CN109797246A - 一种快速检测非洲猪瘟病毒rpa扩增引物及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测非洲猪瘟病毒RPA扩增引物及检测试剂盒，可有效扩增靶基因，特异性为100%，检测敏感性为10²拷贝/反应，灵敏度与TaqMan荧光定量PCR相当。与猪瘟病毒、猪疱疹病毒I型、猪繁殖与呼吸终合症病毒、猪圆环病毒等均无交叉反应。本发明的RPA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在38~46℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，因此，本发明的试剂盒能快捷、高效、灵敏的检测非洲猪瘟病毒，具有操作简单，特异性高，且反应结果易于观察，安全无污染等特点，不仅为非洲猪瘟病毒感染核酸的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制非洲猪瘟病毒在中国的感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有非常重要意义。

Description

一种快速检测非洲猪瘟病毒RPA扩增引物及检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种检测非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒，同时还提供了检测非洲猪瘟病毒的RPA扩增引物，属于预防兽医学检验领域。

背景技术：

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的急性、热性、高度接触性烈性传染病，对养殖业的发展具有毁灭性打击，主要引起高热、呕吐、便秘，体表部分皮肤粉红色或紫色，剖检可见脾肿大，颜色变暗，质地变脆。

目前，用于非洲猪瘟病毒的检测方法主要包括PCR、荧光定量PCR等分子生物学方法，这些均需要昂贵的仪器设备且需要专业技术人员进行操作，难以满足非实验室等基层现场条件下的检测要求。

发明内容

本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作方法简单等优点。

本发明还提供了检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒的扩增引物。

本发明所述的一种检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒，包含如下引物对、探针和核酸检测试纸条：其中，所述的引物组如下：

上游引物核苷酸信息：

RPA-F：5’-AAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCAC-3’；

下游引物核苷酸信息：

RPA-R：5’-Biotin-GCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATG-3’；

探针Probe核苷酸信息：5’-FAM-TGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAA

GCAAAG[THF]TAATCATCATCGCAC-P-3’

（Biotin：生物素基团，FAM：5-羧基荧光素基团，THF：四氢呋喃，P：磷酸基团，阻止扩增）。

所述的检测非洲猪瘟病毒RPA核酸试剂盒包含上述引物组合（引物及探针）、核酸扩增试剂盒和检测所用的试纸条；

所述的便携式检测试纸条为杭州优思达生物技术有限公司产品；

所述的核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，购自英国TwistDX公司；试剂盒包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液（280mM）和去离子水。

本发明所述的检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤：

(1)配置RPA反应体系：在RPA冻干颗粒中加入29.5μL 水解缓冲液，2.1μL 10μM 上游引物，2.1μL 10μM下游引物，0.6μL 10μM探针，12.2μL 去离子水，1μL病毒基因组DNA模板，在反应管盖上加280mM醋酸镁溶液2.5μL，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；恒温反应；

(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，3-5min观察结果；

(3)结果判读：直接肉眼判读①阴性：仅在质控区一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有猪瘟病毒感染；②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为非洲猪瘟病毒感染；③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

使用本发明所述的RPA核酸试纸条试剂盒扩增反应在温度设定为38℃的水浴锅中进行，反应时间为10min, 结束后通过侧向流动层析试纸条对结果进行检测。

本发明针对非洲猪瘟病毒的p72基因，该基因为非洲猪瘟病毒的保守基因。

本发明建立并评估了结合试纸条显色的RPA核酸检测试剂盒。

与常规PCR引物不同，RPA所需的引物长度为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，因其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加。

本发明的积极效果在于：

(1)采用RPA核酸检测试纸条建立快速检测ASFV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为ASFV的现场检测提供了一种灵敏、可靠的新方法。本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

(2)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对非洲猪瘟病毒进行检测的方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性。本发明选用的非洲猪瘟病毒p72基因引物是经过大量试验筛选获得的，特异性好，与猪的其他病毒包括猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒均无交叉反应。RPA 能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平；本发明所建立的检测方法可检测到150拷贝数/反应的ASFV病毒。

(3)本发明的RPA技术并结合核酸试纸条技术检测非洲猪瘟病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和现场的非洲猪瘟病毒的检测。

(4)检测速度快：与常规PCR相比，不用经过变性、退火、延伸三个步骤， RPA最适温度在30-46℃之间，无需变性，在常温下10min左右即可完成反应。

(5)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测，本发明所建立检测方法可以在常等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不需要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，且RPA不需要复杂的样品处理，样品提取过程中不需要离心机，采用纳米磁珠吸附方法提取病毒基因组，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

附图说明

图1为RPA-LFD检测的原理模式图（含目的片段扩增的产物5’含有FITC（FAM），3’含有Biotin标记，这样的“夹心三明治”就可以与检测线上的生物素配体结合，同时又可以与抗FITC的抗体结合，进而在检测线显示红色，而但标记或者无标记的产物仅能在控制线上出现条带）；

图2为ASFV RPA凝胶检测体系的建立及引物筛选结果图（图2A为筛选下游引物电泳亮度关系图，以F1为下游引物，下游引物为R1-R5，泳道组合1～5依次对应下游引物R1、R2、F3、R4、R5，得出R2为最佳上游。图2B为筛选上游引物电泳亮度关系图，以R2为下游引物，上游引物为F1-F5，泳道组合1～5依次对应上游引物F1、F2、F3、F4、F5，得出F5为最佳下游，每个组合的三个孔依次为ddH2O、阴性、阳性为模板进行试验）

图3为ASFVRPA-LFD反应检测条件优化结果图（图3A为ASFV RPA-LFD检测最佳温度确立的结果图，分别表示为1:22℃；2: 26℃；3: 30℃；4: 34℃；5:38℃; 6：42℃; 7: 46℃ 8:50℃。图3B为ASFVRPA-LFD检测条件时间优化结果图，分别表示为1:0min； 2:5min；3:10min；4:15min；5:20min；6:25min；7:30min）；

图4为检测本发明试剂盒特异性的结果图（第一个试纸条是以ASFV阴性为模板的RPA-LFD反应产物；第二个试纸条是以PRRSV为模板的RPA-LFD反应产物；第三个试纸条是以CSFV基因组为模板的RPA-LFD反应产物；第四个试纸条是以PRV为模板的RPA-LFD反应产物；第一个试纸条是以JEV为模板的RPA-LFD反应产物；第六个试纸条是以PEDV为模板的RPA-LFD反应产物；第七个试纸条是以PCV2b为模板的RPA-LFD反应产物；第八个试纸条是以ASFV-SY18为模板的RPA-LFD反应产物；第九个试纸条是以ASFV-JL18为模板的RPA-LFD反应产物）；

图5为ASFV RPA-LFD敏感性检测结果图（图5A为ASFV RPA-LFD试纸条检测，1: 阴性,2:1.5×10⁰, 3:1.5×10¹, 4:1.5×10², 5:1.5×10³, 6:1.5×10⁴, 7:1.5×10⁵,和ASFVRPA反应的凝胶电泳检测体系敏感性结果图5B，图中1: 阴性, 2:1.5×10⁰, 3:1.5×10¹,4:1.5×10², 5:1.5×10³, 6:1.5×10⁴, 7:1.5×10⁵）。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均属于本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中的定量实验，均作3个复孔，结果取算术平均值。

以下实施例中Twist DX Amp nfo Kits购自英国Twist DX公司；

以下实施例中的引物及探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以下实施例中的病毒基因组DNA/RNA试剂盒为北京美玲公司产品。

以下实施例中的试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司(货号：20180703)。

以下实施例中的非洲猪瘟病毒在文献“Emergence of African Swine Fever inChina, 2018”中公开过，序列信息已在NCBI公开，对其中的p72基因进行扩增，并进行了亚克隆。

实施例1

一、非洲猪瘟病毒的RPA检测引物、探针及其检测方法的建立

1、非洲猪瘟病毒的RPA引物及探针的设计与合成

对来自于GenBank中的非洲猪瘟病毒p72基因，根据RPA引物及探针设计原则，设计的引物及探针如下表（表1）。

上述引物和探针均合成。

表1 RPA所用引物及探针：

2、ASFV RPA凝胶检测体系的建立及引物筛选：

以磁珠提取试剂盒提取的基因组为模板进行扩增，并对设计引物进行筛选，筛选出最优引物对：

①以F为上游引物，筛选下游引物。

反应结束后，用2％的琼脂糖电泳鉴定，得出最佳下游引物。试验结果如图2A所示；

②以R为下游引物，筛选上游引物，试验结果如图2B所示；

综合以上结果确定RPA凝胶反应体系最优引物对为F及R：

上游引物：

RPA-F：5’-AAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCAC-3’；

下游引物：

RPA-R：5’-Biotin-GCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATG-3’；

探针引物：

Probe：5’-FAM-TGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAA；

GCAAAG[THF]TAATCATCATCGCAC-P-3’。

、ASFV RPA-LFD试纸条检测体系的建立

采用具体实现步骤如下所示：

(1)以病毒基因组为模板作为阳性对照，以ddH2O为阴性空白对照，以阴性脾脏或者血液组织提取的基因组为阴性对照；分别加入下列组分：29.5μL水解缓冲液(Rehydrationbuffer, Twist AMP nfo Kit)，12.2μL的ddH2O，2.1μL上游引物(10μM)，2.1μL下游引物(10μM)，0.6μL探针(10μM)，1μL模板；(2)RPA-LFD检测反应步骤：

将上述47.5μL缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2mL的Twist AMP nfo Kit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μL的280mM的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的金属恒温箱中，反应8~15min；

(6)反应结束后，吸取5μl加入到含95μl的试纸条缓冲液中，将试纸条插入到混合液中，等待3~5min，通过试纸条的显色进行判读。通过对检测样品是否出现假阳性及阳性样品检测出现条带的深浅来判定所用的探针。

、ASFV RPA-LFD检测条件的优化

①ASFV RPA-LFD方法的最佳反应温度的确立，通过在不同温度下进行反应后，结果表明该试验的最佳反应温度为30℃-46℃（图3A），综合使用的方便性及安全考虑，我们选择38℃作为该方法的反应温度。

②ASFV RPA-LFD方法的最佳反应时间的确立，通过在38℃反应不同时间，试验结果如图3B所示，当反应时间在10-30min时均可，试纸条带上没有出现可观测的差异，考虑到现场检测尽量节约时间，我们选择10min作为该实验的最佳反应时间。

③ASFV RPA-LFD方法的最佳反应体系中最佳引物和探针浓度的确立。我们分别试验不同浓度的引物及探针存在时实验结果表明引物最佳反应浓度为20nM-420nM，探针最佳反应浓度为10nM-120nM。

二、ASFV RPA-LFD特异性分析

猪繁殖与呼吸综合症病毒（CH1R），猪瘟病毒（Shimen）,乙型脑炎病毒（SA14-14-2）,猪流行性腹泻病毒（CV777），猪圆环病毒2型（PCV2b-SD12）购自上海海利生物科技有限公司。反应体系如具体步骤所示，反应条件为确定的优化条件，反应结束后滴加到试纸条检测。得到的结果为：以ASFV-SY18及ASFV-JL18基因组为模板的RPA-LFD，出现两条红色条带，一条位于质控区(C)内，另一条位于检测区(T)内；以 PRRSV、CSFV、PRV、JEV、PEDV、PCV2b分别为模板的RPA-LFD反应产物，仅在质控区(C)出现了一条红色条带，在检测区(T)内无红色条带出现。实验结果如图4所示。结果显示检测体系特异性良好，可特异的检测到非洲猪瘟病毒，且用核酸检测试纸条检测，操作更方便、省时。

三、ASFV RPA-LFD灵敏度分析及与TaqMan real time PCR方法灵敏度比较

1、标准品的制备

设计包含检测片段的引物对ASFV-SY18基因组进行扩增，目的条带大小的产物进行DNA 凝胶回收（操作见试剂盒说明书），得到的目的片段与pMD19-T载体进行连接、大肠杆菌内转化、质粒小剂量提取并鉴定。实验中的用以制备标准质粒的A260/A280的 OD 值需在1.8～2.0，并测定其浓度。

将合格的标准质粒原品进行10×稀释，依次获得10⁸ copies/µl、10⁷copies/µl……直到10⁰ copies/µl的标准品。

灵敏度

吸取上述标准质粒各稀释度1µl为模板，按照最优化条件进行反应，依次将10⁵copies,10⁴copies, 10³copies, 10²copies, 10¹copies, 10⁰copies, 阴性对照为模板，如图5A，同时对各拷贝数为模板RPA反应后的产物进行凝胶电泳，可以看出凝胶电泳的灵敏度为10³copies/反应图5B。

、TaqMan real time PCR检测

采用文献报道的探针（Preclinical Diagnosis of African Swine Fever inContact-Exposed Swine by a Real-Time PCR Assay），并对反应条件进行了探索，最终确定为 95℃ 2min; 95℃15s, 60℃ 60s, 40个循环。反应体系为：上、下游引物0.3μl, 探针引物0.4μl，反应缓冲液10µl, ddH2O 7µl, 模板2µl。对应的Cq值见表2，可以看出，检测灵敏性为10²copies/反应。

表2 TaqMan灵敏度检测结果：

其中，Cq:阈值周期；-：未出现扩增曲线。

四、临床样品检测

145份样品（90份脾脏及55份血液）均来自吉林地区养猪场，经实时荧光定量PCR检测，每个样品检测时设立3个复孔。并同时采用RPA-LFD方法进行检测。具体如下表3。

表3两种方法检测结果比较：

从表中，可以看出，RPA-LFD 与TaqMan real time对临床样品，检测出的阳性率一致性为100%。

相比于传统的PCR及荧光定量PCR，本发明操作更为简单，所需时间更短，对操作人员的技术要求不高；同时本发明的检测条件更适用于现场及基层非洲猪瘟筛查，能够方便、快捷、准确的对非洲猪瘟病毒进行检测，可广泛地运用于仪器设备及实验条件较差的区域。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 一种快速检测非洲猪瘟病毒RPA扩增引物及检测试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 上游引物(人工序列)

<400> 1

aagaagaaag ttaatagcag atgccgatac cac 33

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 下游引物(人工序列)

<400> 2

btngctctta catacccttc cactacggag gcaatg 36

Claims (4)

1.一种快速检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒的RPA扩增引物，其特征在于：

上游引物：

RPA-F：5’-AAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCAC-3’；

下游引物：

RPA-R：5’-Biotin-GCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATG-3’；

探针引物：

Probe：5’-FAM-TGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAA；

GCAAAG[THF]TAATCATCATCGCAC-P-3’。

2.一种检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：

包含权利要求1中的引物组和探针，含非洲猪瘟病毒p72基因阳性对照样品和阴性对照样品；核酸扩增试剂盒和快速检测所用的试纸条；

所述的核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，含有重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液（280mM）及去离子水。

3.根据权利要求2所述的一种快速检测非洲猪瘟病毒试剂盒的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

1）权利要求1中的引物组和探针制备：

在高通量引物合成仪内合成，对合成的下游引物在5’段耦连上生物素，探针上游耦连FAM，中间位置采用THF（四氢呋喃）替代一个碱基，3’段进行磷酸化处理，引物组及探针均采用PAGE纯化并结合质谱方式对合成物进行检验；

2）核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，含有重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液（280mM）及去离子水，为商品化制备；

3）快速检测所用试纸条：核酸扩增试剂盒检测所用试纸条含有生物素配体、抗FAM抗体及金颗粒；

4）所述非洲猪瘟病毒p72基因阳性对照样品和阴性对照样品均为临床检测获得的样品。

4.根据权利要求2所述的一种快速检测非洲猪瘟病毒试剂盒的检测方法，其特征在于包含以下步骤：

1）在RPA冻干酶粉中加入29.5μL水解缓冲液，2.1μL上游引物（10μM），2.1μL下游 (10μM)，0.6μL探针(10μM），12.2μL去离子水，1μL模板，在反应管盖上加2.5μL醋酸镁 (280mM)，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；恒温38℃反应10min；

2）反应：将步骤1）恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，3-5min观察结果；

3）结果判读：直接肉眼判读

①阴性：仅在质控线有一条红色带，在检测线处无红色带出现，说明所检测的样本没有非洲猪瘟病毒感染；

②阳性：出现两条红色带，一条位于检测线处，另一条位于质控线处，证明所检测的样本为非洲猪瘟病毒感染；

③无效：质控线和检测线内均无红色条带出现，表明试验不成立，核酸试纸条失效。