CN110317904A - 一种特异性检测非洲猪瘟病毒的lamp方法及其引物组合 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物病毒防制技术领域。具体涉及一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合，与靶DNA片段的检测领域相关。筛选了一组高灵敏、特异性的LAMP引物，使用NCBI BLAST在线软件分析针对非洲猪瘟病毒基因组序列的特异性基因B646L，利用LAMP primerexplorer网页对该病毒特异性片段设计多组特异性引物，得到灵敏性最高，特异性最强的LAMP引物。利用LAMP快速扩增模版DNA特异性区域，通过加入荧光染料，可在荧光定量PCR仪上完成反应及结果判定，整个反应不超过50min。本发明筛选引物组合具有灵敏度高、特异性强特点。本发明LAMP方法操作简单，成本低，结果易于判断。

Description

一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合
技术领域
本发明属于动物传染病仿制技术领域，具体涉及一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，简称ASFV)属于非洲猪瘟病毒科，是该科的唯一成员，也是虫媒传播病毒中唯一一个DNA病毒。病毒中心是直径为70—100nm的电子密度较高的DNA核心，核心外周是直径172-191nm呈二十面体对称的衣壳和含脂类的囊膜。基因组为双股线状DNA，大小为170-190kb。整个基因组有151个开放性阅读框，编码150-200种蛋白质。非洲猪瘟病毒能引起非洲猪瘟，它是猪的一种急性、烈性传染病，临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大，被世界动物卫生组织(OIE)列为一类疫病。
世界动物卫生组织提供的陆地诊断手册中关于非洲猪瘟检测方法部分提到：非洲猪瘟不能通过临床检查或尸检与经典猪瘟区分开来，而且和猪的任何急性发热性出血综合征都容易混淆。因此，实验室检查对于区分这些疾病至关重要。目前实验室检查针对该病已经建立了多种诊断方法。这些方法虽在实际诊断中发挥巨大作用，但也有其不足之处，例如有的操作繁杂，有的耗时费力。LAMP技术操作简单，灵敏，快速,，检测成本低,，且不需要特殊仪器设备,，具有较高的临床实用性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合。
本发明通过优化了一组高度灵敏、特异性的LAMP引物，进一步优化了非洲猪瘟病毒的LAMP检测方法。利用NCBI BLAST在线软件分析找到非洲猪瘟病毒特异性基因B646L的核苷酸序列，利用LAMP primerexplorer在线网页(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)针对该病毒基因特异性片段设计多组特异性引物，通过试验，最后优化、筛选出灵敏性最高，特异性最强的引物。通过加入荧光染料，可在荧光定量PCR仪上完成反应及结果判定，整个反应不超过50min，且无需复杂的检测仪器和检测过程，对非洲猪瘟病毒现场实时检测具有很好的应用价值。
本发明的技术方案如下所述：
一种高灵敏、特异性地检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法，包括如下步骤：
(1)根据文献报道选取非洲猪瘟病毒的特异性保守基因B646L(GenBank登录号MH722357.1)，并确定基因序列的准确性；
(2)根据步骤(1)确定的序列，利用LAMP primer explorer在线网页(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计如下多种特异性引物，这些引物分别针对特异性保守区的6个区域，每组引物包括一对F3/B3内引物，一对FIP/BIP外引物和一对LF/LB环引物；对多组特异性引物进行筛选，最后确定出特异性最强、灵敏度最高的引物进行扩增；所述的LAMP引物的序列如下所述：
外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT(与序列表SEQ ID NO:1所示的序列相同)；
B3:ATACCACAAGATCAGCCG(与序列表SEQ ID NO:2所示的序列相同)；
内引物：FIP:CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAATACCCTTCCACTACGGAG(与序列表SEQID NO:3所示的序列相同)；
BIP:ACCAACCCAGTGGTCATATTAACTAGACCCCACGTAATCCG(与序列表SEQ ID NO:4所示的序列相同)；
环引物：LF:GGGGGTTTTAATCGCATT(与序列表SEQ ID NO:5所示的序列相同)；
LB:ATCCAGAGCAAGAGAAT(同序列表SEQ ID NO:6)；
(3)优化后的LAMP体系为：20μmol/L的F3，B3引物各1μL；40μmol/L的FIP，BIP引物各1μL；10μmol/L的LF，LB引物各1μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP3.5μL；100mmol/L的Mg2+0.5μL；8U的Bst DNA聚合酶1.25μL；模板DNA 1μL；Eva Green20x 2μL，加灭菌双蒸水至25ul LAMP扩增反应体系；
(4)构建含目的片段的质粒，浓度稀释至108拷贝/μL，取1μL加入反应液中并混匀；
(5)置BIO-RAD96孔荧光定量PCR仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，20s，120个循环，SYBR通道收集荧光；
(6)扩增反应结束后，根据荧光PCR仪的扩增曲线和CT值判断检测结果；待测样品发生扩增，判断检测样本为阳性；待测样品不发生扩增，判断检测样本为阴性。
申请人提供了一种高灵敏、特异性地检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组合，所述的LAMP引物组合如下所述：
外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT(与序列表SEQ ID NO:1所示的序列相同)；
B3:ATACCACAAGATCAGCCG(同序列表SEQ ID NO:2所示的序列相同)；
内引物：FIP:CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAATACCCTTCCACTACGGAG(与序列表SEQID NO:3所示的序列相同)；
BIP:ACCAACCCAGTGGTCATATTAACTAGACCCCACGTAATCCG(同序列表SEQ ID NO:4所示的序列相同)；
环引物：LF:GGGGGTTTTAATCGCATT(与序列表SEQ ID NO:5所示的序列相同)；
LB:ATCCAGAGCAAGAGAAT(与序列表SEQ ID NO:6所示的序列相同)；
LAMP反应体系：20μmol/L的F3，B3引物各1μL；40μmol/L的FIP，BIP引物各1μL；10μmol/L的LF，LB引物各1μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP3.5μL；100mmol/L的Mg2+0.5μL；8U的Bst DNA聚合酶1.25μL；模板DNA 1μL；Eva Green20x 2μL，加灭菌双蒸水至25ulLAMP扩增反应体系。
本发明的LAMP引物组合可在制备检测非洲猪瘟病毒试剂盒中的应用。
申请人提供了一种对非洲猪瘟病毒的LAMP的快速检测方法的引物组合，所述的引物组合的序列如下所示：
外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT(序列如SEQ ID NO:1所示)；
B3:ATACCACAAGATCAGCCG(序列如SEQ ID NO:2所示)；
内引物：FIP:CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAATACCCTTCCACTACGGAG(序列如SEQ IDNO:3所示)；
BIP:ACCAACCCAGTGGTCATATTAACTAGACCCCACGTAATCCG(序列如SEQ ID NO:4所示)；
环引物：LF:GGGGGTTTTAATCGCATT(序列如SEQ ID NO:5所示)；
LB:ATCCAGAGCAAGAGAAT(序列如SEQ ID NO:6所示)；
本发明的有益效果本发明的LAMP检测方法对于非洲猪瘟病毒的预防和检测具有很好的应用价值，所述LAMP引物组合具有灵敏度高、特异性强的特点，本发明具有操作简单、成本低和结果易于判断的的特点。
附图说明
图1：不同Mg2+浓度与荧光信号强度图。
图2：不同甜菜碱浓度与荧光信号强度图。
图3：不同dNTPs浓度与荧光信号强度图。
图4：不同引物比例(外引物：内引物：环引物)与荧光信号强度的对比。
图5：不同温度与荧光信号强度电泳图。
图6：标准质粒的标准曲线。
图7：LAMP产物电泳分析。附图标记说明：附图标记说明：M：marker DL 2000；泳道1～4：2，4，6，8μm MgSO4条件下扩增的ASFV DNA；泳道5：空白对照。
图8.：LAMP特异性检测结果。
具体实施方式
实施例1
1、LAMP引物的设计与合成：
根据文献报道选取非洲猪瘟病毒的特异性保守基因B646L(GenBank登录号为MH722357.1)，并确定基因序列的准确性。利用LAMP primerexplorer在线网页(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计多种LAMP扩增引物，每组引物分别针对特异性保守基因B646L的8个区域，每组引物包括一对编号为F3/B3的内引物，一对编号为FIP/BIP的外引物以及一对编号为LF/LB的环引物，利用LAMP方法通过试验筛选出具有高效灵敏性和特异性的一组引物。
2、目的片段质粒制备：
目的片段质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3、反应条件的优化：
利用上述LAMP反应体系对质粒进行扩增，优化其反应条件：针对Mg2+浓度(设计了4个浓度梯度：2mM，4mM，6mM和8mM)，甜菜碱浓度(设计了5个浓度梯度：0M，0.4M，0.6M，0.8M和1.0M)，dNTP浓度(设计了3个浓度梯度：1.0mM，1.4mM和1.8mM)，外引物与环引物与内引物浓度比例(设计了3个浓度比例：1:2:8，1:4:8和1:6:8)，Bst DNA聚合酶(8U)浓度(设计了3个浓度梯度：6U，8U和10U)和反应温度(设计了3种温度梯度：63℃，65℃和68℃)，分别进行优化。通过对各反应条件的优化，最终的优化后的体系为：F3引物、B3引物(10μmol/L)各1μL；FIP引物、BIP引物(40μmol/L)各1μL；LF引物、LB引物(10μmol/L)各1μL；10×Bst buffer2.5Μl；dNTP(10mmol/L)3.5μL；MgSO4(100mmol/L)0.5μL；Bst DNA聚合酶(8U)1.25μL；模板DNA 1μL；Eva Green20x2μL，加灭菌双蒸水至25μL LAMP扩增反应体系。
3.1 MgSO4浓度的优化
将MgSO4(100μm)以0.25μL、0.5μL、1.0μL和1.5μL的量分别加入PCR管(对应终浓度为2μm，4μm，6μm，8μm)并将ddH2O的量进行相应减少，重复试验后以确定最佳MgSO4的用量。
不同MgSO4浓度下的CT值如表1所示，不同MgSO4浓度下的荧光强度如图1所示。综合扩增效率及反应特异性，根据CT值即反应时间和荧光强度进行判断，最佳确定MgSO4的浓度为2μm。
表1不同MgSO4浓度与对应的CT值
3.2甜菜碱浓度的优化
将甜菜碱(8M)以5μL、4μL、3μL、2μL、0μL的量(对应终浓度为1.0μm，0.8μm，0.6μm，0.4，0μm)分别加入PCR管，并将ddH2O的量进行相应减少，重复试验以确定最佳甜菜碱用量。
不同甜菜碱浓度下的CT值如表2所示，不同甜菜碱浓度下的荧光强度如图2所示。根据CT值即反应时间和荧光强度进行判断，确定最佳甜菜碱浓度为0M。
表2不同甜菜碱浓度与对应的CT值
3.3 dntp浓度的优化
将dntp(10μm)以4.5μL、3.5μL、2.5μL的量(对应终浓度为1.8μm，1.4μm，1.0μm)分别加入PCR管，并将ddH2O的量进行相应减少，重复试验以确定最佳dntp用量。
不同dntp浓度下的CT值如表3所示，不同dntp浓度下的荧光强度如图3所示。根据CT值，即反应时间和荧光强度进行判断。确定最佳dntp浓度为1.4μm。
表3不同dntp浓度与对应CT值
3.4引物比例的优化
将内引物与外引物浓度固定，将环引物LF和LB分别稀释为20μm，以体积比为1:1混合，以2μL、4μL、8μL的量(对应引物比例(内:环:外)为体积比为8:2:1，8:4:1，8:6:1)分别加入PCR管，并将ddH2O的量进行相应减少，重复试验以确定最佳的引物比例。
不同引物比例下的CT值如表4所示，不同引物比例下的荧光强度如图4所示。根据CT值，即反应时间和荧光强度进行判断，确定最佳的引物比例为内:环:外＝8:6:1。
表4不同引物比例浓度与对应的CT值
3.5反应温度优化
将LAMP反应体系配好混匀，分别置于68℃、65℃、63℃温度下恒温反应，反应结束后根据荧光信号强度和CT值确定最佳的反应温度。
不同温度下的CT值如表5所示，不同温度下的荧光强度图如图5所示。根据CT值即反应时间和荧光强度进行判断，最佳的反应温度为63℃。
表5不同温度与对应CT值
4、LAMP引物特异性试验：
分别提取猪伪狂犬病毒(PRV)，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(又称蓝耳病，PRRSV)，猪圆环病毒2型(PCV-2)，猪瘟病毒(CSFV)和猪细小病毒(PPV)的基因组DNA(采用天根生化(北京)科技有限公司的DNA提取试剂盒，按试剂盒的说明书进行操作)。通过LAMP方法结合筛选的特异性引物分别对不同样品进行扩增，上述5种猪病毒样品均由武汉科前生物股份有限公司馈赠。在LAMP引物特异性试验中只有非洲猪瘟病毒能被扩增，其他样品则不能被扩增，说明本发明筛选的LAMP引物具有很高的特异性。
5、敏感性试验：
将质粒进行10倍倍比稀释(106-101拷贝/μL)，结果显示LAMP可以检测到102拷贝/μL。说明本发明筛选的LAMP引物具有较强的灵敏性。
表6不同质粒拷贝数与对应CT值
本发明通过软件分析和试验优化，筛选出一组高度灵敏、特异性的LAMP引物。本发明进一步优化了操作程序，所述的LAMP方法，具有操作简单、成本低廉和反应周期短等优点。本发明的LAMP方法对于非洲猪瘟病毒的检测和预防具有很好的应用价值。
本发明的LAMP引物组合可在制备非洲猪瘟病毒的检测试剂盒中应用。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合
<141> 2019-06-18
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 1
gctcttacat acccttcca 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 2
acaagatcag ccgtagtg 18
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(41)
<400> 3
tggcttcaaa gcaaaggtaa tcaggcaatg cgattaaaac c 41
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(40)
<400> 4
accaacccag tggtcatatt aagtaatccg tgtcccaact 40
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(15)
<400> 5
tcgcacccgg atcat 15
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 6
cgtatccaga gcaagagaa 19

Claims (3)

1.一种高灵敏、特异性地检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用NCBI中BLAST软件对GeneBank中ASFV的全基因组进行分析，找出GenBank登录号MH722357.1的特异性保守基因B646L，并确定基因序列的准确性；
(2)根据步骤(1)确定的序列，针对特异性保守区基因B646L，利用LAMPprimerexplorer设计如下所述的特异性引物，这些引物分别针对特异性保守区的6个区域，每组引物包括一对F3/B3内引物，一对FIP/BIP外引物和一对LF/LB环引物；对多组特异性引物进行筛选，最后确定出特异性最强、灵敏度最高的引物进行扩增；
所述的LAMP引物的序列如下所述：
外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT；
B3:ATACCACAAGATCAGCCG；
内引物：FIP:CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAATACCCTTCCACTACGGAG；
BIP:ACCAACCCAGTGGTCATATTAACTAGACCCCACGTAATCCG；
环引物：LF:GGGGGTTTTAATCGCATT；
LB:ATCCAGAGCAAGAGAAT；
(3)优化后的LAMP体系为：20μmol/L的F3，B3引物各1μL；40μmol/L的FIP，BIP引物各1μL；10μmol/L的LF，LB引物各1μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP3.5μL；100mmol/L的Mg2+0.5μL；8U的Bst DNA聚合酶1.25μL；模板DNA 1μL；Eva Green20x 2μL，加灭菌双蒸水至25ul LAMP扩增反应体系；
(4)构建含目的片段的质粒，浓度稀释至108拷贝/μL，取1μL加入反应液中并混匀；
(5)置BIO-RAD96孔荧光定量PCR仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，20s，120个循环，SYBR通道收集荧光；
(6)扩增反应结束后，根据荧光PCR仪的扩增曲线和CT值判断检测结果；待测样品发生扩增，判断检测样本为阳性；待测样品不发生扩增，判断检测样本为阴性。
2.一种高灵敏、特异性地检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组合，其特征在于，所述的LAMP引物组合如下所述：
外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT；
B3:ATACCACAAGATCAGCCG；
内引物：FIP:CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAATACCCTTCCACTACGGAG；
BIP:ACCAACCCAGTGGTCATATTAACTAGACCCCACGTAATCCG；
环引物：LF:GGGGGTTTTAATCGCATT；
LB:ATCCAGAGCAAGAGAAT；
LAMP反应体系：20μmol/L的F3，B3引物各1μL；40μmol/L的FIP，BIP引物各1μL；10μmol/L的LF，LB引物各1μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP3.5μL；100mmol/L的Mg2+0.5μL；8U的Bst DNA聚合酶1.25μL；模板DNA 1μL；Eva Green20x 2μL，加灭菌双蒸水至25ulLAMP扩增反应体系。
3.权利要求2所述的LAMP引物组合在制备检测非洲猪瘟病毒试剂盒中的应用。
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