CN105779652A

CN105779652A - 一种快速检测4种辣椒病毒的多重rt-pcr方法

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Publication number: CN105779652A
Application number: CN201610229539.3A
Authority: CN
Inventors: 罗明; 韩剑; 张强; 李克梅; 赵冰梅; 张祥林
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2036-04-14
Also published as: CN105779652B

Abstract

本发明涉及一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT‑PCR方法，属病毒检测领域。本发明针对4种病毒核苷酸保守区序列设计并合成了特异性引物对CMV‑F/R，PMMoV‑F/R，BBWV‑F/R，TMV‑F/R，并对影响多重RT‑PCR扩增的引物浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重RT‑PCR体系的优化，建立能从辣椒组织中同时检测CMV，PMMoV，BBWV和TMV四种病毒复合侵染田间样品的检测方法。本发明提供的多重RT‑PCR检测方法，能够快速、准确又简便和经济的检测出辣椒带毒情况，以便尽早采取有效防治措施，对控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。

Description

一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法。

背景技术

辣椒(CapsicumannuumL.)属茄科辣椒属植物，是一种重要的蔬菜作物，不仅可鲜食，还可以加工成各种辣椒产品。由于辣椒种植的经济效益和社会效益好，目前辣椒已成为我国播种面积第二大的蔬菜作物，年栽培面积约133万hm²。但是由于各种病害的影响，我国辣椒的单产相对较低。辣椒病毒病是我国辣椒生产中的首要病害。近年来，全国各辣椒种植区病毒病发生日益严重，成为影响辣椒产量和品质的重要因素。目前世界各地已发现有45种植物病毒能侵染辣椒，多数国家以CMV和TMV发生较普遍。我国已报到的侵染辣椒的病毒毒原主要有黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）、烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）、蚕豆萎蔫病毒（Broadbeanwiltvirus,BBWV）、番茄花叶病毒（Tomatomasaicvirus,ToMV）、辣椒轻斑驳病毒（Peppermildmottlevirus,PMMoV）、辣椒轻驳病毒（Peppermottlevirus,PePMoV）等。其中CMV、PMMoV、BBWV及TMV在我国辣椒产区普遍存在，且常常复合侵染。辣椒病毒病的防治是世界性难题，尽管药剂处理、控制传病介体等方法具有一定减轻和延缓发病的作用，但无法根除。要从根本上解决辣椒病毒的防治问题必须采取有效的预防措施，严格对种苗进行检疫检验和脱毒处理，从源头上杜绝病原，而建立和应用先进的病原检测技术是，是有效控制和预防辣椒病毒病大发生，从而减少经济损失的最有效手段。

分子生物学检测是从核酸水平检测病毒，灵敏度高，特异性强，能克服血清学及其他检测方法中的一些缺点，在大批量的样本检测中较为适用，是目前最具应用前景的病毒检测技术。如RT-PCR技术、核酸杂交技术、双链RNA（dsRNA）电泳技术、环介导等温扩增技术等在病毒检测中的应用日趋广泛。单重RT-PCR是目前应用最广泛的病毒分子生物学检测方法，具有灵敏、快速、特异性强等优点，但单重RT-PCR一个反应只能检测一种病毒，如果反应模板中含有两种以上的病原物，则需进行多次PCR，不但操作复杂，而且费用高，耽误时间。近些年逐渐发展起来的多重PCR(MultiplexPolymeraseChainReaction)，其优点是可以在一种样品中同时鉴别多种病毒，并将PCR的敏感性和快速性结合起来，避免了逐一扩增待测样品中每种病原的麻烦，可提高诊断的敏感性，同时降低检测费用，逐渐被广泛用于病毒病的检测工作中。

目前CMV、PMMoV、BBWV及TMV已建立了单重RT-PCR分子检测技术，但尚未见这4种重要辣椒病毒的多重RT-PCR检测方法的报道。建立稳定灵敏的多重RT-PCR技术，实现在同一反应管中同时对CMV、PMMoV、BBWV及TMV四种病原进行鉴别检测，可提高检测准确性，缩短检测周期，降低检测成本。对于病毒病害的早期准确诊断，种子的检疫检验，从源头上杜绝病原，高效防控辣椒病毒病的发生蔓延具有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，该方法包括辣椒总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板、多重PCR反应和电泳检测确定病毒种类。4种辣椒病毒为黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）、辣椒轻斑驳病毒（Peppermildmottlevirus,PMMoV）、蚕豆萎焉病毒（Broadbeanwiltvirus,BBWV）和烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）。

本发明所述的一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，通过以下步骤实现。

（1）提取植物总RNA

取大约0.1?g新鲜或冷冻的待测辣椒样品在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA。抽提RNA产物加入DEPC-ddH₂O溶解，-70?℃保存备用。

（2）cDNA的合成

以提取的待测辣椒样品的总RNA为模板，反转录制备cDNA模板，反转录体系为20μL包括：RNA模板2μL，2.5mmol/L的dNTPs2μL，10μmol/L的随机引物2μL，10×RTmix2μL，QuantReverseTranscriptase2μL，RNase-freeddH₂O10μL。反应条件：37?℃，60min。

（3）多重PCR扩增

以合成的cDNA为模板，采用下列4对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物。

第1对引物：CMV-F(SEQIDNO.1)/CMV-R(SEQIDNO.2)

SEQIDNO.1：5′-AGTCCGTAAAGTTCCTGC-3′

SEQIDNO.2：5′-TCATGTCGCCAATATCA-3′。

第2对引物：PMMoV-F(SEQIDNO.3)/PMMoV-R(SEQIDNO.4)

SEQIDNO.3：5′-AGAACTCGGAGTCATCGGAC-3′

SEQIDNO.4：5′-GAGTTATCGTACTCGCCACG-3′。

第3对引物：BBWV-F(SEQIDNO.5)/BBWV-R(SEQIDNO.6)

SEQIDNO.5：5′-AAATATTAAAACAAACAGCTTTCGTT-3′

SEQIDNO.6：5′-TTCAAAGCTCGTGCCATNTYATTKGC-3′。

第4对引物：TMV-F(SEQIDNO.7)/TMV-R(SEQIDNO.8)

SEQIDNO.7：5′-AGTTGTTGATGAGTTCATGGA-3′

SEQIDNO.8：5′-GAGGGAAAAACACTATGCGTTATC-3′。

（4）琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物

取5?μLPCR产物在浓度为15?g/L的琼脂糖1×TAE缓冲系统电泳，EB染色后，使用凝胶成像系统观察并摄影记录结果，根据电泳条带图判定病毒种类。若扩增产物中出现170?bp大小的条带，则样品中含有CMV；若扩增产物中出现576?bp大小的条带，则样品中含有PMMoV；若扩增产物中出现390?bp大小的条带，则样品中含有BBWV；若扩增产物中出现796?bp大小的条带，则样品中含有TMV。

所述多重PCR反应中，所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为CMV-F/R0.2?μM，PMMoV-F/R0.2?μM，BBWV-F/R0.1?μM，TMV-F/R0.4?μM。

所述多重PCR扩增反应体系为50μL：包括反转录产物1.0?μL，10×PCRbuffer2.5?μL，25?mmol/L的Mg²⁺3.0?μL，10?μmol/L的引物CMV-F、CMV-R各1.0?μL，10?μmol/L的引物PMMoV-F、PMMoV-R各1.0?μL，10?μmol/L的引物BBWV-F、BBWV-R各0.5?μL，10?μmol/L的引物TMV-F、TMV-R各2.0?μL，2.5?mmol/L的dNTPs2.0?μL，2.5?U/μL的TaqDNA聚合酶0.6?μL，无菌ddH₂O31.9?μL。

所述PCR扩增反应程序为：94?℃预变性4min；94?℃变性45sec，54?℃退火45sec，72?℃延伸1min，循环35次；最后72?℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供能一种快速检测CMV、PMMoV、BBWV和TMV四种病毒的多重RT-PCR方法。所述方法快速、简便、经济、稳定，只需提取待测植株的总RNA，反转录获得cDNA，然后采用本发明提供的引物组合，以cDNA为模板进行PCR反应，最后利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，根据产物大小，即可判断待测植株是否感染这四种病毒，操作简便易行，一份样品只需一次PCR即可对四种病毒进行检测，减少了操作次数，避免了交叉污染，同时还减少了试剂、引物、模板及耗材等的使用量，节约了时间，达到了简便、经济、快速和准确的检测要求。应用该方法对我国新疆辣椒样品进行这四种病毒的检测，结果表明，与单重RT-PCR检测结果一致。

多重PCR反应要求在一个反应体系中进行多个位点，多个基因片断的特异性扩增，但在PCR反应过程中引物间的竞争、非特异性反应和错配的发生率会随着模板和引物种类的增多而增大。如果引物组合不合理，引起引物间的竞争，导致一些靶标条带无法扩增；引物浓度比例搭配不合理会使反应体系产生非特异性条带，也可导致一些靶标条带无法扩增。因此，引物对的筛选，引物浓度的合理配比是多重PCR反应的关键。使用本发明提供的多重PCR检测方法检测待测植株是否感染CMV，PMMoV，BBWV，TMV病毒，优选引物浓度配比为CMV-F/R:PMMoV-F/R:BBWV-F/R:TMV-F/R=1:1:0.5:2。本发明提供的引物组合及其引物配比，能够保证四种病毒的靶标条带均得到有效扩增，并且特异性强，检测结果的准确性高。

此外，其它PCR反应条件如循环退火温度，Mg²⁺浓度，dNTPs浓度，TaqDNA聚合酶浓度等也直接影响产物的扩增。本发明对影响多重PCR反应的主要影响因素进行了优化，建立了最佳反应体系和最佳反应程序。该方法能够检测CMV、PMMoV、BBWV和TMV病毒RNA的灵敏度达到pg级。

本发明提供的快速检测CMV，PMMoV，BBWV，TMV四种病毒的多重RT-PCR方法，具有很强的实用性。利用本发明，对采集于新疆沙湾县安集海镇的疑似辣椒病毒病的11份种子样品和1份阴性样品进行多重RT-PCR检测。结果表明多重RT-PCR检测方法不仅检测到单一PMMoV，BBMV，CMV感染；而且检测到PMMoV与CMV，BBMV与CMV，PMMoV与BBMV，PMMoV与BBMV、CMV，TMV与PMMoV、BBMV、CMV复合感染。因此，采用本发明提供的PCR引物组及多重RT-PCR检测方法，能够快速、准确又简便和经济的检测出辣椒带毒情况，以便尽早采取有效防治措施，对控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。

术语：为了与多重RT-PCR区别，全文将普通RT-PCR命名为单重RT-PCR，普通PCR命名为单重PCR。

附图说明

图1为不同TaqDNA聚合酶浓度对多重RT-PCR扩增结果的影响。图中泳道M为100bpDNALadder，泳道l-8为不同TaqDNA聚合酶用量的多重PCR扩增结果，1：0.25U/μL；2：0.5U/μL；3：0.75U/μL；4：1.0U/μL；5：1.25U/μL；6：1.50U/μL；7：1.75U/μL；8：2.0U/μL。

图2为不同Mg²⁺浓度对多重RT-PCR扩增结果的影响。图中泳道M为100bpDNALadder，泳道1-8为不同Mg²⁺浓度的多重PCR扩增结果，1：0.15mmol/L；2：0.30mmol/L；3：0.60mmol/L；4：0.90mmol/L；5：1.20mmol/L；6：1.50mmol/L；7：1.80mmol/L；8：2.10mmol/L。

图3为不同dNTPs浓度对多重RT-PCR扩增结果的影响。图中泳道M为100bpDNALadder，泳道1-8为不同dNTPs浓度的多重PCR扩增结果，1：0.01mmol/L；2：0.02mmol/L；3：0.04mmol/L；4：0.06mmol/L；5：0.08mmol/L；6：0.10mmol/L；7：0.12mmol/L；8：0.14mmol/L。

图4为4种引物对的不同浓度配比组合对多重RT-PCR扩增结果的影响。图中泳道M为100bpDNALadder，泳道1-9分别为配比1～配比9。

图5为不同退火温度对多重RT-PCR扩增结果的影响。图中泳道M为100bpDNALadder，泳道1-8为不同退火温度下的多重PCR扩增结果，1：52?℃；2：54?℃；3：56?℃；4：58?℃；5：60?℃；6：62?℃；7：64?℃；8：66?℃。

图6为不同RNA浓度对多重RT-PCR检测敏感性测定影响。图中泳道M为100bpDNALadder，泳道1-7分别对应采用10倍梯度稀释的RNA模板即RNA浓度为9?ng/μL～9fg/μL时的扩增情况，泳道8为空白对照。

图7为多重RT-PCR的特异性实验结果。图中泳道M为100?bpDNALadder，泳道1为健康辣椒总RNA，泳道2-5分别为PVA、PVX、PVY、PLRV的总RNA，泳道6为四种病毒CMV，BBWV，PMMoV，TMV复合侵染的辣椒样品总RNA。

图8为单重PCR与多重PCR病毒检测比较。图中泳道M为100?bpDNALadder，泳道1为阴性对照，2-10为四种病毒CMV，BBWV，PMMoV，TMV复合侵染的辣椒样品总RNA，其中泳道2为多重PCR扩增结果，泳道3-10为单重PCR扩增结果。

图9为多重RT-PCR对田间带毒辣椒种子的检测结果。图中泳道M为100?bpDNALadder，泳道1-11为辣椒种子样品1～11，泳道12为空白对照，泳道13为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。

试验药品：植物总RNA提取试剂盒(RNApreppurePlantKit)、反转录试剂盒（TIANscriptRTKit）、三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）、TaqDNA聚合酶、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANgelMidiPurificationKit）购自北京天根生化科技有限公司。

仪器设备：PCR仪（Bio-RadPCR仪），ND-1000核酸/蛋白检测仪（NanoDrop公司）。

试验材料：采集于新疆南、北疆加工型辣椒主要生产区，经DAS-ELISA和RT-PCR扩增、测序鉴定为CMV、BBWV、PMMoV、TMV单独或复合感染的感病辣椒植株、椒果及种子样品为阳性材料，健康辣椒植株、椒果或种子样品为阴性材料。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1.引物的设计与合成

根据文献及GenBank上已报道的CMV、PMMoV、TMV分离物的外壳蛋白（CP）基因序列的保守片段及BBWV5'末端部分基因组非编码区核苷酸序列的保守片段，应用Primer5.0引物设计软件分别设计这4种病毒的特异引物。由于多重PCR要求在同一个退火温度下同时扩增多个目的片段，因此利用软DNAMAN计算引物Tm值，对设计的大量引物进行筛选，选择Tm值较一致的各条引物，保证在同一个退火温度下同时检测到CMV，PMMoV，BBWV和TMV四种病原。详细的病毒特异引物序列见表1，所有的引物由上海生工生物工程公司合成。

表1PCR反应所用特异性引物

实施例2.多重RT-PCR反应体系的建立

1.植物总RNA的提取

2.cDNA的合成

以提取的待测辣椒样品的总RNA为模板，反转录制备cDNA模板。反转录体系为20μL包括：RNA模板2μL，2.5mmol/L的dNTPs2μL，10μmol/L的随机引物2μL，10×RTmix2μL，QuantReverseTranscriptase2μL，RNase-freeddH₂O10μL。反应条件：37?℃，60min。

3.建立并优化多重RT-PCR反应体系及反应程序

（1）混合模板

以含有目的片段的重组质粒PGM-CMV、PGM-PMMoV、PGM-BBWV、PGM-TMV为模版，按1:1:1:1混合作为PCR模板。

（2）多重RT-PCR反应体系及反应程序的初步建立

反应体系总体系为50?μL，其中混合模板1μL，10×PCRbuffer4μL，10μmol/L的正、反向引物CMV-F/R、PMMoV-F/R、BBWV-F/R、TMV-F/R各0.5?μL，2.5mmol/L的dNTPs2μL，2.5U/μL的TaqDNA聚合酶0.8μL，补足ddH₂O至50μL。反应程序为：94?℃预变性4min；94?℃变性45sec，56?℃退火45sec，72?℃延伸1min，循环35次；最后72?℃延伸10min。

（3）多重RT-PCR反应体系及反应条件的优化

在已初步构建的多重RT-PCR扩增体系（50?μL）的基础上，对影响多重RT-PCR反应体系的主要因素：TaqDNA聚合酶浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、各引物对浓度及退火温度等进行优化。其中TaqDNA聚合酶浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度在如下范围内进行优化（见表2）。对各引物对浓度做四因素三水平L₉（3⁴）的正交试验设计（见表3），经筛选获得最优的引物浓度配比。为了明确多重PCR反应的最佳退火温度，实验设置了8个退火温度处理(52?℃，54?℃，56?℃，58?℃，60?℃，62?℃，64?℃和66?℃)，按照试验筛选获得的最佳反应体系进行多重PCR反应。

表2TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs浓度

表3四种引物对浓度正交实验设计

4.PCR产物的电泳分析

取5?μLPCR产物在浓度为15?g/L的琼脂糖1×TAE缓冲系统电泳，EB染色后，使用凝胶成像系统观察并摄影记录结果。

5.结果与分析

（1）多重PCR反应条件筛选

为了确定多重PCR的最优反应条件，分别对TaqDNA聚合酶浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、各引物对浓度及退火温度进行了不同的处理。

结果表明：随着TaqDNA聚合酶用量的增加，所扩增出的目标条带的亮度也逐渐变亮（见附图1），从扩增效果及节约成本角度考虑，TaqDNA聚合酶用量可选用1.5U，即50?μL反应体系中添加2.5U/μL的TaqDNA聚合酶0.6?μL；Mg²⁺浓度对扩增结果有一定的影响（见附图2），随着Mg²⁺浓度的增加，扩增条带的数量及亮度也随之增多、增强，当Mg²⁺终浓度达到1.5mmol/L时，扩增出了所有的目标条带，且目标条带明亮清晰，之后随着Mg²⁺浓度的增加，逐渐出现了非特异性条带及拖尾现象。因此确定Mg²⁺最佳终浓度是1.5mmol/L，即50?μL反应体系中添加25?mmol/L的Mg²⁺3.0?μL；dNTPs对扩增结果有一定的影响（见附图3），随着dNTPs终浓度的增加，扩增出的目的条带数量逐渐增多，且条带的亮度逐渐增强，在浓度达到0.10~0.12mmol/L时，出现明亮的四条目标条带，之后随着所加dNTPs浓度的增大，出现了非特异性的扩增条带。因此，综合扩增效果及经济的因素考虑，最佳dNTPs终浓度为0.10mmol/L，即50?μL反应体系中添加2.5?mmol/L的dNTPs2.0?μL；不同引物对浓度的配比对实验结果影响较大（见附图4），其中配比1、2、3、4、5均出现了非特异性条带或拖尾现象，配比6、8、9扩增条带亮度较暗，而配比7扩增出4条目标条带，且亮而清晰，因此多重PCR反应的最佳引物浓度配比为配比7，即CMV-F/R，PMMoV-F/R，BBWV-F/R和TMV-F/R引物对终浓度分别为0.20?μmol/L，0.20?μmol/L，0.10?μmol/L，0.40?μmol/L，比例为1:1:0.5:2，即50?μL反应体系中分别添加10μmol/L的CMV-F/R，PMMoV-F/R，BBWV-F/R和TMV-F/R1.0?μL，1.0?μL，0.5?μL，2.0?μL?。退火温度对实验结果的影响结果（见附图5），退火温度从52?℃至56?℃各病毒基因扩增条带均清晰可见，其中退火温度为54?℃时扩增片段亮度最佳，而高于56?℃时扩增条带逐渐减少，亮度逐渐变暗。因此最佳退火温度选定为54?℃。

（2）多重RT-PCR最佳反应体系及反应程序的确立

根据不同参数对实验结果的影响，综合考虑实验结果和实验成本，最终优化获得的多重RT-PCR最佳反应体系为50μL：包括反转录产物1.0?μL，10×PCRbuffer2.5?μL，25?mmol/L的Mg²⁺3.0?μL，10?μmol/L的引物CMV-F、CMV-R各1.0?μL，10?μmol/L的引物PMMoV-F、PMMoV-R各1.0?μL，10?μmol/L的引物BBWV-F、BBWV-R各0.5?μL，10?μmol/L的引物TMV-F、TMV-R各2.0?μL，2.5?mmol/L的dNTPs2.0?μL，2.5?U/μL的TaqDNA聚合酶0.6?μL，无菌ddH₂O31.9?μL。

最佳反应程序为：94?℃预变性4min；94?℃变性45sec，54?℃退火45sec，72?℃延伸1min，循环35次；最后72?℃延伸10min。

实施例3.多重RT-PCR反应灵敏度检测

为确定多重RT-PCR检测灵敏度，将含CMV，PMMoV，BBWV和TMV四种病毒复合侵染的植物总RNA(90?ng/μL)依次稀释为10¹～10⁷六个梯度，得到浓度分别为9.0ng/μL、0.9ng/μL、90pg/μL、9.0pg/μL、0.9pg/μL、90fg/μL、9fg/μL的稀释液，并分别以稀释液作为模板，按照实施例2步骤2中的反应体系和程序，反转录获得cDNA，按照最佳反应体系及最佳反应程序进行多重PCR反应。

实验结果如附图6所示，将4种病毒复合侵染的RNA稀释至10⁴倍（浓度9.0pg/μL）仍能扩增出微弱的特异性条带，稀释至10⁵倍则不出现条带，因此，该方法能够检测CMV，PMMoV，BBWV和TMV病毒RNA的检测下限为9.0pg/μL。

实施例4.多重RT-PCR反应特异性检测

为确认本研究设计的CMV、BBWV、PMMoV和TMV的引物对的特异性，分别提取马铃薯A病毒（PotatovirusA,PVA）、马铃薯X病毒（PotatovirusX,PVX）、马铃薯Y病毒（PotatovirusY,PVY）、马铃薯卷叶病毒（Potatoleafrollvirus,PLRV）和复合感染4种病毒（CMV、BBWV、PMMoV、TMV）的辣椒总RNA做模板，以健康辣椒总RNA作为对照，利用建立的多重RT-PCR最佳反应体系和最佳反应程序进行PCR扩增。并对PCR产物进行切胶回收，回收产物与pGM-T载体进行体外连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，再挑取阳性克隆，最后提取质粒送至上海生工生物工程公司进行序列测定。将序列测定结果提交至GenBank数据库中，利用用数据库中的BLAST检索程序进行核酸序列相似性检索（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），鉴定检测的目的片段。

结果表明（如附图7），建立的多重RT-PCR检测方法能够同时检测出CMV、BBWV、PMMoV和TMV4种辣椒病毒，而PVA、PVX、PVY、PLRV以及健康辣椒的检测结果均为阴性。序列相似性分析结果表明，PCR扩增产物均为目的片段，四个病毒基因片段均与GenBank中登录的相应片段一致性较高。上述结果均证明本发明设计的4对引物特异性，建立的检测方法具有可靠性。

实施例5.多重RT-PCR与单重RT-PCR检测效果的比较

提取四种病毒CMV，BBWV，PMMoV，TMV复合侵染的辣椒样品总RNA，反转录获得cDNA为模板，利用建立的多重RT-PCR最佳反应体系和最佳反应程序进行多重PCR反应，并同时按照下列体系和程序进行单重PCR反应，使用表1所列的4对病毒基因引物进行检测。单重PCR反应程序：94?℃预变性4?min；94?℃变性45?sec，55?℃退火45?sec(其中TMV退火温度为53?℃)，72?℃延伸40?sec，循环35次；最后72?℃延伸10?min。4?℃保存。扩增结束后取5?μLPCR产物在浓度为15?g/L的琼脂糖1×TAE缓冲系统电泳，EB染色后，使用凝胶成像系统观察并摄影记录结果。

单重PCR反应体系：

结果如附图8所示，单重PCR(泳道3～10)和多重PCR(泳道2)均扩增出目标条带：170?bp的CMV，576?bp的PMMoV，390?bp的BBWV和796?bp的TMV。结果表明所设计的CMV、PMMoV、BBWV和TMV的特异性引物具有较好的特异性，且各引物之间没有交叉及相互干扰现象，适用于四种病毒的多重RT-PCR检测。

实施例6.多重RT-PCR对田间辣椒样品的病毒检测

利用实施例2建立的多重RT-PCR检测体系及反应程序，对采集于新疆沙湾县安集海镇的疑似辣椒病毒病的11份（每份3粒）种子样品和1份阴性样品进行多重RT-PCR检测。

结果如附图9所示，在11份种子样品中，在样品1中检测到单一PMMoV，在样品3中检测到单一BBMV，在样品4中检测到单一CMV，在样品5，7中同时检测到PMMoV和CMV，在样品6，8，9中同时检测到BBMV和CMV，在样品10中同时检测到PMMoV和BBMV，在样品2中同时检测到PMMoV，BBMV和CMV，在样品11中同时检测到TMV，PMMoV，BBMV和CMV。而阴性对照及空白对照没有扩增出目标条带。实际检测应用的结果证明，该技术能有效检测出带病毒的样品，可靠性、稳定性良好。

<110>新疆农业大学

<120>一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法

<130>

<160>8

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agtccgtaaagttcctgc18

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tcatgtcgccaatatca17

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agaactcggagtcatcggac20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gagttatcgtactcgccacg20

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aaatattaaaacaaacagctttcgtt26

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>nisa,c,g,ort

<400>6

ttcaaagctcgtgccatntyattkgc26

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

agttgttgatgagttcatgga21

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gagggaaaaacactatgcgttatc24

Claims

1.一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，4种辣椒病毒为黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）、辣椒轻斑驳病毒（Peppermildmottlevirus,PMMoV）、蚕豆萎焉病毒（Broadbeanwiltvirus,BBWV）和烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV），其特征在于通过以下步骤实现：

（1）提取植物总RNA

取大约0.1g新鲜或冷冻的待测辣椒样品在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，抽提RNA产物加入DEPC-ddH₂O溶解，-70℃保存备用；

（2）cDNA的合成

以提取的待测辣椒样品的总RNA为模板，反转录制备cDNA模板，反转录体系为20μL包括：RNA模板2μL，2.5mmol/L的dNTPs2μL，10μmol/L的随机引物2μL，10×RTmix2μL，QuantReverseTranscriptase2μL，RNase-freeddH₂O10μL，反应条件：37℃，60min；

（3）多重PCR扩增

以合成的cDNA为模板，采用下列4对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物；

第1对引物：CMV-F/CMV-R

CMV-F：5′-AGTCCGTAAAGTTCCTGC-3′

CMV-R：5′-TCATGTCGCCAATATCA-3′；

第2对引物：PMMoV-F/PMMoV-R

PMMoV-F：5′-AGAACTCGGAGTCATCGGAC-3′

PMMoV-R：5′-GAGTTATCGTACTCGCCACG-3′；

第3对引物：BBWV-F/BBWV-R

BBWV-F：5′-AAATATTAAAACAAACAGCTTTCGTT-3′

BBWV-R：5′-TTCAAAGCTCGTGCCATNTYATTKGC-3′；

第4对引物：TMV-F/TMV-R

TMV-F：5′-AGTTGTTGATGAGTTCATGGA-3′

TMV-R：5′-GAGGGAAAAACACTATGCGTTATC-3′；

（4）琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物

取5μLPCR产物在浓度为15g/L的琼脂糖1×TAE缓冲系统电泳，EB染色后，使用凝胶成像系统观察并摄影记录结果，根据电泳条带图判定病毒种类，若扩增产物中出现170bp大小的条带，则样品中含有CMV；若扩增产物中出现576bp大小的条带，则样品中含有PMMoV；若扩增产物中出现390bp大小的条带，则样品中含有BBWV；若扩增产物中出现796bp大小的条带，则样品中含有TMV。

2.如权利要求1所述的方法，所述多重PCR扩增中，所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为CMV-F/R0.2?μM，PMMoV-F/R0.2?μM，BBWV-F/R0.1?μM，TMV-F/R0.4?μM。

3.如权利要求1所述的一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应体系为50μL：包括反转录产物1.0?μL，10×PCRbuffer2.5?μL，25?mmol/L的Mg²⁺3.0?μL，10?μmol/L的引物CMV-F、CMV-R各1.0?μL，10?μmol/L的引物PMMoV-F、PMMoV-R各1.0?μL，10?μmol/L的引物BBWV-F、BBWV-R各0.5?μL，10?μmol/L的引物TMV-F、TMV-R各2.0?μL，2.5?mmol/L的dNTPs2.0?μL，2.5?U/μL的TaqDNA聚合酶0.6?μL，无菌ddH₂O31.9?μL。

4.如权利要求1所述的一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的反应程序为：94?℃预变性4min；94?℃变性45sec，54?℃退火45sec，72?℃延伸1min，循环35次；最后72?℃延伸10min。