CN107805675B - 一种马铃薯病毒检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种马铃薯病毒检测试剂盒，本发明涉及一种马铃薯病毒检测试剂盒。本发明的目的是为了解决现阶段一步法RT‑PCR检测马铃薯病毒用酶制剂等需特殊条件保存的问题，本发明试剂盒包括试剂和一个反应管；其中试剂为：M‑MLV、RT‑PCRbuffer、DNA聚合酶、dNTP、六种病毒的上下游引物、牛血清白蛋白，Tween 20和甘油；本发明的试剂盒可快速准确的检测出植株中是否存在马铃薯病毒，并且稳定性好，可在常温干燥的条件下进行保存，保存期3个月。本发明应用于马铃薯领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种马铃薯病毒检测试剂盒。
背景技术
我国马铃薯主粮化战略逐步推行，马铃薯种植规模在逐步的增加和扩大，马铃薯病毒病已称为危害马铃薯生产的主要因素之一。当前，马铃薯病毒病的检测是马铃薯生产中极为重视的工作之一，但与之相配套的检测技术却存在周期长，检测结果不准确，易漏检等现象。这些问题使得我国的马铃薯生产长期存在病毒病侵染等问题，进而导致产量下降并造成经济损失。目前，常见的马铃薯病毒检测方法主要包括血清学检测，植株症状分辨，RT-PCR，电子显微镜等，这些方法普遍存在检测效率低下，检测操作流程较为繁琐，假阳性高等问题。一步法RT-PCR是常用的马铃薯病毒检测方法之一，但由于其所用酶制剂等需特殊条件保存，所以未被大量应用于生产。而冷冻干燥技术则是当前应用较多的保存技术。
发明内容
本发明的目的是为了解决现阶段一步法RT-PCR检测马铃薯病毒用酶制剂等需特殊条件保存的问题，提供一种马铃薯病毒检测试剂盒。
本发明一种马铃薯病毒检测试剂盒包括试剂和一个反应管；其中试剂为：M-MLV、RT-PCRbuffer、DNA聚合酶、dNTP、六种病毒的上下游引物、牛血清白蛋白、Tween 20和甘油；其中M-MLV、RT-PCRbuffer、DNA聚合酶、dNTP、每种病毒的上游引物、每种病毒的下游引物、牛血清白蛋白，Tween 20和甘油的体积比是1:12.5:2:2.5:10:10:2:1:1。
本发明试剂盒可以检测植株中6种马铃薯病毒，从而实现对生产中马铃薯植株的快速检测。本发明采用逐层涂布的方式将不同的反应物分别涂布于反应管中，并分别加入稳定剂使各层的反应物可在常温干燥的条件下进行保存，可常温保存3个月以上。使用时仅需加入需检测的植株总RNA和适量的纯净水，即可对植株中的6种马铃薯病毒进行检测，从而实现在生产中马铃薯病毒的快速检测。
附图说明
图1为实施例1的PCR结果琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种马铃薯病毒检测试剂盒包括试剂和一个反应管；其中试剂为：M-MLV、RT-PCRbuffer、DNA聚合酶、dNTP、六种病毒的上游引物、六种病毒的下游引物、牛血清白蛋白、Tween 20和甘油；M-MLV、RT-PCRbuffer、DNA聚合酶、dNTP、六种病毒的上游引物、六种病毒的下游引物、牛血清白蛋白，Tween 20和甘油的体积比是1:12.5:2:2.5:10:10:2:1:1。
本实施方式中六种病毒的上游引物和六种病毒的下游引物的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1-12所示。
结果判定：若试剂盒检测到729bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯S病毒，若检测到711bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯X病毒，若检测到520bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯M病毒，若检测到447bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯Y病毒，若检测到336bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯卷叶病毒，若检测到273bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯A病毒。
本实施方式试剂盒可以检测植株中6种马铃薯病毒，从而实现对生产中马铃薯植株的快速检测。本发明采用逐层涂布的方式将不同的反应物分别涂布于反应管中，并分别加入稳定剂使各层的反应物可在常温干燥的条件下进行保存，可常温保存3个月以上。使用时仅需加入需检测的植株总RNA和适量的纯净水，即可对植株中的6种马铃薯病毒进行检测，从而实现在生产中马铃薯病毒的快速检测。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：M-MLV、RT-PCRbuffer、DNA聚合酶、dNTP、每种病毒的上游引物、每种病毒的下游引物、牛血清白蛋白，Tween20和甘油的体积比是1:12.5:2:2.5:10:10:2:1:1。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方与具体实施方式一或二不同的是：M-MLV的浓度为100U/uL。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：dNTP为10mMeach dNTP。其他与具体实施方式一至三之一不同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：六种病毒分别为马铃薯Y病毒、马铃薯M病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯X病毒和马铃薯卷叶病毒。其他与具体实施方式一至四之一不同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：六种病毒的上下游引物为：
马铃薯S病毒上游引物PVS-F：GAGGCTATGCTGGAGCAGAG；
马铃薯S病毒下游引物PVS-R：AATCTCAGCGCCAAGCATCC；
马铃薯X病毒上游引物PVX-F：ATGTCAGCACCAGCTAGCA；
马铃薯X病毒下游引物PVX-R：TGGTGGTGGTAGAGTGACAA；
马铃薯M病毒上游引物PVM-F：ACATCTGAGGACATGATGCGC；
马铃薯M病毒下游引物PVM-R:TGAGCTCGGGACCATTCATAC；
马铃薯Y病毒上游引物PVY-F：GGCATACGGACATAGGAGAAACT；
马铃薯Y病毒下游引物PVY-R：CTCTTTGTGTTCTCCTCTTGTGT；
马铃薯A病毒上游引物PVA-F：GATGTCGATTTAGGTACTGCTG；
马铃薯A病毒下游引物PVA-R：TCCATTCTCAATGCACCATAC；
马铃薯卷叶病毒上游引物PLRV-F：CGCGCTAACAGAGTTCAGCC；
马铃薯卷叶病毒下游引物PLRV-R：GCAATGGGGGTCCAACTCAT。其他与具体实施方式一至五之一不同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：牛血清白蛋白的浓度为100μg/mL。其他与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：每升RT-PCRbuffer由500mM KCl、100mM Tris-HCl和15mM MgCl2组成。其他与具体实施方式一至七之一不同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：Tris-HCl的pH为8.3。其他与具体实施方式一至八之一不同
为验证本发明的有益效果进行了以下实验：
实施例一：本实施例一种马铃薯病毒检测试剂盒包括试剂和一个反应管；其中试剂为：1uLM-MLV、12.5uLRT-PARbuffer、2uLDNA聚合酶、2.52uLdNTP、六种病毒的上下游引物、2uL牛血清白蛋白，1uLTween 20和1uL甘油；试剂的加入顺序为：向反应管中加入RT-PCRbuffer，均匀涂布于反应管底部，冻干4h,然后向冻干后的反应管中加入六种病毒的上下游引物和dNTP，冻干2h，再将MMLV和DNA聚合酶牛血清白蛋白、Tween20和甘油在4℃的条件下充分混合，然后均匀涂布于反应管底部，再冻干1h。
结果判定：若试剂盒检测到729bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯S病毒，若检测到711bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯X病毒，若检测到520bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯M病毒，若检测到447bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯Y病毒，若检测到336bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯卷叶病毒，若检测到273bp的条带,则证明检测植株感染了马铃薯A病毒。
提取待检测马铃薯植株的总RNA。取4uL提取的总RNA加入反应管中，并使用RNAse-free water补齐至25uL。完成以上操作后，将反应管放入PCR仪中，并按说明书设置反应程序，并等待反应完成。反应完成后PCR产物使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并最终确定是否含有马铃薯病毒。本实施例做了对比试验，其中包括了已感染马铃薯S病毒和Y病毒的阳性对照、试剂盒制备完成后直接检测的PCR结果和使用经1.5个月常温保存后的试剂盒进行检测的PCR结果。试验结果如图1所示，泳道1、3为阳性对照，其中泳道1为试剂盒制备完成后直接检测的阳性对照结果，泳道3为使用经1.5个月常温保存后的试剂盒进行检测的阳性对照结果。泳道2，4则为检测植株样品在试剂盒制备完成和经1.5个月常温保存后的检测结果。由图1可知本实施例均检测出了马铃薯S病毒和Y病毒。说明本实施例的试剂盒可快速准确的检测出植株中是否存在马铃薯病毒，并且稳定性好，可在常温干燥的条件下进行保存。
序列表
<110> 黑龙江省农业科学院克山分院
<120>一种马铃薯病毒检测试剂盒
<160> 12
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVS-F的核苷酸序列。
<400> 1
GAGGCTATGCTGGAGCAGAG 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVS-R核苷酸序列。
<400> 2
AATCTCAGCGCCAAGCATCC 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVX-F核苷酸序列。
<400> 3
ATGTCAGCACCAGCTAGCA 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVX-R核苷酸序列。
<400> 4
TGGTGGTGGTAGAGTGACAA 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVM-F核苷酸序列。
<400> 5
ACATCTGAGGACATGATGCGC 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVM-R核苷酸序列。
<400> 6
TGAGCTCGGGACCATTCATAC 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVY-F核苷酸序列。
<400> 7
GGCATACGGACATAGGAGAAACT 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVY-R核苷酸序列。
<400> 8
CTCTTTGTGTTCTCCTCTTGTGT 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVA-F核苷酸序列。
<400> 9
GATGTCGATTTAGGTACTGCTG 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PVA-R核苷酸序列。
<400> 10
TCCATTCTCAATGCACCATAC 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PLRV-F核苷酸序列。
<400> 11
CGCGCTAACAGAGTTCAGCC 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PLRV-R核苷酸序列。
<400> 12
GCAATGGGGGTCCAACTCAT 20
Claims (6)
1.一种马铃薯病毒检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括试剂和一个反应管；其中试剂为：M-MLV、RT-PCR buffer、DNA聚合酶、dNTP、六种病毒的上游引物、六种病毒的下游引物、牛血清白蛋白、Tween 20和甘油；
所述M-MLV、RT-PCR buffer、DNA聚合酶、dNTP、六种病毒的上游引物、六种病毒的下游引物、牛血清白蛋白、Tween 20和甘油的体积比是1:12.5:2:2.5:10:10:2:1:1；
所述试剂的加入顺序为：向反应管中加入RT-PCR buffer，均匀涂布于反应管底部，冻干4h，然后向冻干后的反应管中加入六种病毒的上下游引物和dNTP，冻干2h，再将M-MLV和DNA聚合酶、牛血清白蛋白、Tween20和甘油在4℃的条件下充分混合，然后均匀涂布于反应管底部，再冻干1h；
所述六种病毒分别为马铃薯Y病毒、马铃薯M病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯X病毒和马铃薯卷叶病毒；
所述六种病毒的上下游引物分别为：
马铃薯S病毒上游引物PVS-F：GAGGCTATGCTGGAGCAGAG；
马铃薯S病毒下游引物PVS-R：AATCTCAGCGCCAAGCATCC；
马铃薯X病毒上游引物PVX-F：ATGTCAGCACCAGCTAGCA；
马铃薯X病毒下游引物PVX-R：TGGTGGTGGTAGAGTGACAA；
马铃薯M病毒上游引物PVM-F：ACATCTGAGGACATGATGCGC；
马铃薯M病毒下游引物PVM-R：TGAGCTCGGGACCATTCATAC；
马铃薯Y病毒上游引物PVY-F：GGCATACGGACATAGGAGAAACT；
马铃薯Y病毒下游引物PVY-R：CTCTTTGTGTTCTCCTCTTGTGT；
马铃薯A病毒上游引物PVA-F：GATGTCGATTTAGGTACTGCTG；
马铃薯A病毒下游引物PVA-R：TCCATTCTCAATGCACCATAC；
马铃薯卷叶病毒上游引物PLRV-F：CGCGCTAACAGAGTTCAGCC；
马铃薯卷叶病毒下游引物PLRV-R：GCAATGGGGGTCCAACTCAT。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯病毒检测试剂盒，其特征在于M-MLV的浓度为100U/μL。
3.根据权利要求1所述的一种马铃薯病毒检测试剂盒，其特征在于dNTP为10mM eachdNTP。
4.根据权利要求1所述的一种马铃薯病毒检测试剂盒，其特征在于牛血清白蛋白的浓度为100μg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种马铃薯病毒检测试剂盒，其特征在于每升RT-PCR buffer由500mM KCl、100mM Tris-HCl和15mM MgCl2组成。
6.根据权利要求5所述的一种马铃薯病毒检测试剂盒，其特征在于Tris-HCl的pH为8.3。
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