人员来操作，从而限制了该技术的广泛应用，使之难以实现大规模普及推广，难以达到现场检测的要求。

近年来，核酸恒温扩增技术得到了快速发展，与传统PCR相比，核酸等温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便、快速、灵敏等优点。重组酶聚合酶介导等温扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板DNA动态解链，同时在重组酶介导下引物与模板正确配对形成复合体，然后DNA聚合酶延伸引物生成新的DNA链。其最大的特点是不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，只需在39℃恒温反应30分钟即可完成对模板核酸的扩增。

由于RPA方法与传统PCR方法有着极大的差异，其对引物和探针有更高的要求，是影响RPA方法的关键，不同的引物直接影响扩增速度和检测灵敏度，从而影响现场检测，并且目前没有专门的RPA引物设计软件。因此，RPA的引物设计难度较大。到目前为止，尚没有针对牛源性、鸭源性成分现场快速检测方面的产品。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供牛源性、鸭源性成分现场快速检测试纸条，利用生物素和FITC分别标记RPA下游引物和探针的5’端，通过试纸条检测能快速鉴别源性成分，具有高度专一性，灵敏度高，检测速度快等特点，并且结果可通过肉眼判读，非常适用于现场检测。

为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行牛和鸭基因组特异DNA序列的筛选。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA序列，并在RPA反应体系中引入一条探针，长约 50个碱基，在其5’端标记FITC，探针的中间设计一个脱碱基位点，大肠杆菌核酸外切酶nfo可以识别该位点并切开磷酸二酯键，产生自由的羟基端，DNA 聚合酶便可在此进行延伸，并且RPA反向引物的5’端标记生物素，最终得到双标记扩增产物。本发明还专门设计组装了针对双标记核酸扩增产物进行检测的试纸条，试纸条的金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，检测线吸附有生物素抗体，质控线吸附有抗金标抗体的二抗。

本发明还提供如下技术方案：

一种牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法的RPA引物及探针组合；

对牛基因组特异DNA序列扩增的RPA引物和探针组合，具体为：

BOV-F：5’-CAGACAAAGGTCAGGAAGTAATCCCAGCGCT-3’

BOV-R：5’Biotin-ATTCCTCCAGCCCCCCAGCCGTATTCC-3’

BOV-P：5’FITC-CTTGCCCCAAGATGTGGCCTCCAGTTCCCTG-dSpacer(TH F)-CAAGACTGTAGCCC-3’C3 Spacer；

对鸭基因组特异DNA序列扩增的RPA引物和探针组合，具体为：

ANA-F：5’-CCCCAAAGTGTCAACGATTGCCCCGAAACC-3’

ANA-R：5’Biotin-ACGCCCTCATCTCCAAAATCTACCCCAGCC-3’

ANA-P:5’FITC-GCCGTCAAAGTCCCCCAAAACACCCTGAAAC-dSpacer(T HF)-CCCCCAAACCACCGA-3’C3 Spacer

在设计上本发明引物和探针均带上分子标记，以便进行下一步试纸条检测。上述两组引物和探针皆经本发明反复筛选得到。因此，本发明进一步提供所述牛特异性RPA标记引物和探针组合和所述鸭特异性RPA标记引物和探针组合的检测试剂。

进一步，本发明提供一种含有所述牛特异性RPA标记引物和探针组合或所述鸭特异性RPA标记引物和探针组合或包含前述两者的所述检测试剂的检测试剂盒。

进一步，本发明提供一种针对RPA核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，其包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，所述检测线吸附有生物素抗体，所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗。上述检测试剂盒进一步包括所述检测试纸条。

一种牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法，包括以下步骤：

1)提取样品基因组DNA；

2)RPA扩增：

以待测样品的DNA作为模板，将所述的牛、鸭RPA标记引物和探针组合分别加入两管，均可在同一仪器，同一反应条件下进行RPA扩增；

3)扩增产物检测：

将划有生物素抗体及异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的核酸检测试纸条分别插入步骤2)的扩增产物中，侧向层析5～10分钟，根据显色条带进行判定：若试纸条在检测线和质控线处都有紫色条带，则表示待测样品中含有对应源性成分，若仅在质控线处有紫色条带，则表示待测样品中不含有对应源性成分，若检测线和质控线处均无紫色条带，则表示无扩增产物或试纸条无效。

进一步，所述的RPA反应体系中，DNA模板的终浓度为0.5～2ng/μL，正向引物、反向引物的终浓度各为0.3～0.6μmol/L。

优选地，所述RPA反应体系总体积为50μL，其中，浓度为10μmol/L的正向引物加入2.1μL、反向标记引物各加入2.1μL，浓度为10μmol/L的探针加入 0.6μL，浓度为50ng/μL的DNA模板加入2μL，RPA反应缓冲液29.5μL，ddH₂O 补足至50μL。

进一步，步骤2)中，所述RPA扩增反应程序为：恒温37-42℃，30～40分钟。

优选地，所述步骤2)中，RPA扩增反应程序为：恒温39℃反应30分钟。

本发明利用重组酶聚合酶介导的等温扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)实现牛源性、鸭源性成分现场快速检测，根据物种特异DNA 序列，设计了大量的RPA特异性引物和探针组合，从中筛选出一组RPA引物和探针，再利用生物素和FITC分别标记下游引物和探针的5’端后进行RPA扩增反应，扩增产物经试纸条检测，FITC标记的扩增产物与抗FITC抗体的金标物结合后形成免疫复合物，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素抗体捕获，形成具有颜色的检测线。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被抗金标抗体二抗所捕获，形成具有颜色的质控线。该方法特异性好，检测时间短，结果可肉眼判读，在动物种源源性成分鉴定现场检测中具有广泛应用前景。本发明提供了一种牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法。本发明的方法可以在动物源性成分检测中作为标准检测方法使用。本发明检测方法具有简便、快速、特异性强的特点，且十分适用于现场检测。

附图说明

图1是针对牛、鸭设计的多条引物和探针进行引物探针筛选。分别以牛、鸭基因组DNA为阳性对照和以非牛、鸭属动物的基因组混合DNA为阴性对照进行扩增，其中P代表阳性对照，N代表阴性对照。结果表明两个物种只在F+R1+P1 引物探针组合情况下表现出特异性，而其他引物组合出现假阳性结果。

图2A是利用SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 3核酸序列在牛中具备特异性的检测结果。分别以空白对照水、阳性对照牛基因组DNA和阴性对照非牛属动物(羊、猪、鸡、鸭)的基因组混合DNA为模板进行扩增。其中C代表空白对照，P代表阳性对照，N代表阴性对照，结果表明只在阳性对照T线处出现紫色条带，特异性好。

图2B是利用SEQ ID NO 4～SEQ ID NO 6核酸序列在鸭中具备特异性的检测结果。分别以空白对照水、阳性对照鸭基因组DNA和阴性对照非鸭属动物(羊、猪、鸡、牛)的基因组混合DNA为模板进行扩增。其中C代表空白对照，P代表阳性对照，N代表阴性对照，结果表明只在阳性对照T线处出现紫色条带，特异性好。

图3是利用SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 3核酸序列在牛中进行灵敏度检测。分别以100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0ng(编号为1、2、3、4、5、6)的牛DNA为模板进行扩增。当模板质量为0.1ng时依旧能在试纸条T线处出现紫色条带，说明灵敏度高。

图4是利用SEQ ID NO 4～SEQ ID NO 6核酸序列在鸭中进行灵敏度检测。分别以100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0ng(编号为1、2、3、4、5、6)的鸭DNA为模板进行扩增。当模板质量为0.1ng时依旧能在试纸条T线处出现紫色条带，说明灵敏度高。

图5是分别将质量分数为50％、25％、5％的鸭DNA掺入牛DNA中作为混合模板，在同一反应条件下进行RPA扩增，扩增产物经试纸条检测。结果发现所有样品均能检出牛、鸭源性成分，说明本发明提供的方法可以有效对牛、鸭源性成分分别或者同时进行鉴别。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。实施例1样品中源性成分特异性检测

以牛肉制品和鸭肉制品作为对象，提取DNA后分别进行RPA扩增反应，并利用试纸条进行检测。

1.试样的制备与保存

1.1取样

采集牛肉制品和鸭肉制品试样各1g，于-20℃下保存备用。

1.2DNA模板制备

DNA模板制备采用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版社,1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法，这些方法都是报道的常用方法。

2.引物和探针设计

针对牛、鸭特异DNA序列设计特异性RPA引物和探针，在RPA引物探针设计时本发明考虑到以下几个要点：(1)引物长度的选择，RPA引物的长度一般为30至35个核苷酸；探针长度为50个碱基，并在其5’端标记FITC，探针的中间设计一个脱碱基位点(2)引物探针GC含量在40％～60％之间，碱基随机分布，5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤；(3)引物探针设计时尽量避免容易形成二级结构、引物-探针互作、发夹结构的序列，减少二聚体的形成。其中探针的设计最为困难，因其序列较长容易与引物发生互作导致假阳性结果，非常不好设计。

本发明设计合成了若干引物和探针，本例中经过筛选的引物和探针序列如表 2所示，其中引物探针设计了多条，经过筛选最终选取的引物探针序列如序列表 SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 6所示。

表2本发明设计的RPA扩增引物和探针

3.恒温扩增

3.1试样RPA扩增反应

将表2中引物和探针利用RPA试剂盒进行RPA等温扩增，RPA反应体系总体积为50μL，其中，浓度为10μmol/L的上游引物加入2.1μL、下游标记引物各加入2.1μL，浓度为10μmol/L的探针加入0.6μL，浓度为50ng/μL的DNA 模板加入2μL，RPA反应缓冲液29.5μL，ddH₂O补足至50μL。

RPA扩增反应程序为：恒温反应39℃，30min。

3.2对照RPA扩增反应

3.2.1在试样RPA扩增反应的同时，设置阴性对照、阳性对照及空白对照。各对照RPA扩增反应体系中，除模板外其余组分及RPA反应条件与3.1相同，且阴性、阳性对照DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。

3.2.2分别以非牛动物(羊、猪、鸡、鸭)和非鸭动物(牛、羊、猪、鸡)的基因组混合DNA模板作为牛、鸭RPA各自反应体系的阴性对照模板。

3.2.3分别以牛、鸭基因组DNA作为牛、鸭各自RPA反应体系的阳性对照模板。

3.2.4以双蒸水作为RPA反应体系的空白对照模板。

4.产物检测

将步骤3的产物加入到检测试纸条上，2-5分钟内，显示结果。

5.结果分析与表述

在引物探针筛选中，BOV-F、BOV-R1、BOV-P1和ANA-F、ANA-R1、ANA-P1 引物探针组合表现最好，只在阳性P样品中有条带，而在阴性对照N中无条带出现，并且无假阳性结果出现，如图1所示。筛选好的引物探针特异性结果如图 2所示。图2A和图2B结果表明只在牛、鸭阳性对照T线处出现紫色条带，特异性好。

实施例2灵敏度试验

分别以0.01ng、0.1ng、1ng、10ng、100ng的牛、鸭DNA为模板，按照实施例1的条件，进行扩增。结果如图3和图4所示。图3是以牛DNA为模板，利用SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 3为引物及探针进行检测，当模板质量为0.1ng 时依旧能在试纸条T线处出现紫色条带，图4是鸭DNA为模板，利用SEQ ID NO 4～SEQ ID NO 6为引物及探针进行检测，当模板质量为0.1ng时依旧能在试纸条 T线处出现紫色条带说明灵敏度高。

实施例3牛鸭混合样品检测

分别将质量分数为50％、25％、5％的鸭DNA掺入牛DNA中作为混合模板，按照实施1的条件，进行扩增，扩增产物通过试纸条进行检测。结果如图5 所示。针对所有的混合样品均能检出牛、鸭源性成分。

实施例4试纸条

本发明提供一种针对RPA核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，其包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体。所述金标抗体的包被浓度为(1mg/L)和包被量为(1μL)；所述检测线吸附有生物素抗体，其包被浓度为(1mg/L)和包被量(1μL)；所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗，其包被浓度为(1mg/L)和包被量为(1μL)。

序列表说明：

SEQ ID NO.1是本发明牛RPA上游引物序列。

SEQ ID NO.2是本发明牛RPA下游标记引物序列。

SEQ ID NO.3是本发明牛RPA标记探针序列。

SEQ ID NO.4是本发明鸭RPA上游引物序列。

SEQ ID NO.5是本发明鸭RPA下游标记引物序列。

SEQ ID NO.6是本发明鸭RPA标记探针序列。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法及检测试纸条

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagacaaagg tcaggaagta atcccagcgc t 31

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attcctccag ccccccagcc gtattcc 27

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttgccccaa gatgtggcct ccagttccct gcaagactgt agccc 45

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccccaaagtg tcaacgattg ccccgaaacc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgccctcat ctccaaaatc taccccagcc 30

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccgtcaaag tcccccaaaa caccctgaaa ccccccaaac caccga 46

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agatgaggga agagcaggtc tgggagttgg tg 32

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agttccctgt caagactgta gccctactag ggctgcagtc tggcc 45

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcaagatgc aggccatgca caggtcgggc 30

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acaccccaaa atgtcatcga tcaccctgag acatcatcaa acgccc 46

Claims

1.牛特异性RPA标记引物和探针组合，其特征在于，所述RPA标记引物序列如SEQ IDNo.1和2所示，所述探针序列如SEQ ID No.3所示，其中SEQ ID No.2所示的RPA反向引物5’端标记生物素Biotin，探针5’端标记荧光素FITC， 3’端修饰C3 Spacer，探针两端之间修饰四氢呋喃脱碱基位点。

2.包含权利要求1所述牛特异性RPA标记引物和探针组合的检测试剂。

3.根据权利要求2所述的检测试剂，其还包括鸭特异性RPA标记引物和探针组合，所述鸭特异性RPA标记引物序列如SEQ ID No.4和5所示，所述鸭特异性探针序列如SEQ ID No.6所示，其中SEQ ID No.5所示的RPA反向引物5’端标记生物素Biotin，SEQ ID No.6所示探针的5’端标记荧光素FITC， 3’端修饰C3 Spacer，探针两端之间修饰四氢呋喃脱碱基位点。

4.含有权利要求1所述牛特异性RPA标记引物和探针组合或权利要求2或3所述检测试剂的检测试剂盒。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其还包括针对RPA核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，该试纸条包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，所述检测线吸附有生物素抗体，所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗。

6.一种牛源性成分检测方法，其步骤如下所述：

1）提取样品基因组DNA；

2）用权利要求1所述的引物和探针组合或权利要求2所述的检测试剂进行RPA扩增；

3）利用权利要求5所述的试剂盒中的试纸条对RPA扩增产物进行检测。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增的50 µL扩增体系包括浓度为10 µmol/L的上下游引物各2.1 µL，浓度为10 µmol/L的探针0.6 µL，浓度为50 ng/µL的DNA模板2 µL，RPA反应缓冲液29.5 µL，最后加入ddH₂O补足至50 µL。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，RPA扩增反应程序为：恒温37-42℃，30~40分钟。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，RPA反应程序如下：恒温反应39℃，30分钟。