CN110184386A - 用于检测anrsv的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和检测方法 - Google Patents

用于检测anrsv的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和检测方法 Download PDF

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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Abstract

本发明涉及生物技术及微生物检测技术领域，特别涉及用于检测ANRSV的RT‑LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法。该检测引物的序列如下：外引物ANRSV‑F3、外引物ANRSV‑B3、内引物ANRSV‑FIP、内引物ANRSV‑BIP。本发明的槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)RT‑LAMP检测体系和检测方法针对病毒基因的6个区域设计特异性和灵敏度高的4条引物，且一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，无需使用热循环仪等仪器，成本低、操作简单、鉴定简便，适用于基础实验室和田间检测。

Description

用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检 测方法
技术领域
本发明涉及生物技术及微生物检测技术领域，特别涉及用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法。
背景技术
槟榔作为我国重要的南药资源之一，是热带高效经济作物。目前，槟榔已经成为中国南方许多省份重要的支柱产业，保证并提高槟榔产量和品质具有重要意义。然而，近年来由于槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)在南方各省的频发和蔓延，造成槟榔产量和品质下降，并有继续恶化的态势，造成严重的经济损失。因此，对于槟榔坏死环斑病毒的鉴定及预防具有相当重要的意义。
ANRSV在各地广泛分布，影响严重，具有危害性强、传播扩散快和难以治愈的特点。植株受到病毒危害后，病毒在寄主细胞内寄生并增殖，破坏干扰植株的正常生理机能，严重影响植株的生长，造成果实品质及产量的下降甚至绝收。病毒的早期准确检测和诊断以及迅速采取行动是控制植物病毒性疾病的关键。
ANRSV是马铃薯Y病毒科成员，基因组全长约10kb，共有HC-Pro1、HC-Pro2、P3、7K、CI、9K、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb及CP十个蛋白，该病毒侵染植物后症状为植株叶片黄化环斑及坏死。目前对植物病毒的检测，多采用传统生物学方法、血清学方法以及分子生物学方法。然而，传统方法耗时长，灵敏度不高，特异性差；血清学方法费用昂贵，操作步骤多，耗时较长，且样品中可能存在与抗体发生非特异性反应的杂质，易出现假阳性结果，因此只适合于初筛；而分子生物学方法由于其特异性强、灵敏度高，是现今应用最多的处于研究前沿的方法。为了适应产业发展需求，有必要开发一种能够更加快速、准确地对该病毒进行分子生物学检测的方法。
环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isotherm alamplificationof DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63)。而逆转录-环介导恒温扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏度是普通RT-PCR的10-100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使RNA的逆转录与LAMP扩增在同一试管中同时完成。与常规PCR相比，RT-LAMP无需模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。可用于准确鉴定田间植株病害，及时监控发病情况，符合产业需求。目前，还未有针对ANRSV的RT-LAMP检测产品。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法。该检测引物假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了RT-LAMP检测引物，引物的序列如下：
外引物ANRSV-F3：序列如SEQ ID NO：1所示；
外引物ANRSV-B3：序列如SEQ ID NO：2所示；
内引物ANRSV-FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；
内引物ANRSV-BIP：序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了该RT-LAMP检测引物在制备槟榔坏死环斑病毒检测试剂中的应用。
本发明还提供了一种槟榔坏死环斑病毒的RT-LAMP检测试剂，包括上述RT-LAMP检测引物。
作为优选，该RT-LAMP检测试剂还包括dNTP、缓冲液、Bst DNA聚合酶、核酸染料、MgSO4及水。
作为优选，该RT-LAMP检测试剂还包括甜菜碱、AMV逆转录酶。
本发明还提供了一种槟榔坏死环斑病毒的RT-LAMP检测方法，采用上述RT-LAMP检测引物对槟榔坏死环斑病毒的RNA进行扩增。
作为优选，模板是RNA时，RT-LAMP检测方法的反应体系如下：
模板是cDNA或质粒时，所述RT-LAMP检测方法的反应体系如下：
优选地，模板是RNA时，RT-LAMP检测方法的反应体系如下：
优选地，模板是cDNA或质粒时，RT-LAMP检测方法的反应体系如下：
作为优选，核酸染料在反应产物中的加入量为0.01μL/μL。
作为优选，RT-LAMP的反应温度为57～65℃，反应时间为30～60min。
优选地，RT-LAMP的反应温度为63℃，反应时间为40min。
作为优选，核酸染料为10000×SYBR Green I。
在本发明中，RT-LAMP检测方法的判断方法为：
反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，待测样品中不含槟榔坏死环斑病毒；
反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，待测样品中含有槟榔坏死环斑病毒。
本发明提供了用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法。该检测引物的序列如下：外引物ANRSV-F3：序列如SEQ ID NO：1所示；外引物ANRSV-B3：序列如SEQ ID NO：2所示；内引物ANRSV-FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；内引物ANRSV-BIP：序列如SEQ ID NO：4所示。本发明具有的技术效果为：
本发明的槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)RT-LAMP检测体系和检测方法针对病毒基因的6个区域设计特异性和灵敏度高的4条引物，且一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，无需使用热循环仪等仪器，成本低、操作简单、鉴定简便，适用于基础实验室和田间检测。
附图说明
图1为实施例2中槟榔坏死环斑病毒检测结果；1泳道：2000 DNA Marker；2-6泳道：5个ANRSV感病样品；7泳道：1个健康槟榔对照样品；
图2为实施例3中槟榔坏死环斑病毒检测结果；1泳道：2000 DNA Marker；2-6泳道：1-5组不同反应体系结果。
具体实施方式
本发明公开了用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于提供一种槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)的RT-LAMP检测体系及检测方法。
本发明所述内容包括4条特异性引物，核苷酸序列如下所示(表1)。
进一步地，本发明的反应体系除上述四条特异引物外由：dNTP、ThermoPolbuffer、甜菜碱、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、MgSO4及水组成；所述核酸染料为10000*SYBR Green I。
本发明还提供了槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)检测方法，其利用RT-LAMP技术，包括以下步骤：
(1)设计并合成引物；
(2)建立RT-LAMP反应体系，其包括1.6μM/μL的外引物ANRSV-F3、B3，0.2μM/μL的内引物ANRSV-FIP、BIP、1*ThermoPol buffer、0.2U/μL AMV逆转录酶、1.4mM/μL的dNTP、0.8M/μL甜菜碱、6mM的MgSO4、0.32U/μL Bst DNA聚合酶、模板DNA>1pg；
(3)LAMP反应：将步骤(2)中的PCR管于57-65℃恒温反应30-60min；
(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入0.01μL/μL核酸染料，根据反应液的颜色判断是否存在槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)。
在本发明的检测方法中，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，待测样品中不含ANRSV；如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，待测样品中含有ANRSV。
本发明的槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)RT-LAMP检测体系和检测方法针对病毒基因的6个区域设计特异性和灵敏度高的4条引物，且一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，无需使用热循环仪等仪器，成本低、操作简单、鉴定简便，适用于基础实验室和田间检测。
本发明提供的用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)侵染性克隆质粒的LAMP实验
(1)实验样品：实验室前期构建的ANRSV侵染性克隆质粒，以及用ddH2O作为阴性对照。
(2)实验试剂:
引物Invitrogen公司合成；Bst DNA聚合酶和10×ThermoPol反应缓冲液购自NEB；AMV逆转录酶购自Takara公司；SYBR Green I和TRIZOL Reagent购自Invitrogen；其余所需试剂购自Sigma。
(3)反应体系的制备：
反应体系(25μL)包括：3.5μL的10mM dNTP、2.5μL的10×ThermoPol buffer、4μL的5M甜菜碱和1.5μL的100mM MgSO4；引物如表1所示；其中ANRSV-FIP、BIP的浓度为0.2μmol/μL，ANRSV-F3、B3的浓度为1.6μmol/μL。8U的Bst DNA聚合酶；模版质粒>1pg；用水补足反应体系。核酸染料：10000×SYBR Green I。
表1引物序列
(4)LAMP反应：
将步骤(3)中PCR管于63℃恒温反应40min；
(5)分析判断反应产物结果：
在(4)中所得反应产物中加入0.25μL的10000×SYBR GreenI并混匀，经肉眼观察：ddH2O反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，样品中不含ANRSV；ANRSV侵染性克隆质粒反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，样品中含有ANRSV。
实施例2：检测实例
(1)实验材料：5个海南海口槟榔病叶(已感染ANRSV)以及1株健康槟榔植株叶片作为对照。
(2)实验试剂：
同上述实施例1所述实验试剂
(3)样品总RNA的提取：使用TRIZOL Reagent试剂提取样品总RNA，具体操作步骤参见试剂说明书。
(4)反应体系的制备：
反应体系(25μL)包括：3.5μL的10mM dNTP、2.5μL的10×ThermoPol buffer、4μL的5M甜菜碱和1.5μL的100mM MgSO 4；引物如表1所示；其中ANRSV-FIP、BIP的浓度为0.2μmol/μL，ANRSV-F3、B3的浓度为1.6μmol/μL。5U的AMV逆转录酶；8U的Bst DNA聚合酶；模版RNA>1pg；用水补足反应体系。核酸染料：10000×SYBR Green I。所述引物序列同实施例1中表1。
(5)LAMP反应：
将步骤(4)中PCR管于63℃恒温反应40min；
(6)分析判断反应产物结果：
在(5)中所得反应产物中加入0.25μL的10000×SYBR GreenI并混匀，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，样品中不含ANRSV；如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，样品中含有ANRSV。
如图1所示：所检测5个样品中均可检测出ANRSV，反应液颜色为绿色，琼脂糖凝胶电泳可跑出清晰梯度型条带。健康植株未检测到ANRSV，结果为阴性，反应液颜色为橙色，琼脂糖凝胶电泳未能跑出任何条带。
实施例3
在本发明研发阶段，曾尝试不同反应条件的实验，以优化反应体系，在此列出以作对照。
(1)实验材料：实验室前期构建的ANRSV侵染性克隆质粒。
(2)实验试剂：
同上述实施例1所述实验试剂
(3)反应体系的制备：
条件1：反应体系(25μL)包括：3.5μL的10mM dNTP、2.5μL的10×ThermoPolbuffer、引物如表1所示；其中ANRSV-FIP、BIP的浓度为0.1μmol/μL，ANRSV-F3、B3的浓度为0.5μmol/μL。8U的Bst DNA聚合酶；模版质粒>1pg；用水补足反应体系。核酸染料：10000×SYBR Green I。所述引物序列同实施例1中表1。
条件2：反应体系(25μL)包括：1μL的10mM dNTP、2.5μL的10×ThermoPol buffer、8μL的5M甜菜碱和5μL的100mM MgSO 4；引物如表1所示；其中ANRSV-FIP、BIP的浓度为0.2μmol/μL，ANRSV-F3、B3的浓度为1.6μmol/μL。8U的Bst DNA聚合酶；模版质粒>1pg；用水补足反应体系。核酸染料：10000×SYBR Green I。所述引物序列同实施例1中表1。
条件3：反应体系(25μL)包括：3.5μL的10mM dNTP、2.5μL的10×ThermoPolbuffer、4μL的5M甜菜碱和1.5μL的100mM MgSO 4；引物如表1所示；其中ANRSV-FIP、BIP的浓度为0.2μmol/μL，ANRSV-F3、B3的浓度为0.2μmol/μL。8U的Bst DNA聚合酶；模版质粒1fg；用水补足反应体系。核酸染料：10000×SYBR Green I。所述引物序列同实施例1中表1。
条件4：反应体系(25μL)包括：2.5μL的10mM dNTP、2.5μL的10×ThermoPolbuffer、2μL的5M甜菜碱和1μL的100mM MgSO 4；引物如表1所示；其中ANRSV-FIP、BIP的浓度为0.2μmol/μL，ANRSV-F3、B3的浓度为1.5μmol/μL。；6U的Bst DNA聚合酶；模版质粒>1pg；用水补足反应体系。核酸染料：10000×SYBR Green I。所述引物序列同实施例1中表1。
条件5：反应体系(25μL)包括：3.5μL的10mM dNTP、2.5μL的10×ThermoPolbuffer、4μL的5M甜菜碱和1.5μL的100mM MgSO 4；引物如表1所示；其中ANRSV-FIP、BIP的浓度为0.2μmol/μL，ANRSV-F3、B3的浓度为1.6μmol/μL。5U的AMV逆转录酶；8U的Bst DNA聚合酶；模版质粒>1pg；用水补足反应体系。核酸染料：10000×SYBR Green I。所述引物序列同实施例1中表1。
(4)LAMP反应：
将步骤(3)中PCR管于63℃恒温反应40min；
(5)分析判断反应产物结果：
在(4)中所得反应产物中加入0.25μL的10000×SYBR GreenI并混匀肉眼观测反应液颜色变化及琼脂糖凝胶电泳检测结果。
如图2所示：在5个组别的反应条件中，前三组反应液颜色为橙色，琼脂糖凝胶电泳未能跑出条带。第四组反应液颜色有所变化，电泳可以跑出较淡梯度型条带。第五组为本发明所述优选条件，反应液颜色为绿色琼脂糖凝胶电泳可跑出清晰梯度型条带。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法
<130> MP1905453
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggaacactc acgaggtg 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcataacttg ttccctgtga t 21
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaactgcag taactttgtg atcaacaatt aaaaggggta tccgtc 46
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagatcctaa ctcaagcaaa ggcattgcca tccgtaagca tt 42

Claims (10)

1.RT-LAMP检测引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
外引物ANRSV-F3：序列如SEQ ID NO：1所示；
外引物ANRSV-B3：序列如SEQ ID NO：2所示；
内引物ANRSV-FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；
内引物ANRSV-BIP：序列如SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述RT-LAMP检测引物在制备槟榔坏死环斑病毒检测试剂中的应用。
3.一种槟榔坏死环斑病毒的RT-LAMP检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述RT-LAMP检测引物。
4.根据权利要求3所述的RT-LAMP检测试剂，其特征在于，还包括dNTP、缓冲液、BstDNA聚合酶、核酸染料、MgSO4及水。
5.根据权利要求4所述的RT-LAMP检测试剂，其特征在于，还包括甜菜碱、AMV逆转录酶。
6.一种槟榔坏死环斑病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于，采用权利要求3至5中任一项所述RT-LAMP检测引物对槟榔坏死环斑病毒的RNA进行扩增。
7.根据权利要求6所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，模板是RNA时，所述RT-LAMP检测方法的反应体系如下：
模板是cDNA或质粒时，所述RT-LAMP检测方法的反应体系如下：
8.根据权利要求7所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述核酸染料在反应产物中的加入量为0.01μL/μL。
9.根据权利要求7所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反应温度为57～65℃，反应时间为30～60min；
所述核酸染料为10000×SYBR Green I。
10.根据权利要求9所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述RT-LAMP检测方法的判断方法为：
反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，待测样品中不含槟榔坏死环斑病毒；
反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，待测样品中含有槟榔坏死环斑病毒。
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