CN110885905B - 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的lamp检测引物及试剂盒 - Google Patents

一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的lamp检测引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360‑505R基因缺失株LAMP检测引物及其试剂盒，所述LAMP检测引物包含两套引物，分别针对非洲猪瘟病毒野毒株保守的衣壳蛋白基因P72(B646L)序列和非洲猪瘟MGF360‑505R基因缺失株第27942‑35500位缺失区两侧，能特异性的检测出该非洲猪瘟MGF360‑505R基因缺失株。本方法采用恒温反应的检测手段，仅需加热即可实现整个反应，检测结果可以直接目测，适合现场检测；所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360‑505R基因缺失株的基层检测手段。

Description

一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的LAMP检测引物 及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的LAMP检测引物及试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。患猪临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，最急性和急性感染死亡率高达100％。家猪、野猪与软蜱是非洲猪瘟自然宿主，非洲猪瘟可在家猪与野猪之间直接传播，也可由软蜱叮咬传播，还可以通过病毒污染的泔水、饲料及各种猪肉制品跨国家和地区传播。发现疫情必须扑杀进行无害化处理，其广泛危害全球猪群，是我国重点防范的外来动物传染病。尚无有效的商品化预防疫苗及特效药。
目前CN110093324A公开了一种可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法，采用非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得MGFMGF360-505R缺失和CD2V与MGFMGF360-505R联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。但该疫苗的使用会导致常规方法检测非洲猪瘟病毒结果钧为阳性，无法区分野毒感染致阳性，还是疫苗接种导致阳性。实验室检测经常用到的方法包括：电镜观察，ELISA，细胞转染(CFT)和血清中和试验；感染组织的组织病理学；以及核酸检测，包括PCR和实时定量PCR(RFLP)。然而，以上核酸检测方法虽然能够实现非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的准确检测，但是其都是属于实验室检测手段，需要借助复杂的仪器和严苛的实验条件，并不适合养殖场和基层单位的现场检测。
发明内容
本发明第一个方面的目的，针对非洲猪瘟病毒普通检测方法不能区分病毒感染或是疫苗接种的情形，而常规核酸检测手段不便、对仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测的技术问题，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测引物组。
本发明第二个方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测试剂盒。
本发明第三个方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测引物组，包括以下A、B两组引物，每组引物包括：一对外引物、一对内引物及一对环引物，
A组：
外引物：
P72-F3：TACTGTAACGCAGCACAG(SEQ ID NO:1)；
P72-B3：CGATAAATTTCCATCAAAGTTCTG(SEQ ID NO:2)；
内引物：
P72-FIP：TAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTGAAAGTTAATAGCAGATGCCG(SEQ ID NO:3)；
P72-BIP：ATGACCACTGGGTTGGTATTCCAATGCGATTAAAACCCCCG(SEQ ID NO:4)；
环引物：
P72-LF：CACTACGGCTGATCTTGTGGTAT(SEQ ID NO:5)；
P72-LB：CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATC(SEQ ID NO:6)；
B组：
外引物：
MGF360-505RQS-F3：GGATTATACTGGGAAAACCAT(SEQ ID NO:7)；
MGF360-505RQS-B3：GCTGATATTTTTTAGCCAGAGTT(SEQ ID NO:8)；
内引物：
MGF360-505RQS-FIP：
CAGGGCTTCATTTACGGGAATGATTTTCGAGCAGGAAACAACTGT(SEQ ID NO:9)；
MGF360-505RQS-BIP：
GCAGCGAGACGTTTCAATAAAAGTTTTCTATCTCCTTGCTTCCACC(SEQ ID NO:10)；
环引物：
MGF360-505RQS-LF：CAACTGTGTGCTTATACAGCAAC(SEQ ID NO:11)；
MGF360-505RQS-LB：GGCTTCTACCCTTTGTAATCAAAAC(SEQ ID NO:12)。
本发明的第二个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒中包含本发明第一个方面所述的引物组。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括Bst DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述阳性对照为含有非洲猪瘟病毒P72基因片段的质粒和含有非洲猪瘟病毒缺失第27942-35500位两侧区域片段的质粒。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述含有非洲猪瘟病毒P72基因片段的序列如SEQ ID No.13所示，所述缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如SEQ ID No.14所示。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中两组引物的外引物、环引物，内引物的摩尔比为1:5:10。
本发明的第三个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株LAMP检测方法，包括以下步骤：
S1.提取待测样品DNA；
S2.以步骤S1中提取的核酸为模板，配置两个25μL反应体系，包括引物、DNA聚合酶、LAMP反应液和待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL，然后千63～68℃下反应30～60min，所述两个25μL反应体系分别含有上述所述的两组引物中的一组；
S3.通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳验证，确定病毒类型。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：
当两个反应管均未变浑浊，则说明未检测到非洲猪瘟病毒；
当两个反应管均变浑浊，则说明样品中含有MGF360-505R基因缺失株；
当A组引物反应管变浑浊，B组引物反应管未变浑浊，则说明样品是野毒株并且不含MGF360-505R基因缺失株。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：
当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均无梯状条带，则说明未检测到非洲猪瘟病毒；
当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均有梯状条带，则说明样品中含有MGF360-505R基因缺失株；
当A组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳有梯状条带，B组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，则说明样品是野毒株并且不含MGF360-505R基因缺失株。
本发明的有益效果是：
1.本发明基于LAMP技术特异性高的特点，所设计的引物仅能特异性扩增非洲猪瘟病毒的基因组序列，且引物设计科学，避免了引物二聚体的形成，保证了反应的顺利进行。选取非洲猪瘟的保守基因序列P72(B646L)作为检测的目标基因，该P72(B646L)基因高度保守，可以保证检测结果的准确性，避免漏检的出现，选取的缺失片段两侧的区域特异性强，避免了假阳性出现。
2.本发明提供的非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株LAMP检测方法灵敏度高，最低检测极限是 101拷贝阳性质粒DNA，高于现有技术报道的LAMP检测方法。
3.本发明提供的检测方法操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要恒温水浴即可反应，反应条件温和；而且可以通过肉眼观察浑浊、琼脂糖凝胶电泳或者添加荧光物质进行荧光检测等丰富的途径判定检测结果，适合猪场或者基层检测单位的现场检测。
附图说明
图1阳性质粒验证图。M：Marker；1：PCR鉴定P72(B646L)片段；2：PCR鉴定缺失第27942-35500位两侧区域片段。
图2LAMP检测结果图。1：A组引物，以质粒P72(B646L)作为模板进行检测；2：A组引物，以质粒360QS作为模板进行检测；3：B组引物，以质粒360QS作为模板进行检测；4：B组引物，以P72(B646L)作为模板进行检测；5：检测去离子水；其中管1，管3显示浑浊。
图3LAMP检测结果电泳图。M：Marker；1：A组引物，以质粒P72(B646L)作为模板进行检测；2：A组引物，以质粒360QS作为模板进行检测；3：B组引物，以360QS作为模板进行检测；4：B组引物，以质粒P72(B646L)作为模板进行检测；5：检测去离子水。
图4质粒P72(B646L)作为模板LAMP特异性试验结果电泳图。M：Marker；1：非洲猪瘟病毒；2：猪瘟病毒核酸；3：猪繁殖与呼吸道综合征病毒核酸；4：猪圆环病毒2型病毒核酸；5：猪丹毒病毒核酸。
图5质粒360QS作为模板进行检测LAMP特异性试验结果电泳图。M：Marker；1：非洲猪瘟病毒；2：猪瘟病毒核酸；3：猪繁殖与呼吸道综合征病毒核酸；4：猪圆环病毒2型病毒核酸；5：猪丹毒病毒核酸。
图6质粒P72(B646L)作为模板进行LAMP灵敏度试验结果电泳图。M：Marker；1：质粒1×106拷贝/μL；2：质粒1×105拷贝/μL；3：质粒1×104拷贝/μL；4：质粒1×103拷贝/μL；5：质粒1×102拷贝/μL；6：质粒1×101拷贝/μL；7：质粒1×100拷贝/μL。
图7质粒360QS作为模板进行检测LAMP灵敏度试验结果电泳图。M：Marker；1：质粒1×106拷贝/μL；2：质粒1×105拷贝/μL；3：质粒1×104拷贝/μL；4：质粒1×103拷贝/μL；5：质粒1×102拷贝/μL；6：质粒1×101拷贝/μL；7：质粒1×100拷贝/μL。
图8质粒P72(B646L)作为模板进行LAMP灵敏度试验结果图。1：质粒1×106拷贝/μL；2：质粒1×105拷贝/μL；3：质粒1×104拷贝/μL；4：质粒1×103拷贝/μL；5：质粒1×102拷贝/μL；6：质粒1×101拷贝/μL；7：质粒1×100拷贝/μL；其中管1～6显示浑浊。
图9质粒360QS作为模板进行检测LAMP灵敏度试验结果图。1：质粒1×106拷贝/μL；2：质粒1×105拷贝/μL；3：质粒1×104拷贝/μL；4：质粒1×103拷贝/μL；5：质粒1×102拷贝/μL；6：质粒1×101拷贝/μL；7：质粒1×100拷贝/μL；其中管1～6显示浑浊。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
实施例1引物设计
1.质粒
根据Genebank上提供的非洲猪瘟病毒基因序列(GenBank:MK333180.1)，选取其中的部分片段(SEQ ID No.11所示)，由北京擎科新业生物技术有限公司合成质粒pUC57-VIR，溶解稀释至1.0×106拷贝/μL。
2.阳性质粒的鉴定
构建阳性质粒，构建含有目的基因P72(B646L)片段的质粒DNA与缺失第27942-35500位两侧区域片段的质粒DNA，所述目的基因P72(B646L)片段的序列如SEQ ID No.13所示,所述缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如SEQ ID No.14所示。
目的基因P72(B646L)片段：
TACTGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAACTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATCGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTATCG(SEQ IDNo.13)。
缺失第27942-35500位两侧区域片段：
GGATTATACTGGGAAAACCATGGAACTATTCAACGAGCAGGAAACAACTGTGTGCTTATACAGCAACATACCCTCATTCCCGTAAATGAAGCCCTGAGAACAGCAGCAGCGAGACGTTTCAATAAAAGGGCTTCTACCCTTTGTAATCAAAACCATAGAATATGGTGGAAGCAAGGAGATAGCCATAACTCTGGCTAAAAAATATCAGC(SEQ IDNo.14)。
采用外引物P72-F3、P72-B3对阳性质粒P72(B646L)进行PCR扩增，采用外引物MGF360-505RQS-F3、MGF360-505RQS-B3对阳性质粒360QS进行PCR扩增，验证质粒的正确性，所对应的片段大小分别为：287bp和209bp。结果如附图1所示。
从图中可以看出，目的基因大小正确、电泳条带清晰、无杂带。
3.LAMP引物设计和筛选
根据Genebank公布的非洲猪瘟毒株基因序列，通过http：//PrimerExplorer.jp设计引物，由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列如下表1所示：
表1非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株LAMP检测引物组
其中，A组：
外引物：
P72-F3：TACTGTAACGCAGCACAG(SEQ ID NO:1)；
P72-B3：CGATAAATTTCCATCAAAGTTCTG(SEQ ID NO:2)；
内引物：
P72-FIP：TAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTGAAAGTTAATAGCAGATGCCG(SEQ ID NO:3)；
P72-BIP：ATGACCACTGGGTTGGTATTCCAATGCGATTAAAACCCCCG(SEQ ID NO:4)；
环引物：
P72-LF：CACTACGGCTGATCTTGTGGTAT(SEQ ID NO:5)；
P72-LB：CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATC(SEQ ID NO:6)；
B组：
外引物：
MGF360-505RQS-F3：GGATTATACTGGGAAAACCAT(SEQ ID NO:7)；
MGF360-505RQS-B3：GCTGATATTTTTTAGCCAGAGTT(SEQ ID NO:8)；
内引物：
MGF360-505RQS-FIP：CAGGGCTTCATTTACGGGAATGATTTTCGAGCAGGAAACAACTGT(SEQID NO:9)；
MGF360-505RQS-BIP：GCAGCGAGACGTTTCAATAAAAGTTTTCTATCTCCTTGCTTCCACC(SEQID NO:10)；
环引物：
MGF360-505RQS-LF：CAACTGTGTGCTTATACAGCAAC(SEQ ID NO:11)；
MGF360-505RQS-LB：GGCTTCTACCCTTTGTAATCAAAAC(SEQ ID NO:12)。
实施例2LAMP反应体系的建立
确定LAMP检测的25μl反应体系中各组分的含量及比例，将其置于恒温容器中进行扩增。通过肉眼观察白色浑浊和凝胶电泳相结合，判断检测结果。其中25μL反应体系如表2所示。
表2 25μLLAMP反应体系
名称 用量
Bst DNA聚合酶 1.0μL
10×Bst buffer 2.5μL
dNTP 2.5μL
Mg2+/Mn2+混合物 2.0μL
引物 6.0μL
DNA模板 2.0μL
ddH2O 9.0μl
总量 25.0μL
将浓度为103拷贝的阳性质粒作为检测对象，经试验确定LAMP反应温度为65℃，最佳反应时间为50min。
结果表明在65℃的条件下反应50分钟，从结果中可以看出，A组引物(针对P72基因)，以质粒P72(B646L)作为模板时呈现白色浑浊(见附图2中第1管所示)，以质粒360QS作为模板时反应液澄清(见附图2中第2管所示)。B组引物(针对MGF360-505R基因缺失)，以质粒360QS作为模板进行检测时呈现白色浑浊(见附图2中第3管所示)，以质粒P72(B646L)作为模板进行检测时反应液澄清(见附图2中第4管所示)。阴性对照，加入去离子水，反应液显示澄清(见附图2中第5管所示)。且经电泳验证，阳性结果(出现白色浑浊或沉淀)检测结果出现梯状条(见附图3)。实验结果表明，该反应体系可以直观用肉眼鉴别样本是否是非洲猪瘟病毒阳性，以及是否是MGF360-505R基因缺失毒株。
实施例3特异性试验
使用常规方法提取非洲猪瘟病毒核酸，猪瘟病毒核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸、猪圆环2型病毒核酸、猪丹毒病毒核酸提取物作为模板，采用实施例1中LAMP检测引物，按照实施例2中反应体系及反应条件分别进行检测，检测引物的特异性。结果见下表表3、附图4
表3 LAMP的特异性测定统计
实验结果表明，用该试剂盒检测猪瘟病毒核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸、猪圆环2型病毒核酸、猪丹毒病毒核酸提取物，结果全为阴性。第一套引物检测已知非洲猪瘟病毒核酸，结果为阳性；第二套引物检测360QS质粒，结果为阳性。
实施例4灵敏度试验
非洲猪瘟病毒阳性冻干质粒P72(B646L)与质粒360QS分溶解稀释到1×106个拷贝数，而后，将稀释到1×106拷贝/μl的质粒做10-0～10-6梯度稀释，分别对不同拷贝数的阳性质粒样本进行LAMP扩增和PCR扩增。结果显示，从10-1～10-5倍稀释的质粒溶液中均可扩增到预期的阳性，可测的质粒最低浓度为101拷贝/μl(见附图5、6)，而PCR检测的灵敏度为103拷贝/μL，相比而言，LAMP检测的灵敏度提高了100倍。对上述样品检测的灵敏度结果见表4。
表4 LAMP检测实验样品的灵敏度检测结果统计
实施例5灵敏度比较试验
发明人在研究过程中，对于引物进行了大量的优化工作，特别是环引物，研究发现，环引物对于LAMP检测的灵敏度具有重要的影响，以下表5为比较试验的对照组方案，实验组为实施例1中两套引物。
表5灵敏度比较试验设置
采用实施例2中反应体系及反应条件，在相同的条件下进行对比实验，检测结果见下表6。
表6 LAMP检测实验样品的敏感性检测结果
质粒拷贝数 106 105 104 103 102 101 100
第一套引物 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性
对照组1 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性
对照组2 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性
第二套引物 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性
对照组3 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性
对照组4 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性
结果可见，实施例1中设计的引物，对构建的阳性质粒的灵敏度为10拷贝/μl，其可测到的最小质粒数为 101拷贝/μL。相比对照组的引物，本发明实施例1的引物组具有更高的灵敏度，对于猪场净化具有更重要的意义。
实施例6 LAMP检测试剂盒的构建
试剂盒包含实施例1中提供的引物组、Bst DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。
其中A、B两组引物的外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:5:10。
LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液。
阳性对照为含有目的基因P72(B646L)片段的质粒DNA与缺失第27942-35500位两侧区域片段的质粒DNA，目的基因P72(B646L)片段的序列如SEQ ID No.13所示,缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如SEQ ID No.14所示。
阴性对照为去离子水。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
肇庆大华农生物药品有限公司
<120> 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的LAMP检测引物及试剂盒
<130>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tactgtaacg cagcacag 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgataaattt ccatcaaagt tctg 24
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taacgtatcc agagcaagag aatttgaaag ttaatagcag atgccg 46
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaccactg ggttggtatt ccaatgcgat taaaaccccc g 41
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cactacggct gatcttgtgg tat 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgtggcttc aaagcaaagg taatc 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggattatact gggaaaacca t 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctgatattt tttagccaga gtt 23
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagggcttca tttacgggaa tgattttcga gcaggaaaca actgt 45
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcagcgagac gtttcaataa aagttttcta tctccttgct tccacc 46
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caactgtgtg cttatacagc aac 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggcttctacc ctttgtaatc aaaac 25
<210> 13
<211> 287
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tactgtaacg cagcacagct gaaccgttct gaagaagaag aaagttaata gcagatgccg 60
ataccacaag atcagccgta gtgatagacc ccacgtaatc cgtgtcccaa ctaatataaa 120
attctcttgc tctggatacg ttaatatgac cactgggttg gtattcctcc cgtggcttca 180
aagcaaaggt aatcatcatc gcacccggat catcgggggt tttaatcgca ttgcctccgt 240
agtggaaggg tatgtaagag ctgcagaact ttgatggaaa tttatcg 287
<210> 14
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggattatact gggaaaacca tggaactatt caacgagcag gaaacaactg tgtgcttata 60
cagcaacata ccctcattcc cgtaaatgaa gccctgagaa cagcagcagc gagacgtttc 120
aataaaaggg cttctaccct ttgtaatcaa aaccatagaa tatggtggaa gcaaggagat 180
agccataact ctggctaaaa aatatcagc 209
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aatgggtctt ccaaaaggat ctac 24

Claims (10)

1.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测引物组在制备区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的检测试剂中的应用，其特征在于，所述LAMP检测引物组包括以下A、B两组引物，每组引物包括：一对外引物、一对内引物和一对环引物，
A组：
外引物：
P72-F3：TACTGTAACGCAGCACAG(SEQ ID NO:1)；
P72-B3：CGATAAATTTCCATCAAAGTTCTG(SEQ ID NO:2)；
内引物：
P72-FIP：TAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTGAAAGTTAATAGCAGATGCCG(SEQ ID NO:3)；
P72-BIP：ATGACCACTGGGTTGGTATTCCAATGCGATTAAAACCCCCG(SEQ ID NO:4)；
环引物：
P72-LF：CACTACGGCTGATCTTGTGGTAT(SEQ ID NO:5)；
P72-LB：CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATC(SEQ ID NO:6)；
B组：
外引物：
MGF360-505RQS-F3：GGATTATACTGGGAAAACCAT(SEQ ID NO:7)；
MGF360-505RQS-B3：GCTGATATTTTTTAGCCAGAGTT(SEQ ID NO:8)；
内引物：
MGF360-505RQS-FIP：CAGGGCTTCATTTACGGGAATGATTTTCGAGCAGGAAACAACTGT(SEQ IDNO:9)；
MGF360-505RQS-BIP：GCAGCGAGACGTTTCAATAAAAGTTTTCTATCTCCTTGCTTCCACC(SEQ IDNO:10)；
环引物：
MGF360-505RQS-LF：CAACTGTGTGCTTATACAGCAAC(SEQ ID NO:11)；
MGF360-505RQS-LB：GGCTTCTACCCTTTGTAATCAAAAC(SEQ ID NO:12)。
2.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1中所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括Bst DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在，所述LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有非洲猪瘟病毒P72基因片段的质粒和/或含有非洲猪瘟病毒缺失第27942-35500位两侧区域片段的质粒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述含有非洲猪瘟病毒P72基因片段的序列如SEQ ID No.13所示，所述缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如SEQ IDNo.14所示。
7.根据权利要求2至6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中两组引物的外引物、环引物，内引物的摩尔比为1:5:10。
8.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待测样品DNA；
S2.以步骤S1中提取的核酸为模板，配置两个25μL反应体系，包括引物、DNA聚合酶、LAMP反应液和待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL，然后千63～68℃下反应30～60min，所述两个25μL反应体系分别含有权利要求1中所述的两组引物中的一组；
S3.通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳验证，确定病毒类型；所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：
当两个反应管均未变浑浊，则说明未检测到非洲猪瘟病毒；
当两个反应管均变浑浊，则说明样品中含有MGF360-505R基因缺失株；
当A组引物反应管变浑浊，B组引物反应管未变浑浊，则说明样品是野毒株并且不含MGF360-505R基因缺失株。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：
当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均无梯状条带，则说明未检测到非洲猪瘟病毒；
当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均有梯状条带，则说明样品中含有MGF360-505R基因缺失株；
当A组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳有梯状条带，B组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，则说明样品是野毒株并且不含MGF360-505R基因缺失株。
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