CN113215311A

CN113215311A - 一种离心式微流控芯片鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组合及试剂盒

Info

Publication number: CN113215311A
Application number: CN202110442914.3A
Authority: CN
Inventors: 蓝天; 陈咏辉; 周玲; 马静云; 孙媛; 李倩妞; 张泽生
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本发明属于核酸检测技术领域，公开了一种离心式微流控芯片鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组合及试剂盒，包括微流控芯片，恒温扩增预混液，恒温扩增酶溶液，阳性标准品。还涉及一种采用上述试剂盒的检测方法，包括引物组合物的包被、待检核酸样品的提取、LAMP反应和结果判读。该检测体系可以在等温条件下，快速、方便、高效、特异和灵敏地鉴别诊断非洲猪瘟基因缺失株和非洲猪瘟野毒株，不需昂贵复杂的仪器，为非洲猪瘟的流行病学检测和预防控制提供了新的便携检测平台，大大降低了检测成本，易于大范围推广，具有广阔的市场前景。

Description

一种离心式微流控芯片鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组合及试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测、诊断领域，更具体地，涉及一种微流控芯片、恒温微流控芯片分析装置及微流控检测方法结合LAMP技术鉴别诊断非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病，可感染所有品种和年龄的野猪和家养猪，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。1921年肯尼亚首次报道了ASF疫情，至今，ASF仍在非洲、亚洲、东欧以及俄罗斯流行。2018年8月我国辽宁省沈阳市发生首例非洲猪瘟疫情，该ASFV毒株属于基因型Ⅱ型，其后在多个省份陆续爆发ASF疫情，至今已对我国养猪业造成了严重的危害。

ASFV是一种大型的虫媒双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，基于编码P72蛋白主要衣壳蛋白的B646L基因的C末端，ASFV可以分成24种不同的基因型，基因组大小约为170kb～190kb，可编码近200个蛋白，其末端含有5个多基因家族，其中MGF505对ASFV的致病性、病毒复制及免疫逃逸有重要作用，有研究表明，ASFV Georgia2007株缺失MGF360和MGF505的6个基因(MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L)可使病毒毒力显著减弱。我国分离的ASFV SY18株在缺失MGF基因的同时缺失CD2v，基因缺失株毒力显著减弱并具有较好的安全性和保护效果。因此，将ASFV基因缺失毒株应用于疫苗开发具有良好的研发和应用前景。

目前，应用于非洲猪瘟的诊断方法主要为：聚合酶链式反应(PCR)，动物接种实验，酶联免疫吸附试验(ELISA)，荧光定量PCR，免疫荧光法，免疫电镜法，间接血凝试验等。PCR及荧光定量PCR检测主要针对ASFV B646L(P72)基因，检测靶标相对单一。以上检测手段，特异性和灵敏性均具有优势，但是这些检测方法的实施需要专业的人员操作，高价的检测设备且检测周期长，因此技术要求相对较高，无法推广使用。与标准实验室检测相比，即时检测(Point of care testing，POCT)对实验室基础设施的依赖程度较低，借助小型的桌面式设备或试剂即可对疾病进行现场快速诊断，具有快速、便捷，检测成本低等优点，且对专业人员要求低，可在实验室以外的现场环境使用。

微流控检测技术近年来在POCT相关领域得到了广泛的应用，微流控芯片又称芯片实验室(Lab-on-a-chip，LOC)，微流控芯片可将常规实验室的样品制备，试剂加样，样本分离，反应进行和结果检测在内的全过程集合在一张几平方厘米的芯片中，自动完成多标靶的分析检测。规模集成、仪器微小化、高通量、节约试剂、操作简单等众多优点使微流控芯片技术特别适用于医学检测、疾病诊断、食品安全、环境监测等多个领域。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)自公布以来便发展迅速，其原理是针对靶基因的6个区域设计4或6种特异引物，利用具有活性的链置换DNA聚合酶，在恒温条件(60℃-65℃)下进行DNA模板的链置换扩增反应。其优点在于反应在等温条件下进行，无需复杂的变温程序；扩增效率高，1h内可达到10¹⁰倍扩增。灵敏度高，比传统PCR高2～5个数量级。微流控芯片和LAMP技术的结合，增加了仪器的便携性，节约了试剂和时间的同时能对多种病原体进行快速检测，展现了其在病毒、细菌、真菌等病原体快速诊断领域的广阔应用前景。

专利文献(CN201820112618.0)公开了一种用于恒温微流控芯片的分析装置，其基于微流控芯片技术，结合LAMP恒温扩增技术，采用荧光检测技术，将加热、离心、恒温扩增、反应、荧光检测及曲线结果显示集成于一个装置，依据可视化结果判断阴阳性，实现即时检测。本发明通过比对Genbank中ASFV所有序列，针对其多基因家族MGF505-2R及CD2v基因设计LAMP引物，建立了一种特异、稳定、灵敏的ASFV基因缺失株及流行株微流控芯片鉴别诊断方法，方法操作简单、便携，可实现ASFV临床样品快速、高效的即时检测。

发明内容

本发明为了克服现有技术中存在的上述问题，首先提供了一种用于鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟病毒流行株的引物组。

本发明的第二个目的是提供一种利用微流控芯片技术鉴别鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟病毒流行株的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种用于鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟病毒流行株的引物组，包括非洲猪瘟病毒MGF505R缺失株LAMP引物、非洲猪瘟病毒CD2v基因缺失株LAMP引物和非洲猪瘟病毒中国流行株LAMP引物，引物序列如SEQ ID NO：1～15所示。

优选的，非洲猪瘟病毒MGF505R缺失株LAMP引物、非洲猪瘟病毒CD2v基因缺失株LAMP引物和非洲猪瘟病毒中国流行株LAMP引物中，外引物F3/B3：内引物FIP/BIP：环引物LB/LF为1：8：4。

本发明还提供一种利用微流控芯片技术鉴别鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟病毒流行株的试剂盒，包括上述的引物组。

优选的，试剂盒还包括微流控芯片、恒温扩增预混液、阳性标准品。

本发明所采用的微流控芯片为圆盘形微流控芯片，该芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为4×8，其包括4个反应检测区，每一反应检测区包括依次连通的进样池、分配池、毛细管微阀、扩增池，进样池通过一弧形通道与分配池连通，进样池中设有进样孔，分配池通过一弧形通道与废液池和排气孔连通；每一反应检测区均设有8个扩增池。

其中进样池的主要功能为装载反应液；分配池的主要作用为均匀分配反应液至扩增池；扩增池具体实现LAMP反应；毛细管微阀主要利用毛细管对液体的阻滞作用，来控制微流控芯片中流体的运动。

进行LAMP反应前，需将引物包被在扩增池上，更优选的，所述引物组各包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LB/LF，引物浓度均为50μM，引物组合物包被的具体步骤如下：将上述的引物组合内每一种引物分别与蔗糖混合，配制成相应的混合溶液，蔗糖和引物组在所述混合液中的终浓度分别为0.5％(质量百分比)和0.15μM；取1.5μL混合液点入微流控芯片相应的扩增池内，于60℃干燥台上干燥，压片封膜，冲压抽真空后，引物组被包被于相应的扩增池中；所述微流控芯片于-20℃保存。

优选的，所述恒温扩增预混液为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶、50μM荧光染料SYBR Green的LAMP反应液。

优选的，所述阳性标准品包括：TASFV-MGF-DNA、TASFV-CD2v-DNA、和TASFV-P72-DNA，制备方法为：通过NCBI查询ASFV基因序列，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成MGF-505-2R、CD2v及P72基因并克隆至PUC57载体。将合成的基因克隆至pGEM-T easy载体并转化、扩增含有目的片段的重组质粒，经菌液PCR以及测序鉴定，将pGEM-T-ASFV-MGF、pGEM-T-ASFV-CD2v、pGEM-T-ASFV-P72质粒线性化后纯化，得到TASFV-MGF-DNA、TASFV-CD2v-DNA、TASFV-P72-DNA待用。

优选的，所述试剂盒进行LAMP反应的体系为：恒温扩增反应液10μL，待检样品的核酸15μL。

优选的，所述试剂盒进行LAMP反应的程序为：1600rpm/min瞬时离心10s以混匀反应液；再4600rpm/min离心30s使液体在离心力作用下流入扩增池内，在37℃下恒温反应20min。反应结束后，按照仪器程序显示顺序，温度设定为63.5℃，低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。反应时间设定为60min。

优选的，微流控芯片检测结果判定：微流控芯片检测分析装置在LAMP反应时实时收集反应池中每个孔位的荧光信号，根据显示屏结果，产生典型“S”型荧光扩增曲线的扩增池为阳性扩增，反之则为阴性。

本发明还利用上述试剂盒进行检测鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟病毒流行株的方法，包括以下步骤：

(1)样本核酸提取；

(2)引物组包被至微流控芯片上；

(3)配置LAMP反应液，并按照微流控反应仪器程序进行反应；

(4)结果判读：

I、若包被ASFV-MGF引物的检测孔、包被ASFV-CD2v引物的检测孔、包被ASFV-P72引物的检测孔均无显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明未检测到非洲猪瘟流行株和CD2v和MGF505R基因缺失毒株。

II、若包被ASFV-MGF引物的检测孔、包被ASFV-CD2v引物的检测孔、包被ASFV-P72引物的检测孔均显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明检测到非洲猪瘟流行毒株。

III、若包被ASFV-MGF引物的检测孔、包被ASFV-P72引物的检测孔显示典型“S”型荧光扩增曲线，包被ASFV-CD2v引物的检测孔未显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明检测到非洲猪瘟CD2v基因缺失毒株。

IV、若包被ASFV-CD2v引物的检测孔、包被ASFV-P72引物的检测孔显示典型“S”型荧光扩增曲线，包被ASFV-MGF引物的检测孔未显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明检测到非洲猪瘟MGF505R基因缺失毒株。

V、若包被ASFV-P72引物的检测孔显示典型“S”型荧光扩增曲线，包被ASFV-MGF引物的检测孔、包被ASFV-CD2v引物的检测孔均未显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明检测到非洲猪瘟CD2v和MGF505R双基因缺失毒株。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过设计并筛选特异性引物，得到一种用于鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的LAMP检测方法,通过结合微流控芯片技术，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的ASFV基因缺失株及流行株微流控芯片鉴别诊断方法；本发明提供的微流控芯片检测方法特异性高，不与猪其他病原交叉反应，且最低检测限可达到10¹copies/μL；本发明提供的鉴别诊断非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的微流控芯片试剂盒，芯片分析装置小巧便携，可以弥补针对ASFV检测耗时、费力、高成本的缺陷，使得检测灵敏度和特异性提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期，满足现场检测的需求；本方法提供的快检技术可推广应用于非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的流行病学调查和疫情监控，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。

附图说明

图1为本发明使用的微流控芯片的结构示意图；其中标记为：反应检测区1；加样池2；扩增池3；毛细管微阀4；分配池5；

图2为本发明使用的微流控芯片包埋示意图；其中的附图标记为：样品检测孔A；阴性对照孔B；

图3为MGF505-2R基因引物组筛选实验结果；

图4为MGF505-2R基因环引物筛选实验结果；

图5为CD2v基因引物组筛选实验结果；

图6为CD2v基因环引物筛选实验结果；

图7为P72基因引物组筛选实验结果；

图8为P72基因环引物筛选实验结果；

图9为非洲猪瘟病毒MGF505-2R基因LAMP检测体系的特异性，所用核酸分别为TASFV-CD2v、TASFV-P72、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪塞内卡病毒，阴性对照；

图10为非洲猪瘟病毒CD2v基因LAMP检测体系的特异性，所用核酸分别为TASFV-MGF、TASFV-P72、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪塞内卡病毒，阴性对照；

图11为非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测体系的特异性，所用核酸分别为TASFV-MGF、TASFV-CD2v、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪塞内卡病毒，阴性对照；

图12为非洲猪瘟病毒MGF505-2R基因LAMP检测体系灵敏性试验；

图13为非洲猪瘟病毒CD2v基因LAMP检测体系灵敏性试验；

图14为非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测体系灵敏性试验；

图15为非洲猪瘟病毒MGF505-2R基因LAMP检测体系的重复性和稳定性试验；

图16为非洲猪瘟病毒CD2v基因LAMP检测体系的重复性和稳定性试验；

图17为非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测体系的重复性和稳定性试验。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1微流控芯片的结构

如图1所示，本发明所采用的微流控芯片为圆盘形微流控芯片，该芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为4×8，其包括4个反应检测区1，每一反应检测区1包括依次连通的进样池2、分配池5、毛细管微阀4、扩增池3，进样池2通过一弧形通道与分配池5连通，进样池2中设有进样孔，分配池5通过一弧形通道与废液池和排气孔连通；每一反应检测区均设有8个扩增池。

其中进样池2的主要功能为装载反应液；分配池5的主要作用为均匀分配反应液至扩增池；扩增池3具体实现LAMP反应；毛细管微阀4主要利用毛细管对液体的阻滞作用，来控制微流控芯片中流体的运动。

实施例2引物筛选

从Genbank数据库中检索获得所有ASFV的全长基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到对应病毒基因组相对保守的靶基因序列。根据所得靶序列，利用PrimerExplorer V5设计出LAMP引物，并进行合成。

将合成的引物溶解后进行引物筛选，筛选过程如下：

1、ASFV-MG505-2R引物筛选

针对ASFV-MG505-2R基因片段设计3组引物，引物序列如下：

第一组：

MG505-2R-F3-1:AGGGTGATCAATATGACCTG；

MG505-2R-B3-1:TCTTCTTGGTATTTTTGGAGAA；

MG505-2R-FIP-1:

CGCGTCTTGAATCAATGGTAAGAATCCATAAGTATGAAAACCAAATCG；

MG505-2R-BIP-1:ATACGTTTGAAAAATGCCACGCAGCATGTTGTATTTTGTAGCA。

第二组：

MG505-2R-F3-2:CCAAAAATACCAAGAAGAGCT；

MG505-2R-B3-2:CCTAAGGAGTACATAGTCAGATC；

MG505-2R-FIP-2:ATACCTCTGCCATAGGCATGCGTCTATGAGAGCGTATCTTCAC；

MG505-2R-BIP-2:TGTCCTTAAATGGATAGAGCAAACCCCTCTTGGAGATGGCAATA。

第三组：

MG505-2R-F3-3:ATCTGACTATGTACTCCTTAGG；

MG505-2R-B3-3:TTCTATGATTGTACTTTACGGC；

MG505-2R-FIP-3:

TGTCTTCTTGAGATGTTGCGTTAGTATTTTCCTTTTTGATAGAGGGAAC；

MG505-2R-BIP-3:CCAAAGGGCTCCTCCACTTTTTGGGTCAGGACGGTATC。

利用上述设计得到的三组引物进行前期筛选，结果如图3，第一、二、三组引物分别在23、30、46分钟产生扩增曲线，选择第一组引物设计环引物进行下一步筛选。

接下来，针对ASFV-MG505-2R第一组引物共设计3组环引物，环引物序列如下：

MG505-2R-LB-1：GAACGTTTTTGTGGTGTTTCATGTC；

MG505-2R-LB-2：CGTTTTTGTGGTGTTTCATGTCTG；

MG505-2R-LB-3：CGTTTTTGTGGTGTTTCATGTCTG。

分别利用筛选得到的第一组引物和3组环引物进行筛选，结果如图4所示，加入环引物后，第1、2、3组环引物分别在21、16、26分钟产生扩增曲线，选择第2组环引物与第一组引物组成引物组。

最终，得到用于鉴别诊断ASFV-MG505-2R的引物组合：

MG505-2R-F3-1:AGGGTGATCAATATGACCTG；

MG505-2R-B3-1:TCTTCTTGGTATTTTTGGAGAA；

MG505-2R-FIP-1:

CGCGTCTTGAATCAATGGTAAGAATCCATAAGTATGAAAACCAAATCG；

MG505-2R-BIP-1:ATACGTTTGAAAAATGCCACGCAGCATGTTGTATTTTGTAGCA；

MG505-2R-LB-1：CGTTTTTGTGGTGTTTCATGTCTG。

2、ASFV-CD2v引物筛选

针对CD2v基因片段设计3组引物，引物序列如下：

第一组：

CD2v-F3-1:GCTTCTTTGAAAGATGGACG；

CD2v-B3-1:CTCATTTTTCGTTTGAATGACAA；

CD2v-FIP-1:

CGGGCCTTCTACAAAAAAATAAAGTATAAAAATCGCCAAAAAATGCTG；

CD2v-BIP-1:TAATCACGTTGCCTATGCAAGCTATGATCTCTAACCATAAGATGCG。

第二组：

CD2v-F3-2:GCCCTTCTACCATTCTGG；

CD2v-B3-2:AAGATGCGTCATAGCAGTA；

CD2v-FIP-2:GGCGATTTTTATAACGTCCATCTTTCCTGTATTGAACGAAAAACCT；

CD2v-BIP-2:ACTTTATTTTTTTGTAGAAGGCCCGTGCATAGGCAACGTGATT。

第三组：

CD2v-F3-3:ATGGTCTTCTCTTTCTGGTAT；

CD2v-B3-3:GAGAGCAATTTTATTTCTAACTCCT；

CD2v-FIP-3:GCGATGAAAGCTTTCCATGAACCTGATAGGTAAAATCTTGGCAAAC；

CD2v-BIP-3:ATTGATCAGTTAAAAACTCCCTCCAGCTAATGCTTATAAGCATACGT。

利用上述设计得到的三组引物进行前期筛选，结果如图5，第一、二组引物分别在28、46分钟产生扩增曲线，第三组引物无特异性扩增反应，选择第一组引物设计环引物进行下一步筛选。

接下来，针对ASFV-CD2v第一组引物共设计3组环引物，环引物序列如下：

CD2v-LB-1:TGACAGTTGGTTTGTTCTCGC；

CD2v-LB-2:ACAGTTGGTTTGTTCTCGCAG；

CD2v-LB-3:CGTTTTTGTGGTGTTTCATGTCTG。

分别利用筛选得到的第一组引物和3组环引物进行筛选，结果如图6所示，加入环引物后，第1、2、3组环引物分别在15、25、35分钟产生扩增曲线，选择第1组环引物与第一组引物组成引物组。

最终，得到用于鉴别诊断ASFV-CD2v的引物组合：

CD2v-F3-1:GCTTCTTTGAAAGATGGACG；

CD2v-B3-1:CTCATTTTTCGTTTGAATGACAA；

CD2v-FIP-1:

CGGGCCTTCTACAAAAAAATAAAGTATAAAAATCGCCAAAAAATGCTG；

CD2v-BIP-1:TAATCACGTTGCCTATGCAAGCTATGATCTCTAACCATAAGATGCG；

CD2v-LB-1:TGACAGTTGGTTTGTTCTCGC。

3、ASFV-P72引物筛选

针对P72基因片段设计3组引物，引物序列如下：

第一组：

P72-F3-1:ACTACTGCGAATACCCCGG；

P72-B3-1:CGGGTTGGTATGGCTGC；

P72-FIP-1:CCTGGCCGACCAAGTGCTTATAGTTCGGATGTCACAACGCT；

P72-BIP-1:TGGAGGGAACTAGTGGCCCTATAGGTTTGCTTTGGTGCGG。

第二组：

P72-F3-2:ACTACTGCGAATACCCCGG；

P72-B3-2:GCACGTTCGCTGCGTATC；

P72-FIP-2:CCTGGCCGACCAAGTGCTTATATTCGGATGTCACAACGCTTG；

P72-BIP-2:TGGAGGGAACTAGTGGCCCTATAGGTTTGCTTTGGTGCGG。

第三组：

P72-F3-3:ACTACTGCGAATACCCCGG；

P72-B3-3:CGGGTTGGTATGGCTGC；

P72-FIP-3:CCTGGCCGACCAAGTGCTTATGTTCGGATGTCACAACGCT；

P72-BIP-3:TGGAGGGAACTAGTGGCCCTATAGGTTTGCTTTGGTGCGG。

利用上述设计得到的三组引物进行前期筛选，结果如图7，第一、二、三组引物分别在33、28、26分钟产生扩增曲线，选择第三组引物设计环引物进行下一步筛选。

接下来，针对ASFV-P72第三组引物共设计3组环引物，环引物序列如下：

P72-LF-1：CTGGGATGCAAAATTTGCGC；

P72-LB-2:CTCCTATGCAACATTCATGATTTGC；

P72-LB-3:GCAACATTCATGATTTGCAC。

分别利用筛选得到的第三组引物和3组环引物进行筛选，结果如图8所示，加入环引物后，第1、2、3组环引物分别在8、13、14分钟产生扩增曲线，选择第1组环引物与第三组引物组成引物组。

最终，得到用于鉴别诊断ASFV-P72的引物组合：

P72-F3-3:ACTACTGCGAATACCCCGG；

P72-B3-3:CGGGTTGGTATGGCTGC；

P72-FIP-3:CCTGGCCGACCAAGTGCTTATGTTCGGATGTCACAACGCT；

P72-BIP-3:TGGAGGGAACTAGTGGCCCTATAGGTTTGCTTTGGTGCGG；

P72-LF-1：CTGGGATGCAAAATTTGCGC。

实施例3试剂盒的组成

本发明所涉及的试剂盒，包括实施例1所述的微流控芯片，实施例2所述的用于鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组和3种对应的LAMP方法阳性标准品，还包括恒温扩增预混液。

所述用于鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组序列包括用于鉴别诊断ASFV-MG505-2R(下文也可以称为ASFV-MGF)的引物、用于鉴别诊断ASFV-CD2v的引物、用于鉴别诊断ASFV-P72的引物。各组内5种引物优选的的摩尔比为外引物F3/B3：内引物FIP/BIP：环引物LB/LF为1：8：4。

通过基因合成、克隆并连接T载、转化、挑单克隆、摇菌、测序鉴定分别得到正确的3种LAMP方法阳性标准品质粒，质粒浓度均为1×10⁹copies/μL。

恒温扩增预混液，为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶和50μM荧光染料SYBR Green的反应液(由上海速创诊断产品有限公司提供)。

实施例4试剂盒鉴别方法

本实施例为采用实施例3所述的试剂盒鉴别检测非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的使用方法。

核酸抽提：按照TIANGEN公司Magnetic Viral DNA/RNA Kit使用说明书进行。

引物组包被：如图2所示，将非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组分别与蔗糖混合，配制成相应的混合液，各引物组和蔗糖在所述混合溶液中的终浓度分别为0.15μM和1.0％(质量百分比)；取1.5μL混合溶液点入微流控芯片相应的扩增池，每一反应检测区设6个对应病毒的检测池，2个阴性对照池，将微流控芯片于60℃干燥台干燥，压片封膜，冲压真空后，引物组被包被于各扩增池。

配制LAMP反应液：10μL恒温扩增预混液，与15μL抽提的待检样品的核酸混合后，转移至对应包被引物组微流控芯片的进样池，进样池封膜，在所述微流控芯片分析装置中(上海速创诊断产品有限公司，型号IGeneTechnoTM SC-MA2000)，1600rpm/min瞬时离心10s以混匀反应液；再4600rpm/min离心30s使液体在离心力作用下流入扩增池内，在37℃下恒温反应20min。反应结束后，按照仪器程序显示顺序，温度设定为63.5℃，低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。反应时间设定为60min。

结果判读：微流控芯片检测分析装置在LAMP反应时实时收集反应池中每个孔位的荧光信号，根据显示屏结果，产生典型“S”型荧光扩增曲线的扩增池为阳性扩增，反之则为阴性。

具体地，将包被ASFV-MGF引物的检测孔记为A孔，将包被ASFV-CD2v引物的检测孔记为B孔，将包被ASFV-P72引物的检测孔记为C孔。

根据仪器上的显示屏结果，判读如下：

I、若A、B、C孔均无显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明未检测到非洲猪瘟流行株和CD2v和MGF505R基因缺失毒株。

II、若A、B、C孔均显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明检测到非洲猪瘟流行毒株。

III、若A、C孔显示典型“S”型荧光扩增曲线，B孔未显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明检测到非洲猪瘟CD2v基因缺失毒株。

IV、若B、C孔显示典型“S”型荧光扩增曲线，A孔未显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明检测到非洲猪瘟MGF505R基因缺失毒株。

V、若C孔显示典型“S”型荧光扩增曲线，A、B孔均未显示典型“S”型荧光扩增曲线，则说明检测到非洲猪瘟CD2v和MGF505R双基因缺失毒株。

实施例5特异性实验

实验步骤如实施例4，待测样本包括TASFV-CD2v、TASFV-P72、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪塞内卡病毒和阴性对照。检测结果如图9，建立的非洲猪瘟病毒MGF505-2R基因LAMP检测方法与其他猪病原不发生交叉反应，故具有良好的检测特异性。

实验步骤如实施例4，待测样本包括TASFV-MGF、TASFV-P72、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪塞内卡病毒和阴性对照。检测结果如图10，建立的非洲猪瘟病毒CD2v基因LAMP检测方法与其他猪病原不发生交叉反应，故具有良好的检测特异性。

实验步骤如实施例4，待测样本包括TASFV-MGF、TASFV-CD2v、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪塞内卡病毒和阴性对照。检测结果如图11，建立的非洲猪瘟病毒P72基因LAMP检测方法与其他猪病原不发生交叉反应，故具有良好的检测特异性。

实施例6灵敏度实验

实验步骤如实施例4，将TASFV-MGF阳性标准品进行10倍系列稀释作为模板进行微流控检测(l×10⁶～l×10⁰copies/μL)，共7个梯度，以确定它们的最低检出限。结果，以TASFV-MGF标准品为模板，微流控的最低检出限为1×10¹copies/μL(图12)。

实验步骤如实施例4，将TASFV-CD2v阳性标准品进行10倍系列稀释作为模板进行微流控检测(l×10⁶～l×10⁰copies/μL)，共7个梯度，以确定它们的最低检出限。结果，以TASFV-CD2v标准品为模板，微流控的最低检出限为1×10¹copies/μL(图13)。

实验步骤如实施例4，将TASFV-P72阳性标准品进行10倍系列稀释作为模板进行微流控检测(l×10⁶～l×10⁰copies/μL)，共7个梯度，以确定它们的最低检出限。结果，以TASFV-P72标准品为模板，微流控的最低检出限为1×10¹copies/μL(图14)。

实施例7重复性和稳定性实验

实验步骤如实施例4，将TASFV-MGF阳性标准质粒10倍系列稀释作为模板进行检测(l×10⁶copies/μL，l×10⁴copies/μL，l×10¹copies/μL)，每个梯度重复8次，对3个梯度的阳性质粒进行重复性检验，结果如图15所示，且CV<5％，表明此方法重复性和稳定性良好。

实验步骤如实施例4，将TASFV-CD2v阳性标准质粒10倍系列稀释作为模板进行检测(l×10⁶copies/μL，l×10⁴copies/μL，l×10¹copies/μL)，每个梯度重复8次，对3个梯度的阳性质粒进行重复性检验，结果如图16所示，且CV<5％，表明此方法重复性和稳定性良好。

实验步骤如实施例4，将TASFV-P72阳性标准质粒10倍系列稀释作为模板进行检测(l×10⁶copies/μL，l×10⁴copies/μL，l×10¹copies/μL)，每个梯度重复8次，对3个梯度的阳性质粒进行重复性检验，结果如图17所示，且CV<5％，表明此方法重复性和稳定性良好。

以上实施例表明，本发明所述的微流控芯片结合LAMP技术用于鉴别检测非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的微流控芯片试剂盒，可快速、准确地鉴别检测ASFV，以弥补针对上述病原检测技术存在的费时费力的缺陷，小巧可携带的仪器可有效降低检测成本和劳动强度，提高灵敏性和特异性，缩短检测周期。可视化的结果判定和简易的操作要求使得本发明适用于科学研究和生产实践中，并可广泛应用于现场即使检测。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种离心式微流控芯片鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组合及试剂盒

<130> ZM211096ZL

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

agggtgatca atatgacctg 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

tcttcttggt atttttggag aa 22

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

cgcgtcttga atcaatggta agaatccata agtatgaaaa ccaaatcg 48

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

atacgtttga aaaatgccac gcagcatgtt gtattttgta gca 43

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

cgtttttgtg gtgtttcatg tctg 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

gcttctttga aagatggacg 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

ctcatttttc gtttgaatga caa 23

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

cgggccttct acaaaaaaat aaagtataaa aatcgccaaa aaatgctg 48

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

taatcacgtt gcctatgcaa gctatgatct ctaaccataa gatgcg 46

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

tgacagttgg tttgttctcg c 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

actactgcga ataccccgg 19

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

cgggttggta tggctgc 17

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 13

cctggccgac caagtgctta tgttcggatg tcacaacgct 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 14

tggagggaac tagtggccct ataggtttgc tttggtgcgg 40

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 15

ctgggatgca aaatttgcgc 20

Claims

1.一种用于鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟病毒流行株的引物组，其特征在于，包括非洲猪瘟病毒MGF505R缺失株LAMP引物、非洲猪瘟病毒CD2v基因缺失株LAMP引物和非洲猪瘟病毒中国流行株LAMP引物，引物序列如SEQ ID NO：1～15所示。

2.根据权利要求1所述的用于鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟病毒流行株的引物组，其特征在于，非洲猪瘟病毒MGF505R缺失株LAMP引物、非洲猪瘟病毒CD2v基因缺失株LAMP引物和非洲猪瘟病毒中国流行株LAMP引物中，外引物：内引物：环引物为1：8：4。

3.一种利用微流控芯片技术鉴别鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟病毒流行株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括微流控芯片、恒温扩增预混液、阳性标准品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片于-20℃保存。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增预混液为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶、50μM荧光染料SYBR Green的LAMP反应液。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品包括：TASFV-MGF-DNA、TASFV-CD2v-DNA、和TASFV-P72-DNA。