CN103498010B - 快速检测番茄褪绿病毒的引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测番茄褪绿病毒的引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。本发明还公开了一种快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述的上游引物和下游引物，以及常规PCR检测的常规试剂。本发明提供的引物、试剂盒可以用于鉴定番茄褪绿病毒，以及检测待测样品中是否含有番茄褪绿病毒。采用本发明的特异引物或试剂盒检测ToCV，操作简单、快速、结果可靠、特异性强、灵敏度高，非常适合应用在口岸现场检测，对于早期检测诊断、田间疫情调查及进出口岸检测具有重要作用。

Description

快速检测番茄褪绿病毒的引物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程中病毒检测技术及相关领域，尤其涉及快速检测番茄褪绿病毒的特异引物对、试剂盒及其应用。
背景技术
番茄褪绿病毒（Tomato Chlorosis Virus,ToCV）为长线形病毒科下的毛型病毒属成员，主要侵染番茄和辣椒，在农业生产上造成严重危害。该病毒于1998年在佛罗里达州首次报道，然后在法国、意大利、巴西、以色列等世界各地相继发现，可侵染番茄等重要农作物，在番茄上产生的典型症状为叶片脉间发病初期变黄，后期叶片发红，叶脉颜色加深，叶片增厚，极大降低了番茄产量与品质。番茄褪绿病毒可通过多种方式传播，包括种苗调运、粉虱带毒等。
目前，ToCV在中国仅有两份报道，分别为山东和北京，且在山东多个番茄产区都已检测到，并造成番茄减产甚至绝产。因此，如何快速、有效、准确地对番茄褪绿病毒进行检测是亟需解决的问题。
PCR技术具有特异性强、快速、准确等特点，在病原体检测、疾病诊断、法医学鉴定等方面得到了广泛的应用，并且是分子生物学领域常规的方法和手段。PCR技术为快速、准确地检测番茄褪绿病毒提供技术支持，对快速检测番茄褪绿病毒具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种快速检测番茄褪绿病毒的引物，以及试剂盒、检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种快速检测番茄褪绿病毒的引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
一种快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述的上游引物和下游引物，以及常规PCR检测的常规试剂，比如：10×PCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、反转录常规试剂和电泳常规试剂。
上述的快速检测番茄褪绿病毒的引物、快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒可以用于鉴定番茄褪绿病毒，具体应用时，检测方法如下：以待测病毒的cDNA为模板，用所述的快速检测番茄褪绿病毒的引物（SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的上游引物和下游引物）进行PCR扩增，电泳并检测PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中有1074bp的条带，则待测病毒为候选的番茄褪绿病毒；如果PCR扩增产物中没有得到1074bp的条带，则待测病毒为候选的非番茄褪绿病毒。
上述的快速检测番茄褪绿病毒的引物、快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒可以用于检测待测样品中是否含有番茄褪绿病毒，具体应用时，检测方法如下：以待测样品中的待测病毒的cDNA为模板，用所述的快速检测番茄褪绿病毒的引物（SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的上游引物和下游引物）进行PCR扩增，电泳并检测PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中有1074bp的条带，则待测样品中含有番茄褪绿病毒；如果PCR扩增产物中没有得到1074bp的条带，则待测样品中不含有番茄褪绿病毒。
所述待测病毒为番茄褪绿病毒。所述待测样品可为植物样本。所述植物具体可为被番茄褪绿病毒感染的植物（如番茄）。
所述PCR扩增的反应体系由18μLddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、0.5μL 10mmol/L SEQ ID NO.5所示的DNA、0.5μL 10mmol/L SEQ ID NO.6所示的DNA、2.0μL模板和0.5μL 5U/μL Taq DNA polymerase组成；所述PCR的反应条件为：94℃3min；94℃30，58℃30s，72℃70s，30个循环；72℃10min。10×PCR buffer具体购自北京全式金生物技术有限公司。
本发明提供的检测引物、试剂盒，具有快速高效、操作简单、灵敏度高、特异性好的优点，对于早期检测诊断、田间疫情调查及进出口岸检测具有很强适用和应用性。
采用本发明的特异引物或试剂盒检测ToCV，操作简单、快速、结果可靠、特异性强、灵敏度高，非常适合应用在口岸现场检测。本发明的特异引物或试剂盒可用于ToCV口岸检测和田间疫情调查，特别适合农业部门的各检疫检查站、各口岸检验检疫局、植物病毒研究机构等应用。
附图说明
图1为特异性筛选结果，M为Trans 2K Plus DNA Maker，1-5分别为设计的ToCV的5对特异引物对,6-10依次为5对引物的阴性对照。
图2为反应体系中引物对加入量的优化结果，M为Trans 2K PlusDNA Maker，1-4分别为引物的不同加入量：0.5μL、0.8μL、1.0μL、1.5μL，5-8依次为不同引物加入量的阴性对照。
图3为退火温度的优化结果，M为Trans 2K Plus DNA Maker，1-4分别为不同的退火温度：48℃，53.6℃，56℃，58℃，5-8依次为不同退火温度的阴性对照。
图4为特异性检测结果，M为Trans 2K Plus DNA Maker，1-5为田间ToCV感病样品，6为黄瓜花叶病毒（CMV），7为烟草花叶病毒（TMV），8为马铃薯Y病毒（PVY），9为番茄花叶病毒（ToMV），10为阴性对照。
图5为灵敏性检测结果，M为Trans 2K Plus DNA Maker，1-7依次为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7倍浓度的RNA，8为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
PCR仪为TaKaRa PCR扩增仪。ReverseTranscription购自宝生物。EasyTaq酶、10×PCRbuffer、dNTPs和DNA Marker均购自北京全式金生物技术有限公司。
番茄褪绿病毒(Tomato Chlorosis Virus,ToCV)：RNA病毒；参考文献：Complete sequenceof the RNA1 of a European isolate of tomato chlorosis virus.Archives of Virology(2007)152:839-841.
实施例1 特异引物对的设计
根据NCBI上的番茄褪绿病毒的核酸序列设计了五对引物，引物序列如下：
第一对引物：
上游引物：5’-TGCACCGAGAATAAATGAACGT-3’（SEQ ID NO.1所示）；
下游引物：5’-CCAAAGCATCCACCAAAACG-3’（SEQ ID NO.2所示）。
第二对引物：
上游引物：5’-AGAGGACGAGACCGGACAGTATG-3’（SEQ ID NO.3所示）；
下游引物：5’-GCATCCACCAAAACGCAC-3’（SEQ ID NO.4所示）。
第三对引物：
上游引物：5’-TCTGCACCGAGAATAAATGAACG-3’（SEQ ID NO.5所示）；
下游引物：5’-CACCAAAGCATCCACCAAAACG-3’（SEQ ID NO.6所示）。
第四对引物：
上游引物：5’-GCACCGAGAATAAATGAAC-3’（SEQ ID NO.7所示）；
下游引物：5’-CATCGGTGGTAAATTGTACCTAT-3’（SEQ ID NO.8所示）。
第五对引物：
上游引物：5’-TCTGCACCGAGAATAAATGAACG-3’（SEQ ID NO.9所示）；
下游引物：5’-CCACCAAAACGCACGTTG-3（SEQ ID NO.10所示）’。
上述的上游引物和下游引物的靶序列如SEQ ID NO.11所示。
实施例2 特异引物对的筛选
反应体系(25μL)如下：17μL ddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL上游引物、1.0μL 下游引物、2.0μL 模板和0.5μL 5U/μL Taq DNA polymerase。
反应条件为：94℃3min；94℃30，54℃30s，72℃70s，30个循环；72℃10min。
将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。结果表明，只有第三对得到PCR扩增产物(1074bp)并且没有其它杂带出现，而其它四对引物都没有得到PCR扩增产物。
实施例3 特异引物对体系的优化
通过实例2可以筛选出最优的引物为第三对引物，但是第三对引物的核酸电泳图结果还可以进一步优化，所以通过对构建体系的主要影响的两个因素引物浓度和退火温度进行筛选、确定最优检测体系。反应体系(25μL)：
1、引物加入量的优化
A：18μL ddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、0.5μL 上游引物、0.5μL下游引物、2.0μL 模板和0.5μL 5U/μL Taq DNA polymerase；
B：17.4μL ddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、0.8μL 上游引物、0.8μL下游引物、2.0μL 模板和0.5μL 5U/μL Taq DNA polymerase；
C：17μL ddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 上游引物、1.0μL下游引物、2.0μL 模板和0.5μL 5U/μL Taq DNA polymerase；
D：16μL ddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.5μL 上游引物、1.5μL下游引物、2.0μL 模板和0.5μL 5U/μL Taq DNA polymerase。
反应条件为：94℃3min；94℃30，54℃30s，72℃70s，30个循环；72℃10min。
将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。结果表明，四个体系均出现特异条带，但是A体系得到条带最亮，且B、C、D体系出现非特异条带。以上结果说明A体系为最优体系。
2、退火温度的优化
采用上述反应A体系，设置退火温度依次为48℃，53.6℃，56℃，58℃；
将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。结果表明，在设置的四个温度下扩增，均出现特异条带，但是在58℃所得到条带是最亮的。以上结果说明58℃为最优退火温度。
实施例4 特异引物对在辅助鉴定ToCV中的应用及其特异性
用实施例1设计的第三对特异引物对分别鉴定各种病毒（ToCV，CMV，TMV，PVY和ToMV），具体步骤如下：
提取样品病毒的总RNA，反转录为cDNA。
反转录体系(10μL)中，含有模板RNA3.0μL，下游引物1.0μL(10mmol/L)，RNase-FreeH2O2.0μL，5×M-MLV Buffer 2μL，dNTP mixture（10mmol/L）0.5μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200U/μL）0.5μL，RNase Inhibitor（40U/μL）0.25μL。
PCR反应体系：18μL ddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、0.5μL 上游引物、0.5μL 下游引物、2.0μL 模板和0.5μL 5U/μL Taq DNA polymerase；
PCR扩增条件：94℃3min；94℃30，58℃30s，72℃70s，30个循环；72℃10min。
将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。结果表明，只有ToCV得到PCR扩增产物(1074bp)，而其它四种病毒都没有得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行测序，测序结果表明，只有ToCV得到1074bp的PCR扩增产物为ToCV。
实施例5 特异引物对在辅助鉴定ToCV中的灵敏度
番茄褪绿病毒可以使植株死亡、结果延时，损失产量甚至导致绝产。番茄褪绿病毒在番茄叶片的感病表征为：植株下部叶片叶脉间褪绿出现黄色斑点，叶片变厚变脆，后期叶片死亡。以感病番茄作为待测样本进行检测，以健康番茄植株作为对照样本。
1、提取待测样本和对照样本的总RNA。
2、将RNA溶液用10倍浓度梯度稀释至10-7倍，得到各种稀释液。
3、将各个稀释液分别进行反转录，得到cDNA。
4、分别以步骤3得到的7种cDNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物。
PCR扩增体系（25μL）：18μLddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、0.5μL上游引物（SEQ ID NO.5所示）、0.5μL 下游引物（SEQ ID NO.6所示）、2.0μL 所述模板和0.5μL5U/μL Taq DNA polymerase组成。
PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30，58℃30s，72℃70s，30个循环；72℃10min。
将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。结果表明，待测样本各个稀释液的泳道均显示目的条带，即将RNA溶液用水稀释至10-7还能够检测到病毒的存在。

Claims (8)

1.一种快速检测番茄褪绿病毒的引物，其特征在于：该引物包括上游引物和下游引物，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物，以及PCR检测的常规试剂。
3.根据权利要求2所述的快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒，其特征在于：所述PCR检测的常规试剂包括：10×PCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、反转录常规试剂和电泳常规试剂。
4.权利要求1所述的快速检测番茄褪绿病毒的引物、权利要求2所述的快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒在鉴定番茄褪绿病毒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：具体应用时，检测方法如下：以待测病毒的cDNA为模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的上游引物和下游引物进行PCR扩增，电泳并检测PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中有1074bp的条带，则待测病毒为候选的番茄褪绿病毒；如果PCR扩增产物中没有得到1074bp的条带，则待测病毒为候选的非番茄褪绿病毒。
6.权利要求1所述的快速检测番茄褪绿病毒的引物、权利要求2所述的快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒在检测待测样品中是否含有番茄褪绿病毒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：具体应用时，检测方法如下：以待测样品中的待测病毒的cDNA为模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的上游引物和下游引物进行PCR扩增，电泳并检测PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中有1074bp的条带，则待测样品中含有番茄褪绿病毒；如果PCR扩增产物中没有得到1074bp的条带，则待测样品中不含有番茄褪绿病毒。
8.根据权利要求5或7所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系由18μLddH2O、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL 10mmol/L dNTP、0.5μL 10mmol/L SEQ ID NO.5所示的DNA、0.5μL 10mmol/L SEQ ID NO.6所示的DNA、2.0μL模板和0.5μL 5U/μL TaqDNA polymerase组成。
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