CN110982937A - 一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的lamp引物组合物及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸检测、诊断领域，具体涉及一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物及其试剂盒，为解决猪急性腹泻综合征冠状病毒检测耗时、费力、高成本的缺陷，本发明根据SADS‑CoV相对保守的M基因设计LAMP引物，经筛选后得到一种用于猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的LAMP引物组合物；本发明还提供了一种结合微流控芯片技术与LAMP技术的试剂盒及其检测方法，应用于猪急性腹泻综合征冠状病毒的检测中，可实现猪急性腹泻综合征冠状病毒的快速、即时检测，从而解决猪急性腹泻综合征冠状病毒检测耗时、费力、高成本的缺陷，使检测灵敏度和特异性得到提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期。

Description

一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的 LAMP引物组合物及其试剂盒
技术领域
本发明属于核酸检测、诊断领域，具体涉及一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物及其试剂盒。
背景技术
猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)是一种新型冠状病毒，可引起严重的猪急性腹泻综合征(Swine acute diarrheasyndrome，SADS)。SADS-CoV主要引起仔猪的水样腹泻，剧烈呕吐、消瘦和脱水，其中5日龄以下感染仔猪死亡率达90％，8日龄以上感染仔猪死亡率低于5％。研究发现SADS-CoV不与目前猪场流行的3种冠状病毒，如猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)的抗体发生交叉反应，因此现有的猪冠状病毒疫苗对SADS-CoV感染可能无效，一旦大规模暴发可能会给养殖业带来严重的经济损失。
SADS-CoV是甲型冠状病毒属成员，具有典型的冠状病毒结构，病毒表面有突起，直径为100～200nm，基因组为单股正链RNA，全长约27.17kb，包括5′-UTR、3′-UTR，有5个非结构蛋白，分别为ORF1a、ORF1b、NS3a、NS7a和NS7b，4个结构蛋白，分别为刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)。目前，应用于SADS-CoV的诊断方法主要为：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，荧光定量PCR，免疫荧光染色，病原分离鉴定等。以上检测手段，特异性和灵敏性均具有优势，但是这些检测方法的实施需要专业的人员操作，检测设备昂贵且检测周期长，因此技术要求相对较高，无法推广使用。而即时检测(Point of care testing，POCT)可以借助小型的桌面式设备或试剂对疾病进行现场快速诊断，具有快速、便捷，检测成本低等优点，近年来各种POCT检测产品逐步在市场上推广并被接受。
微流控POCT检测技术是近十年发展起来的一种快检技术，微流控芯片又称芯片实验室(Lab-on-a-chip，LOC)，是微流控技术实现的主要平台。微流控芯片将常规实验室的样品制备，试剂加样，样本分离，反应进行和结果检测在内的全过程集合在一张几平方厘米的芯片中，通过芯片内多个独立的反应腔室实现多靶标检测分析，具有便携化、自动化、集成化、低成本、高通量、操作简单等优势，为微流控芯片技术在医学检测、疾病诊断、食品安全、环境监测等多领域内的应用提供了广阔的前景。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的核酸扩增法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4或6种特异引物，利用具有活性的链置换DNA聚合酶，在恒温条件(60℃-65℃)下进行DNA模板的链置换扩增反应。其优点在于反应在等温条件下进行，无需复杂的变温程序；扩增效率高，1h内可达到1010倍扩增。灵敏度高，比传统PCR高2～5个数量级。目前许多研究将环介导等温扩增与微流控芯片结合，从而对病原体、耐药基因位点、肿瘤标记基因等进行快速检测。比如，专利文献(CN201820112618.0)公开了一种用于恒温微流控芯片的分析装置，其基于微流控芯片技术，结合LAMP恒温扩增技术，采用荧光检测技术，将加热、离心、恒温扩增、反应、荧光检测及曲线结果显示集成于一个装置，依据可视化结果判断阴阳性，实现即时检测。
综上可见，将微流控芯片技术与LAMP检测方法相结合，能建立起特异、稳定、灵敏、快速、高效的即时检测体系，在猪急性腹泻综合征冠状病毒的检测方面具有重要的应用价值，有望解决猪急性腹泻综合征冠状病毒检测耗时、费力、高成本的缺陷。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物。
本发明的第二个目的是提供上述采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物在制备猪急性腹泻综合征冠状病毒检测产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒。
本发明的第四个目的是提供上述采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒在制备猪急性腹泻综合征冠状病毒检测产品中的应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物，所述引物组合物包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LB/LF，其中，F3具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，B3具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，FIP具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，BIP具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，LB具有如SEQID NO：5所示的核苷酸序列，LF具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
本发明从Genbank数据库中检索并获得所有SADS-CoV的全长基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到SADS-CoV基因组相对保守的靶基因(M基因)序列，根据M基因序列，利用PrimerExplorer V5软件设计出用于SADS-CoV检测的LAMP引物，经筛选后得到3对用于微流控芯片所需的特异、灵敏的引物组合物，有望为猪急性腹泻综合征冠状病毒的检测提供一种结合微流控芯片技术与LAMP扩增技术的即时检测方法。
本发明还提供了上述采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物在制备猪急性腹泻综合征冠状病毒检测产品中的应用。
本发明还提供了一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒，该试剂盒包括上述的LAMP引物组合物。
优选的，在所述LAMP引物组合物中，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LB/LF之间的摩尔比为1:8:4，所述LAMP引物组合物中的每个引物组分的浓度均为50μM。
优选的，上述试剂盒还包括微流控芯片、恒温扩增预混液、逆转录酶溶液和RNase抑制剂，当然，为提高该试剂盒的适用范围，其他可应用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂也可以包含在本发明中。
优选的，为提高LAMP扩增的效果，所述恒温扩增预混液为含有800U/mL Bst DNA聚合酶和50μM荧光染料SYBR Green的反应液。
优选的，为提高LAMP扩增的效果，所述逆转录酶溶液为M-MLV逆转录酶，所述RNase抑制剂为RNA酶抑制剂；更优选的，所述逆转录酶为浓度为5000U/mL的M-MLV逆转录酶，所述RNase抑制剂为浓度为40U/μL的RNase抑制剂。
优选的，为扩大微流控芯片的检测能力，所述微流控芯片包括8个反应检测区，每个反应检测区包括依次连通的进样池、分配池、毛细管微阀和扩增池，每个反应检测区均设有4个扩增池。
本发明还提供了上述采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒在制备猪急性腹泻综合征冠状病毒检测产品中的应用。具体的，使用上述采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，包括以下步骤：
S1、待检样品核酸抽提：抽提患急性腹泻综合征猪样品的核酸；
S2、LAMP引物组合物的包被：将LAMP引物组合物分别添加到相应的扩增池内，并设置阴性对照，LAMP引物组合物经过加热干燥、压片封膜和冲压真空后被包被在扩增池内；
S3、LAMP反应：将恒温扩增预混液、逆转录酶溶液、RNase抑制剂与待检样品的核酸混合，转移至包被LAMP引物组合物的微流控芯片的进样池中，封膜后放入检测装置中进行LAMP反应；
S4、根据反应后的荧光扩增曲线情况判断阴阳性，若待检样品对应的扩增曲线呈“S”型，且阴性对照无扩增曲线，则判断待检样品为猪急性腹泻综合征冠状病毒阳性样品。
优选的，所述LAMP引物组合物的包被方法，具体为：将LAMP引物组合物中的每个引物组分分别与蔗糖溶液混合，配制成相应的混合溶液，使每个引物组分的摩尔浓度为0.15μM，蔗糖的质量浓度为1.0％，然后将混合溶液添加到微流控芯片的扩增池内，经加热干燥、压片封膜和冲压真空后LAMP引物组合物被包被在扩增池内。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过比对Genbank中SADS-CoV的所有序列，在其相对保守的M基因设计LAMP引物，经筛选后得到一种用于猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的LAMP引物组合物。同时，在上述LAMP引物组合物的基础上，本发明还提供了一种结合微流控芯片技术与LAMP扩增技术的试剂盒，并以该试剂盒建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的猪急性腹泻综合征冠状病毒的检测方法；经特异性、灵敏性、重复性和稳定性试验发现，本发明提供的微流控芯片技术结合LAMP技术的检测方法的特异性高，不与猪其他腹泻病原交叉反应，且最低检测限度可达到103copies/μL，重复性和稳定性均较好，应用于猪急性腹泻综合征冠状病毒的检测中，可以实现猪急性腹泻综合征冠状病毒的快速、即时检测，从而解决猪急性腹泻综合征冠状病毒检测耗时、费力、高成本的缺陷，使检测灵敏度和特异性得到提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期；本方法提供的快检技术可推广应用于猪急性腹泻综合征冠状病毒的流行病学调查和疫情监控中，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例所采用的微流控芯片的结构示意图；
图中的标记为：1-反应检测区；2-加样池；3-扩增池；4-毛细管微阀；5-分配池；
图2为本发明实施例所采用的LAMP引物组合物在微流控芯片中的包被示意图；
图中的标记为：A-样品检测孔；B-阴性对照孔；
图3为微流控芯片技术结合LAMP技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的特异性试验结果；
图4为微流控芯片技术结合LAMP技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的灵敏性试验结果；
图5为微流控芯片技术结合LAMP技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的重复性和稳定性试验结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物的制备
LAMP引物组合物的设计和合成步骤如下：
首先从Genbank数据库中检索获得所有SADS-CoV的全长基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到SADS-CoV基因组相对保守的靶基因(M基因)序列，根据所得靶基因序列，利用PrimerExplorer V5软件设计出LAMP引物组合物，并进行引物合成；
然后对所合成的引物进行筛选，即将合成的引物溶解后进行引物筛选，最终得到用于微流控芯片所需的特异、灵敏的引物组合物。所述引物组合物由外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LB/LF组成，其中，F3具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，B3具有如SEQID NO：2所示的核苷酸序列，FIP具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，BIP具有如SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列，LB具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，LF具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LB/LF的核苷酸序列如下：
F3：CATTTAACCCCGAAACAGAC；
B3：ATAGTCGTGCCAGGTTTG；
FIP：CTGTTGGTGCCACTGGCATA-GCCATTGCTGTCATTTCAG；
BIP：AAGTGGAACACTCTTTTTCGATGG-AGTCACAAATTGCGGTAAG；
LB：GGTATCGAGTAGGATCTACCAAAGA；
LF：GAATTGCTACTGGTGTGCAGCC。
实施例2微流控芯片的结构
如图1所示，本发明所采用的微流控芯片为圆盘形微流控芯片，该芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为8×4，其包括8个反应检测区1，每个反应检测区1包括依次连通的进样池2、分配池5、毛细管微阀4和扩增池3，进样池2通过一弧形通道与分配池5连通，进样池2中设有进样孔，分配池5通过一弧形通道与废液池和排气孔连通；每个反应检测区1均设有4个扩增池3。
其中，进样池2的主要功能为装载反应液；分配池5的主要作用为均匀分配反应液至扩增池3；扩增池3的主要功能为进行LAMP反应；毛细管微阀4主要利用毛细管对液体的阻滞作用，来控制微流控芯片中流体的运动。
实施例3采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒的建立
本发明所涉及的试剂盒，包括实施例1所述的用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物，实施例2所述的微流控芯片，还包括恒温扩增预混液、逆转录酶溶液、RNase抑制剂。
在上述用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物中，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LB/LF之间的摩尔比为1:8:4，所述LAMP引物组合物中的每个引物组分的浓度均为50μM。
上述恒温扩增预混液为含有800U/mL的Bst DNA聚合酶和50μM荧光染料SYBRGreen的反应液(由上海速创诊断产品有限公司提供)。
上述逆转录酶溶液，其溶剂为水，溶质的浓度为5000U/mL。
上述RNase抑制剂，其溶剂为水，溶质的浓度为40U/μL。
实施例4猪急性腹泻综合征冠状病毒LAMP检测方法的阳性标准品的制备
从SADS-CoV阳性病样中抽提RNA，经逆转录成cDNA，利用实施例1中筛选得到的外引物F3/B3做PCR扩增将SADS-CoV-M基因扩增出来，得到与目的片段大小一致的扩增产物。PCR产物回收后，经与pGEM-T easy载体连接、转化、扩增含有目的片段的重组质粒，经菌液PCR以及测序鉴定，将pGEM-T-SADS质粒线性化后纯化，根据体外转录试剂盒RibomaxTMLarge Scale RNA Production Systems(Promega)的说明书进行目的基因的转录，得到猪急性腹泻综合征冠状病毒LAMP检测方法的阳性标准品质粒(TSADS-M-RNA)，质粒的浓度为1×109copies/μL。
实施例5采用实施例3所述的试剂盒检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的使用方法
(1)待检样品核酸抽提：按照TIANGEN公司的Magnetic Viral DNA/RNA Kit核酸提取试剂盒的说明书抽提患急性腹泻综合征猪样品的核酸。
(2)LAMP引物组合物的包被：如图2所示，将用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物中的每个引物组分分别与蔗糖溶液混合，配制成相应的混合溶液，每个引物组分和蔗糖在所述混合溶液中的终浓度分别为0.15μM(摩尔浓度)和1.0％(质量百分比)；取1.5μL混合溶液添加到微流控芯片相应的扩增池3内，每一反应检测区1设2个SADS-CoV检测池，2个阴性对照池，将微流控芯片置于60℃干燥台中进行干燥，压片封膜，冲压真空后，LAMP引物组合物被包被于各扩增池3内。
(3)LAMP反应：取10μL恒温扩增预混液，0.1μL逆转录酶溶液，0.1μL RNase抑制剂与14.8μL抽提的待检样品的核酸混合后，转移至包被引物组合物的微流控芯片的进样池2，进样池2封膜，将准备好的微流控芯片置于带有荧光采集功能的离心机中(上海速创诊断产品有限公司，型号IGeneTechnoTM SC-MA2000)，1600rpm/min瞬时离心10s以混匀反应液；再4600rpm/min离心30s使液体在离心力作用下流入扩增池3内，在37℃下恒温反应20min。反应结束后，按照仪器程序显示顺序，将温度设定为63.5℃，低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10s，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30s，反应时间设定为60min。
(4)结果判读：根据反应后仪器显示的各个扩增池3对应的荧光扩增曲线的情况来判断阴阳性，若待检样品对应的光扩增曲线在显示屏上呈现“S”型，且阴性对照无扩增曲线(即CT值为“0”)，则判断待检样品为猪急性腹泻综合征冠状病毒阳性的样品，否则待检样品中为猪急性腹泻综合征冠状病毒阴性的样品。
实施例6微流控芯片结合LAMP检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的特异性试验
采用实施例5所述的方法进行检测，待测样本包括猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒和阴性对照。检测结果如图3所示。根据图3可以看出，本发明建立的将微流控芯片技术结合LAMP技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法与其他猪病原不发生交叉反应，具有良好的检测特异性。
实施例7微流控芯片结合LAMP检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的灵敏度试验
采用实施例5所述的方法进行检测，将实施例4制备得到的SADS-CoV阳性标准品(TSADS-M-RNA)做10倍梯度稀释后作为模板进行微流控芯片结合LAMP检测，共7个梯度(l×106～l×100copies/μL)，以确定它们的最低检出限度。检测结果如图4所示。根据图4可知，以TSADS-M-RNA标准品为模板，采用微流控芯片技术结合LAMP技术的检测方法的最低检出限度为1×103copies/μL。
实施例8微流控芯片结合LAMP检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的重复性和稳定性试验采用实施例5所述的方法进行检测，将实施例4制备得到的SADS-CoV阳性标准品(TSADS-M-RNA)做10倍梯度稀释后作为模板进行微流控芯片结合LAMP检测，选择3个稀释度进行试验(l×106copies/μL，l×104copies/μL，l×103copies/μL)，每个稀释度重复8次，对这3个稀释度的阳性质粒进行重复性和稳定性检验，结果如图5所示。根据图5可知，每个检测稀释度的组内变异系数(CV)<5％，表明本发明将微流控芯片技术结合LAMP技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法的重复性和稳定性均较好。
以上实施例表明，本发明所述的微流控芯片结合LAMP技术用于猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的引物组合及其试剂盒，可快速、准确地检测出猪急性腹泻综合征冠状病毒，从而弥补了现有的猪急性腹泻综合征冠状病毒检测技术存在的费时费力的缺陷，降低检测成本和劳动强度，提高灵敏性和特异性，缩短检测周期。通过扩增曲线判定检测结果的方式可以满足可视化的要求，使本发明在科学研究和生产实践中具有快速、简易的操作特点，适用于现场的即时检测。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物及其试剂盒
<141> 2019-12-13
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
catttaaccc cgaaacagac 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
atagtcgtgc caggtttg 18
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ctgttggtgc cactggcata gccattgctg tcatttcag 39
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
aagtggaaca ctctttttcg atggagtcac aaattgcggt aag 43
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
ggtatcgagt aggatctacc aaaga 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
gaattgctac tggtgtgcag cc 22

Claims (10)

1.一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LB/LF，其中，F3具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，B3具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，FIP具有如SEQID NO：3所示的核苷酸序列，BIP具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，LB具有如SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列，LF具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP引物组合物在制备猪急性腹泻综合征冠状病毒检测产品中的应用。
3.一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物组合物。
4.根据权利要求3所述的一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，在所述LAMP引物组合物中，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LB/LF之间的摩尔比为1:8:4。
5.根据权利要求3所述的一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，还包括微流控芯片、恒温扩增预混液、逆转录酶溶液和RNase抑制剂。
6.根据权利要求5所述的一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片包括8个反应检测区(1)，每个反应检测区(1)包括依次连通的进样池(2)、分配池(5)、毛细管微阀(4)和扩增池(3)，每个反应检测区(1)均设有4个扩增池(3)。
7.根据权利要求5所述的一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增预混液为含有800U/mL Bst DNA聚合酶和50μM荧光染料SYBR Green的反应液。
8.根据权利要求5所述的一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶溶液为M-MLV逆转录酶。
9.根据权利要求5所述的一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述RNase抑制剂为浓度为40U/μL的RNase抑制剂。
10.权利要求3-9任一项所述的LAMP试剂盒在制备猪急性腹泻综合征冠状病毒检测产品中的应用。
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