CN112557656B - 同步检测多种马铃薯病毒的试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条及其制备方法和应用，试纸条包括样品垫、金标垫、NC膜、检测线T1‑T6线、质控线C线、吸水垫和PVC底板；其制备方法包括金标垫的制备、NC膜的制备、样品垫的制备、试纸条的组装四个步骤；具体应用检测步骤为：样品处理、滴加样品、结果判读等步骤；马铃薯病毒包括PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA。本发明可以同步检测6种马铃薯病毒，灵敏度高，特异性强，准确度高，稳定性强，而且大大缩短了检测时间，降低了检测成本，提高了检测效率，可快速检测出马铃薯病毒病发生情况，为马铃薯种苗的脱毒和马铃薯的生产提供了高效可靠的病毒检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及利用免疫层析技术检测植物病毒技术领域，具体涉及同步检测多种马铃薯病毒的试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种可以同步检测6种马铃薯病毒的试纸条，大大缩短了检测时间，降低了检测成本，提高了检测的准确度和检测效率，可快速检测出马铃薯病毒病发生情况，为马铃薯种苗的脱毒和马铃薯的生产提供了高效可靠的病毒检测手段。
本发明的目的之一在于提供一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，是通过以下技术方案实现的：
一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，包括样品垫1、金标垫2、NC膜3、检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10、质控线C线11、吸水垫4和PVC底板12，所述PVC底板12的上部贴合有NC膜3，所述NC膜3上部两端分别搭接有金标垫2和吸水垫4，所述金标垫2上部搭接有样品垫1，所述检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10依次设置在靠近的NC膜3表面上，且检测线T1线5距离样品垫1最近，检测线T6线10距离样品垫1最远，所述质控线C线11设置在靠近吸水垫4的NC膜3上。
所述检测线T1线5包被有PLRV兔多克隆抗体,所述PLRV兔多克隆抗体划膜浓度为0.5-1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PLRV兔多克隆抗体溶液浓度为1.8-2.5mg/mL；
所述检测线T2线6包被有PVA兔多克隆抗体, 所述PVA兔多克隆抗体划膜浓度为0.5-1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVA兔多克隆抗体溶液浓度为1.5-2.0mg/mL；
所述检测线T3线7包被有PVM羊多克隆抗体, 所述PVM羊多克隆抗体划膜浓度为0.5-1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVM羊多克隆抗体溶液浓度为0.5-1.5mg/mL；
所述检测线T4线8包被有PVS羊多克隆抗体, 所述PVS羊多克隆抗体划膜浓度为0.5-1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVS羊多克隆抗体溶液浓度为0.5-1.5mg/mL；
所述检测线T5线9包被有PVY兔多克隆抗体, 所述PVY兔多克隆抗体划膜浓度为0.6-1.0µL/cm,所述用来进行划膜的PVY兔多克隆抗体溶液浓度为0.5-1.5mg/mL；
所述检测线T6线10包被有PVX兔多克隆抗体, 所述PVX兔多克隆抗体划膜浓度为0.6-1.0µL/cm,所述用来进行划膜的PVX兔多克隆抗体溶液浓度为0.5-1.5mg/mL；
所述质控线C线11上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体；所述包被在质控线C线11上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为0.5-1.2µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为0.8-1.5mg/mL；
所述金标垫2上结合有马铃薯病毒胶体金标记物混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物为PVA胶体金标记物、PVM胶体金标记物、PVS胶体金标记物、PVX胶体金标记物、PVY胶体金标记物和PLRV胶体金标记物的混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物溶液的喷涂浓度为4-6µL/cm；
而且，试纸条外部还设有卡壳13，所述卡壳13上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔14，所述卡壳13上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽15。
而且，所述马铃薯快速检测试纸条长度为56-73mm,所述样品垫1的长度为16mm-18mm,所述金标垫2的长度为8mm-12mm，所述NC膜3的长度为24mm-28mm，所述吸水垫4的长度为16mm-20mm；所述NC膜3与金标垫2搭接的长度为1-2mm，所述NC膜3与吸水垫2搭接的长度为2-3mm，所述金标垫2与样品垫1搭接的长度为2-3mm，所述质控线C线11与吸水垫4的距离为2-3.5mm，所述检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10之间的距离为2.5-3.5mm，所述检测线T1线5与金标垫2之间的距离为3-4.5mm，检测线T6线10和质控线C线11距离为2-4mm。
而且，所述马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVA羊抗兔抗体、PVM羊抗兔抗体，PVS羊抗兔抗体，PVX羊抗兔抗体，PVY羊抗兔抗体和PLRV羊抗兔抗体中的任意一种。
本发明的目的之二是提供一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条制备方法，是通过以下技术方案实现的：
一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条制备方法，包括如下步骤：
步骤1：金标垫2的制备：
1) 马铃薯病毒胶体金标记物的制备：
复溶液配方：PH8.0-8.8，8-12%蔗糖，3-6%海藻糖，0 .5-2%牛血清白蛋白，溶剂为0.1- 0.2mol/L的 Tris-HcL溶液；
胶体金溶液的制备：取297-300 mL超纯水于圆底烧瓶中，加入2-4 mL浓度为1-2%氯金酸溶液，混匀；将圆底烧瓶置于恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；一次性加入2-4mL1-2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；观察溶液颜色变化，由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当变为酒红色时，继续煮沸20-30min，补充超纯水至原体积，停止加热，冷却至室温；超纯水做空白对照， 扫描胶体金溶液在500-550nm 之间的吸收值，吸收峰值在515-525nm出现，则制备的胶体金溶液合格；
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K1，加入1-2ml胶体金溶液，然后加入4-6µL PVX兔多克隆抗体、4-6µL PVY兔多克隆抗体、4-6µLPVS羊多克隆抗体、4-6µL PVM羊多克隆抗体，再加入1.5-3µL 0.1mol/L的K2CO3，，混匀后静置25-35min；另取2支离心管，标记为K2和K3，分别加入1-2ml 胶体金溶液，K2中加入4-6µL PLRV兔多克隆抗体和0.5-1.5µL 0.2mol/L的K2CO3，K3中加入4-6µL PVA兔多克隆抗体和0.5-1.5µL0.2mol/L的K2CO3，混匀后震荡25-35min；向K1、K2和K3中分别加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在9000-12000rpm， 4℃条件下，离心45-55min ，弃上清，向K1、K2和K3分别加入80-120µL封闭剂，在9000-12000rpm ，4℃条件下，离心25-35min ，分别弃上清，向K1中加入80-120µL 复溶液悬浮沉淀，悬浮好后将K1中的悬浮液转入到K2中，在K2中悬浮沉淀，最后将K2中的悬浮液转入K3中，在K3中悬浮沉淀，随后将K3在 400-600rpm，4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
2）金标垫2与马铃薯病毒胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫2的支撑材料，将制备好的马铃薯病毒胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂马铃薯病毒胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL/cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间1.5-2.5h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃热合封口，保存备用；
步骤2：NC膜的制备：
1）检测线T1线5的制备：用缓冲液稀释待包被PLRV兔多克隆抗体至1.8-2.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV兔多克隆抗体划膜到距离金标垫2 3-4.5mm处NC膜3上，以0.5-1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T1线5；
2）检测线T2线6的制备：用缓冲液稀释待包被PVA兔多克隆抗体至1.5-2.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA兔多克隆抗体划膜到距离检测线T1线5 2.5-3.5mm处NC膜3上，以0.5-1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T2线6；
3）检测线T3线7的制备：用缓冲液稀释待包被PVM羊多克隆抗体至0.5-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM羊多克隆抗体划膜到距离检测线T2线6 2.5-3.5mm处NC膜3上，以0.5-1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T3线7；
4）检测线T4线8的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊多克隆抗体至0.5-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊多克隆抗体划膜到距离检测线T3线 7 2.5-3.5mm处NC膜3上，以0.5-1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T4线8；
5）检测线T5线9的制备：用缓冲液稀释待包被PVY兔多克隆抗体至0.5-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY兔多克隆抗体划膜到距离检测线T4 线8 2.5-3.5mm处NC膜3上，以0.6-1.0µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T5线9；
6）检测线T6线10的制备：用缓冲液稀释待包被PVX兔多克隆抗体至0.5-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX兔多克隆抗体划膜到距离检测线T5线9 2.5-3.5mm处NC膜3上，以0.6-1.0µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T6线10；
7）质控线C线11的制备：用缓冲液稀释待包被马铃薯病毒羊抗兔抗体至0.8-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将马铃薯病毒羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫4 2-3.5mm处NC膜3上，以0.5-1.2µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜3上，构成质控线C线11；检测线T6线10和质控线C线11距离为2-4mm；
8）NC膜3的封装：将划有检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10和质控线C线11的NC膜3置于35-40℃条件下烘干，封装备用；
9）缓冲液是pH值为7.0-7.4的PB溶液；
步骤3：样品垫1的制备：
选用玻璃纤维膜做为制备样品垫1的材料，玻璃纤维膜经处理后方可使用；
玻璃纤维膜的处理步骤：戴手套，将玻璃纤维膜放入处理液中，完全浸泡，浸泡5-15min ,后取出脱水2-4min，平置在筛网上，放入35-40℃干燥箱，烘干至湿度恒定在15-25%，烘干3-5h，将烘干后的玻璃纤维膜加干燥剂后装入铝箔袋热封保存；
处理液的配方：PH7.8-8.0磷酸缓冲液，0.5-1.5%S9表面活性剂溶液，0.4-0.5%吐温20，0.5-1.5%牛血清白蛋白，0.1-0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶剂为水；
步骤4：试纸条的组装：
把步骤1-3所制作完成材料，根据PVC底板12的规格切割成一定的长度和宽度，粘贴 PVC底板12上并安装在卡壳13里；
试纸条的组装步骤：
1）将NC膜3非点样面粘贴在PVC底板12上；
2）将金标垫2搭接在NC膜3一端的上方，搭接长度为1-2mm；
3）将吸水垫4搭接在NC膜3另一端的上方，搭接长度为2-3mm；
4）将样品垫1搭接在金标垫2的上方，搭接长度为2-3mm；
5）在斩切机中将粘贴好的PVC底板12剪切成条，试纸条长度为56-73mm,宽度为30-40mm；
6）将试纸条装入卡壳13，并和干燥剂一同装入铝箔袋，密封后贴上标签。
本发明的目的之三在于提供一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条的应用，是通过以下 技术方案实现的：
1）样品处理：取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:8-1:10的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.4-7.8；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫（1）上，静置4-6min，观察检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6 线（10）和质控线C线（11）；
2）结果判读：当质控线C线（11）显现紫红色，检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6 线（10）中的一条或几条线显现紫红色，检测结果为阳性，马铃薯样品中含有呈现紫红色的检测线所对应的病毒；
当质控线C线（11）显现紫红色，检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6 线（10）均不显现紫红色；检测结果为阴性，马铃薯样品中不含有检测线所对应的病毒；
当质控线C线（11）不显现紫红色或其他现象，提示试纸条失效。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明提供一种可同步检测6种马铃薯病毒的试纸条，大大缩短了检测时间，降低了检测成本，提高了检测的准确度，提高了检测效率，可快速检测出马铃薯病毒病发生情况，为马铃薯种苗的脱毒和马铃薯的生产提供了高效可靠的病毒检测手段。
2、本发明经研究确定了检测线T1线包被PLRV兔多克隆抗体、T2线包被PVA兔多克隆抗体、T3线包被PVM羊多克隆抗体、T4线包被PVS羊多克隆抗体、T5线包被PVY兔多克隆抗体、T6 线包被PVX兔多克隆抗体，解决了同时检测时不同的病毒相互影响的问题，可精准的对马铃薯感染的病毒作出判断，为马铃薯脱毒、种薯级别定级和马铃薯病毒病的防控提供了检测手段。
3、本发明使用方便，适用性强，灵活度高，无需实验室、不需要任何特殊仪器、无需专业人员操作培训、田间地头、马铃薯贮藏窖、海关等任何有马铃薯的地方即可测试，每个马铃薯种植者均会使用。
4、本发明经反复实验，确定了6种马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺，首次利用6种马铃薯病毒抗体混合物制备胶体金标记物，明确了制备工艺参数，为马铃薯病毒同步检测奠定了理论和实践依据。
5、本发明检测时间短，仅需4-6分钟，即可出检测结果，大大节省了检测时间，为马铃薯病毒快速检测体系的建立提供理论和实践基础。
6、本发明灵敏度高：一片马铃薯叶子样品即可用于检测，试纸条检测马铃薯样品的马铃薯病毒最低检测浓度为1ng/mL。
7、本实用新型准确度高，特异性强，使用本实用新型提供的试纸条检测马铃薯病毒与使用检测单一病毒的马铃薯检测试纸条（需分别使用6种病毒的6只试纸条）及用国内外通用的酶联免疫吸附实验法检测马铃薯样品的实验结果完全吻合，准确率高达100%，不会发生假阳性结果。
8、本发明稳定性强：将试纸条放在内放干燥剂的密封铝箔袋中，室温和37℃下保存长时间后颜色略减弱，其他不同温度、不同时间的测试结果无明显变化，说明在适当条件下保存，本试纸条具有较好的稳定性。
9、本发明检测结果易判定，当质控线为紫红色时，可直接通过检测线所代表的马铃薯病毒判定马铃薯是否感染以及感染哪类病毒，为马铃薯病毒快速确定提供了理论基础。
附图说明
图1本发明主视图（未画卡壳）；
图2为图1左视图；
图3本发明卡壳结构示意图；
图4中为阳性结果示意图；
图5中为阴性结果示意图；
图6中为试纸条失效示意图；
图7中为马铃薯病毒快速检测试纸条准确性实验结果示意图。
图中：1样品垫，2金标垫，3 NC膜，4吸水垫，5检测线T1线，6检测线T2线，7检测线T3线，8检测线T4线，9检测线T5线，10检测线T6线，11质控线C线,12 PVC底板，13 卡壳，14 加样孔，15 观察槽。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保护范围。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所使用的PLRV兔多克隆抗体、PVA兔多克隆抗体、PVM羊多克隆抗体、PVS羊多克隆抗体、PVY兔多克隆抗体、PVX兔多克隆抗体和马铃薯病毒羊抗兔抗体从北京中检葆泰生物技术有限公司购置；
实施例1
同步检测多种马铃薯病毒的试纸条及其制备方法和应用，具体包括以下步骤：
一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，包括样品垫1、金标垫2、NC膜3、检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10、质控线C线11、吸水垫4和PVC底板12，所述PVC底板12的上部贴合有NC膜3，所述NC膜3上部两端分别搭接有金标垫2和吸水垫4，所述金标垫2上部搭接有样品垫1，所述检检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10依次设置在靠近样品垫1的NC膜3表面上，且检测线T1线5距离样品垫1最近，检测线T6线10距离样品垫1最远，所述质控线C线11设置在靠近吸水垫4的NC膜3上。
所述检测线T1线5包被有PLRV兔多克隆抗体,所述PLRV兔多克隆抗体划膜浓度为0.7µL/cm,所述用来进行划膜的PLRV兔多克隆抗体溶液浓度为2mg/mL；
所述检测线T2线6包被有PVA兔多克隆抗体,所述PVA兔多克隆抗体划膜浓度为0.6µL/cm,所述用来进行划膜的PVA兔多克隆抗体溶液浓度为1.6mg/mL；
所述检测线T3线7包被有PVM羊多克隆抗体,所述PVM羊多克隆抗体划膜浓度为0.5µL/cm,所述用来进行划膜的PVM羊多克隆抗体溶液浓度为1.0mg/mL；
所述检测线T4线8包被有PVS羊多克隆抗体, 所述PVS羊多克隆抗体划膜浓度为0.5µL/cm,所述用来进行划膜的PVS羊多克隆抗体溶液浓度为1.0mg/mL；
所述检测线T5线9包被有PVY兔多克隆抗体, 所述PVY兔多克隆抗体划膜浓度为0.6µL/cm,所述用来进行划膜的PVY兔多克隆抗体溶液浓度为1.0mg/mL；
所述检测线T6线10包被有PVX兔多克隆抗体, 所述PVX兔多克隆抗体划膜浓度为1.0µL/cm,所述用来进行划膜的PVX兔多克隆抗体溶液浓度为1.0mg/mL；
所述质控线C线11上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体；所述包被在质控线C线11上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为0.6µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为1.0mg/mL；
所述金标垫2上结合有马铃薯病毒胶体金标记物混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物为PVA胶体金标记物、PVM胶体金标记物、PVS胶体金标记物、PVX胶体金标记物、PVY胶体金标记物和PLRV胶体金标记物的混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物溶液的喷涂浓度为5µL/cm；
本实施中，如图3所示，马铃薯病毒快速检测试纸条外部还设有卡壳13，所述卡壳13上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔14，所述卡壳13上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽15。
本实施中，所述马铃薯快速检测试纸条长度为57mm,所述样品垫1的长度为16mm,所述金标垫2的长度为8mm，所述NC膜3的长度为24mm，所述吸水垫4的长度为16mm；所述NC膜3与金标垫2搭接的长度为2mm，所述NC膜3与吸水垫4搭接的长度为2mm，所述金标垫2与样品垫1搭接的长度为3mm，所述质控线C线11与吸水垫4的距离为2mm，所述检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10之间的距离为2.6mm，所述检测线T1线5与金标垫2之间的距离为3mm，检测线T6线10和质控线C线11距离为2mm。
本实施中，所述马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVA羊抗兔抗体。
上述试纸条的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：金标垫2的制备：
1)马铃薯病毒胶体金标记物的制备：
复溶液配方：PH8.5，10%蔗糖，5%海藻糖，1%牛血清白蛋白，溶剂为0.2mol/L的Tris-HcL溶液；
胶体金溶液的制备：取297mL超纯水于圆底烧瓶中，加入3mL浓度为1%氯金酸溶液，混匀；将圆底烧瓶置于恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；一次性加入3.6mL1%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；观察溶液颜色变化，由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当变为酒红色时，继续煮沸25min，补充超纯水至原体积，停止加热，冷却至室温；超纯水做空白对照，扫描胶体金溶液在500-550nm之间的吸收值，吸收峰值在515-525nm出现，则制备的胶体金溶液合格；
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K1，加入1ml胶体金溶液，然后加入5µLPVX兔多克隆抗体、5µLPVY兔多克隆抗体、5µLPVS羊多克隆抗体、5µLPVM羊多克隆抗体，再加入2µL0.1mol/L的K2CO3，，混匀后静置30min；另取2支离心管，标记为K2和K3，分别加入1ml胶体金溶液，K2中加入5µLPLRV兔多克隆抗体和1.0µL0.2mol/L的K2CO3，K3中加入5µLPVA兔多克隆抗体和1.0µL、0.2mol/L的K2CO3，混匀后震荡30min；向K1、K2和K3中分别加入100µL封闭剂，静置30min,在10000rpm，4℃条件下，离心50min，弃上清，向K1、K2和K3分别加入100µL封闭剂，在10000rpm，4℃条件下，离心30min，分别弃上清，向K1中加入100µL复溶液悬浮沉淀，悬浮好后将K1中的悬浮液转入到K2中，在K2中悬浮沉淀，最后将K2中的悬浮液转入K3中，在K3中悬浮沉淀，随后将K3在500rpm，4℃条件下离心15min，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
2）金标垫2与马铃薯病毒胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫2的支撑材料，将制备好的马铃薯病毒胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂马铃薯病毒胶体金标记物的最佳喷涂浓度为5µL/cm，将喷好的玻璃纤维膜置于37℃干燥箱中，干燥时间2h，取出，放入铝箔袋中，210℃热合封口，保存备用；
步骤2：NC膜的制备：
1）检测线T1线5的制备：用缓冲液稀释待包被PLRV兔多克隆抗体至2.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV兔多克隆抗体划膜到距离金标垫3mm处NC膜3上，以0.7µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T1线5；
2）检测线T2线6的制备：用缓冲液稀释待包被PVA兔多克隆抗体至1.6mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA兔多克隆抗体划膜到距离检测线T1线5 2.6mm处NC膜上，以0.6µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T2线6；
3）检测线T3线7的制备：用缓冲液稀释待包被PVM羊多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM羊多克隆抗体划膜到距离检测线T2线6 2.6mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T3线7；
4）检测线T4线8的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊多克隆抗体划膜到距离检测线T3线7 2.6mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T4线8；
5）检测线T5线9的制备：用缓冲液稀释待包被PVY兔多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY兔多克隆抗体划膜到距离检测线T4线8 2.6mm处NC膜3上，以0.6µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T5线9；
6）检测线T6线10的制备：用缓冲液稀释待包被PVX兔多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX兔多克隆抗体划膜到距离检测线T5线9 2.6mm处NC膜3上，以0.6µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T6线10；
7）质控线C线11的制备：用缓冲液稀释待包被PVA羊抗兔抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将马铃薯病毒羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫4 2mm处NC膜3上，以0.6µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜3上，构成质控线C线11；检测线T6线10和质控线C线11距离为2mm；
8）NC膜3的封装：将划有检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10和质控线C线11的NC膜3置于37℃条件下烘干，封装备用；
9）缓冲液是pH值为7.0的PB溶液；
步骤3：样品垫1的制备：
选用玻璃纤维膜做为制备样品垫1的材料，玻璃纤维膜经处理后方可使用；
玻璃纤维膜的处理步骤：戴手套，将玻璃纤维膜放入处理液中，完全浸泡，浸泡10min ,后取出脱水3min，平置在筛网上，放入37℃干燥箱，烘干至湿度恒定在20%，烘干4h，将烘干后的玻璃纤维膜加干燥剂后装入铝箔袋热封保存；
处理液的配方：PH8.0磷酸缓冲液，1.0%S9表面活性剂溶液，0.5%吐温20，1.0%牛血清白蛋白，0.1%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶剂为水；
步骤4：试纸条的组装：
把步骤1-3所制作完成材料，根据PVC底板12的规格切割成一定的长度和宽度，粘贴PVC底板12上并安装在卡壳13里；
试纸条的组装步骤：
1）将NC膜3非点样面粘贴在PVC底板12上；
2）将金标垫2搭接在NC膜3一端的上方，搭接长度为2mm；
3）将吸水垫4搭接在NC膜3另一端的上方，搭接长度为2mm；
4）将样品垫1搭接在金标垫2的上方，搭接长度为3mm；
5）在斩切机中将粘贴好的PVC底板12剪切成条，试纸条长度为57mm,宽度为35mm；
6）将试纸条装入卡壳13，并和干燥剂一同装入铝箔袋，密封后贴上标签。
上述试纸条的应用方法，具体包括以下步骤：
1）样品处理：取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:9的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.5；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫1上，静置5min，观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10和质控线C线11；
2）结果判读：当质控线C线11显现紫红色，检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10中的一条或几条线显现紫红色，如图4所示（图4仅表示一种情况），检测结果为阳性，马铃薯样品中含有呈现紫红色的检测线所对应的病毒；
当质控线C线（11）显现紫红色，检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10均不显现紫红色；如图5所示，检测结果为阴性，马铃薯样品中不含有检测线所对应的病毒；
当质控线C线11不显现紫红色或其他现象，如图6所示，提示试纸条失效。
实施例2
同步检测多种马铃薯病毒的试纸条及其制备方法和应用，具体包括以下步骤：
一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，其结构同实施例1；
所述检测线T1线5包被有PLRV兔多克隆抗体,所述PLRV兔多克隆抗体划膜浓度为0.5µL/cm,所述用来进行划膜的PLRV兔多克隆抗体溶液浓度为1.8mg/mL；
所述检测线T2线6包被有PVA兔多克隆抗体,所述PVA兔多克隆抗体划膜浓度为0.5µL/cm,所述用来进行划膜的PVA兔多克隆抗体溶液浓度为1.5mg/mL；
所述检测线T3线7包被有PVM羊多克隆抗体,所述PVM羊多克隆抗体划膜浓度为0.5µL/cm,所述用来进行划膜的PVM羊多克隆抗体溶液浓度为0.5mg/mL；
所述检测线T4线8包被有PVS羊多克隆抗体,所述PVS羊多克隆抗体划膜浓度为0.5µL/cm,所述用来进行划膜的PVS羊多克隆抗体溶液浓度为0.5mg/mL；
所述检测线T5线9包被有PVY兔多克隆抗体,所述PVY兔多克隆抗体划膜浓度为0.6µL/cm,所述用来进行划膜的PVY兔多克隆抗体溶液浓度为0.5mg/mL；
所述检测线T6线10包被有PVX兔多克隆抗体,所述PVX兔多克隆抗体划膜浓度为0.6µL/cm,所述用来进行划膜的PVX兔多克隆抗体溶液浓度为0.5mg/mL；
所述质控线C线11上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体；所述包被在质控线C线11上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为0.5µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为0.8mg/mL；
所述金标垫2上结合有马铃薯病毒胶体金标记物混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物为PVA胶体金标记物、PVM胶体金标记物、PVS胶体金标记物、PVX胶体金标记物、PVY胶体金标记物和PLRV胶体金标记物的混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物溶液的喷涂浓度为4µL/cm；
本实施中，如图3所示，试纸条外部还设有卡壳13，所述卡壳13上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔14，所述卡壳13上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽15。
本实施中，所述马铃薯快速检测试纸条长度为73mm,所述样品垫1的长度为18mm,所述金标垫2的长度为12mm，所述NC膜3的长度为28mm，所述吸水垫4的长度为20mm；所述NC膜3与金标垫2搭接的长度为1mm，所述NC膜3与吸水垫4搭接的长度为2mm，所述金标垫2与样品垫1搭接的长度为2mm，所述质控线C线11与吸水垫4的距离为3mm，所述检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10之间的距离为3.2mm，所述检测线T1线5与金标垫2之间的距离为4mm，检测线T6线10和质控线C线11距离为2mm。
本实施中，所述马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVM羊抗兔抗体。
上述试纸条的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：金标垫2的制备：
1)马铃薯病毒胶体金标记物的制备：
复溶液配方：PH8.5，8%蔗糖，3%海藻糖，0.5%牛血清白蛋白，溶剂为0.1mol/L的Tris-HcL溶液；
胶体金溶液的制备：取297mL超纯水于圆底烧瓶中，加入2mL浓度为1%氯金酸溶液，混匀；将圆底烧瓶置于恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；一次性加入2mL1%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；观察溶液颜色变化，由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当变为酒红色时，继续煮沸20min，补充超纯水至原体积，停止加热，冷却至室温；超纯水做空白对照，扫描胶体金溶液在500-550nm之间的吸收值，吸收峰值在515-525nm出现，则制备的胶体金溶液合格；
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K1，加入1胶体金溶液，然后加入4µLPVX兔多克隆抗体、4µLPVY兔多克隆抗体、4µLPVS羊多克隆抗体、4µLPVM羊多克隆抗体，再加入1.5µL0.1mol/L的K2CO3，，混匀后静置25min；另取2支离心管，标记为K2和K3，分别加入1ml胶体金溶液，K2中加入4µLPLRV兔多克隆抗体和0.5µL0.2mol/L的K2CO3，K3中加入4µLPVA兔多克隆抗体和0.5µL0.2mol/L的K2CO3，混匀后震荡25min；向K1、K2和K3中分别加入80µL封闭剂，静置25min,在9000rpm，4℃条件下，离心45min，弃上清，向K1、K2和K3分别加入80µL封闭剂，在9000rpm，4℃条件下，离心25min，分别弃上清，向K1中加入80µL复溶液悬浮沉淀，悬浮好后将K1中的悬浮液转入到K2中，在K2中悬浮沉淀，最后将K2中的悬浮液转入K3中，在K3中悬浮沉淀，随后将K3在400rpm，4℃条件下离心10min，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
2）金标垫与马铃薯病毒胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将制备好的马铃薯病毒胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂马铃薯病毒胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4µL/cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35℃干燥箱中，干燥时间1.5h，取出，放入铝箔袋中，180℃热合封口，保存备用；
步骤2：NC膜的制备：
1）检测线T1线5的制备：用缓冲液稀释待包被PLRV兔多克隆抗体至1.8mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV兔多克隆抗体划膜到距离金标垫2 4mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T1线5；
2）检测线T2线6的制备：用缓冲液稀释待包被PVA兔多克隆抗体至1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA兔多克隆抗体划膜到距离检测线T1线5 3.2mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T2线6；
3）检测线T3线7的制备：用缓冲液稀释待包被PVM羊多克隆抗体至0.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM羊多克隆抗体划膜到距离检测线T2线6 3.2mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T3线7；
4）检测线T4线8的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊多克隆抗体至0.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊多克隆抗体划膜到距离检测线T3线7 3.2mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T4线8；
5）检测线T5线9的制备：用缓冲液稀释待包被PVY兔多克隆抗体至0.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY兔多克隆抗体划膜到距离检测线T4线8 3.2mm处NC膜3上，以0.6µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T5线9；
6）检测线T6线10的制备：用缓冲液稀释待包被PVX兔多克隆抗体至0.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX兔多克隆抗体划膜到距离检测线T5线9 3.2mm处NC膜3上，以0.6µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T6线10；
7）质控线C线11的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊抗兔抗体至0.8mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将马铃薯病毒羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫4 3mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜3上，构成质控线C线11；检测线T6线10和质控线C线11距离为2mm；
8）NC膜3的封装：将划有检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10和质控线C线11的NC膜3置于35℃条件下烘干，封装备用；
9）缓冲液是pH值为7.2的PB溶液；
步骤3：样品垫1的制备：
选用玻璃纤维膜做为制备样品垫1的材料，玻璃纤维膜经处理后方可使用；
玻璃纤维膜的处理步骤：戴手套，将玻璃纤维膜放入处理液中，完全浸泡，浸泡5min ,后取出脱水2min，平置在筛网上，放入35℃干燥箱，烘干至湿度恒定在15%，烘干3h，将烘干后的玻璃纤维膜加干燥剂后装入铝箔袋热封保存；
处理液的配方：PH7.8磷酸缓冲液，0.5%S9表面活性剂溶液，0.4%吐温20，0.5%牛血清白蛋白，0.1%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶剂为水；
步骤4：试纸条的组装：
把步骤1-3所制作完成材料，根据PVC底板12的规格切割成一定的长度和宽度，粘贴 PVC底板12上并安装在卡壳13里；
试纸条的组装步骤：
1）将NC膜3非点样面粘贴在PVC底板上12；
2）将金标垫2搭接在NC膜3一端的上方，搭接长度为1mm；
3）将吸水垫4搭接在NC膜2另一端的上方，搭接长度为2mm；
4）将样品垫1搭接在金标垫2的上方，搭接长度为2mm；
5）在斩切机中将粘贴好的PVC底板12剪切成条，试纸条长度为73mm,宽度为30mm；
6）将试纸条装入卡壳13，并和干燥剂一同装入铝箔袋，密封后贴上标签。
上述试纸条的应用，具体包括以下步骤：
1）样品处理：取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:8的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.4；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫1上，静置4min，观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10和质控线C线11；
2）结果判读：同实施例1。
实施例3
同步检测多种马铃薯病毒的试纸条及其制备方法和应用，具体包括以下步骤：
一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，其结构同实施例1；
所述检测线T1线5包被有PLRV兔多克隆抗体,所述PLRV兔多克隆抗体划膜浓度为1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PLRV兔多克隆抗体溶液浓度为2.5mg/mL；
所述检测线T2线6包被有PVA兔多克隆抗体, 所述PVA兔多克隆抗体划膜浓度为1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVA兔多克隆抗体溶液浓度为2.0mg/mL；
所述检测线T3线7包被有PVM羊多克隆抗体,所述PVM羊多克隆抗体划膜浓度为1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVM羊多克隆抗体溶液浓度为1.5mg/mL；
所述检测线T4线8包被有PVS羊多克隆抗体,所述PVS羊多克隆抗体划膜浓度为1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVS羊多克隆抗体溶液浓度为1.5mg/mL；
所述检测线T5线9包被有PVY兔多克隆抗体,所述PVY兔多克隆抗体划膜浓度为1.0µL/cm,所述用来进行划膜的PVY兔多克隆抗体溶液浓度为1.5mg/mL；
所述检测线T6线10包被有PVX兔多克隆抗体,所述PVX兔多克隆抗体划膜浓度为1.0µL/cm,所述用来进行划膜的PVX兔多克隆抗体溶液浓度为1.5mg/mL；
所述质控线C线11上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体；所述包被在质控线C线11上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为1.2µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为1.5mg/mL；
所述金标垫2上结合有马铃薯病毒胶体金标记物混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物为PVA胶体金标记物、PVM胶体金标记物、PVS胶体金标记物、PVX胶体金标记物、PVY胶体金标记物和PLRV胶体金标记物的混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物溶液的喷涂浓度为6µL/cm；
本实施中，如图3所示，马铃薯病毒快速检测试纸条外部还设有卡壳13，所述卡壳13上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔14，所述卡壳13上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽15。
本实施中，所述马铃薯快速检测试纸条长度为65mm,所述样品垫1的长度为17mm,所述金标垫2的长度为10mm，所述NC膜3的长度为25mm，所述吸水垫4的长度为18mm；所述NC膜3与金标垫2搭接的长度为1mm，所述NC膜3与吸水垫4搭接的长度为2mm，所述金标垫2与样品垫1搭接的长度为2mm，所述质控线C线11与吸水垫4的距离为2mm，所述检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10之间的距离为3mm，所述检测线T1线5与金标垫2之间的距离为3mm，检测线T6线10和质控线C线11距离为2mm。
本实施中，所述马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVS羊抗兔抗体。
上述试纸条的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：金标垫2的制备：
1)马铃薯病毒胶体金标记物的制备：
复溶液配方：PH8.8，12%蔗糖，6%海藻糖，2%牛血清白蛋白，溶剂为0.2mol/L的Tris-HcL溶液；
胶体金溶液的制备：取297mL超纯水于圆底烧瓶中，加入4mL浓度为2%氯金酸溶液，混匀；将圆底烧瓶置于恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；一次性加入4mL2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；观察溶液颜色变化，由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当变为酒红色时，继续煮沸30min，补充超纯水至原体积，停止加热，冷却至室温；超纯水做空白对照，扫描胶体金溶液在500-550nm之间的吸收值，吸收峰值在515-525nm出现，则制备的胶体金溶液合格；
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K1，加入2ml胶体金溶液，然后加入6µLPVX兔多克隆抗体、6µLPVY兔多克隆抗体、6µLPVS羊多克隆抗体、6µLPVM羊多克隆抗体，再加入3µL0.1mol/L的K2CO3，，混匀后静置35min；另取2支离心管，标记为K2和K3，分别加入2ml胶体金溶液，K2中加入6µLPLRV兔多克隆抗体和1.5µL0.2mol/L的K2CO3，K3中加入6µLPVA兔多克隆抗体和1.5µL0.2mol/L的K2CO3，混匀后震荡35min；向K1、K2和K3中分别加入120µL 封闭剂，静置35min,在12000rpm，4℃条件下，离心55min，弃上清，向K1、K2和K3分别加入120µL封闭剂，在12000rpm，4℃条件下，离心35min，分别弃上清，向K1中加入120µL复溶液悬浮沉淀，悬浮好后将K1中的悬浮液转入到K2中，在K2中悬浮沉淀，最后将K2中的悬浮液转入K3中，在K3中悬浮沉淀，随后将K3在600rpm，4℃条件下离心20min，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
2）金标垫2与马铃薯病毒胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫2的支撑材料，将制备好的马铃薯病毒胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂马铃薯病毒胶体金标记物的最佳喷涂浓度为6µL/cm，将喷好的玻璃纤维膜置于40℃干燥箱中，干燥时间2.5h，取出，放入铝箔袋中，230℃热合封口，保存备用；
步骤2：NC膜的制备：
1）检测线T1线5的制备：用缓冲液稀释待包被PLRV兔多克隆抗体至2.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV兔多克隆抗体划膜到距离金标垫2 3mm处NC膜3上，以1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T1线5；
2）检测线T2线6的制备：用缓冲液稀释待包被PVA兔多克隆抗体至2.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA兔多克隆抗体划膜到距离检测线T1线5 3mm处NC膜3上，以1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T2线6；
3）检测线T3线7的制备：用缓冲液稀释待包被PVM羊多克隆抗体至1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM羊多克隆抗体划膜到距离检测线T2线6 3mm处NC膜3上，以1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T3线7；
4）检测线T4线8的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊多克隆抗体至1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊多克隆抗体划膜到距离检测线T3线7 3mm处NC膜3上，以1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T4线8；
5）检测线T5线9的制备：用缓冲液稀释待包被PVY兔多克隆抗体至1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY兔多克隆抗体划膜到距离检测线T4线8 3mm处NC膜3上，以1.0µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T5线9；
6）检测线T6线10的制备：用缓冲液稀释待包被PVX兔多克隆抗体至1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX兔多克隆抗体划膜到距离检测线T5线9 3mm处NC膜3上，以1.0µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T6线10；
7）质控线C线11的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊抗兔抗体至1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫4 2mm处NC膜3上，以1.2µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜3上，构成质控线C线11；检测线T6线10和质控线C线11距离2mm；
8）NC膜3的封装：将划有检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10和质控线C线11的NC膜3置于40℃条件下烘干，封装备用；
9）缓冲液是pH值为7.4的PB溶液；
步骤3：样品垫1的制备：
选用玻璃纤维膜做为制备样品垫1的材料，玻璃纤维膜经处理后方可使用；
玻璃纤维膜的处理步骤：戴手套，将玻璃纤维膜放入处理液中，完全浸泡，浸泡15min,后取出脱水4min，平置在筛网上，放入40℃干燥箱，烘干至湿度恒定在25%，烘干5h，将烘干后的玻璃纤维膜加干燥剂后装入铝箔袋热封保存；
处理液的配方：PH8.0磷酸缓冲液，1.5%S9表面活性剂溶液，0.5%吐温20，1.5%牛血清白蛋白，0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶剂为水；
步骤4：试纸条的组装：
把步骤1-3所制作完成材料，根据PVC底板12的规格切割成一定的长度和宽度，粘贴PVC底板12上并安装在卡壳13里；
试纸条的组装步骤：
1）将NC膜3非点样面粘贴在PVC底板12上；
2）将金标垫2搭接在NC膜3一端的上方，搭接长度为1mm；
3）将吸水垫4搭接在NC膜3另一端的上方，搭接长度为2mm；
4）将样品垫1搭接在金标垫2的上方，搭接长度为2mm；
5）在斩切机中将粘贴好的PVC底板12剪切成条，试纸条长度为65mm,宽度为40mm；
6）将试纸条装入卡壳13，并和干燥剂一同装入铝箔袋，密封后贴上标签。
上述试纸条应用，具体包括以下步骤：
1）样品处理：取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:10的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.8；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫1上，静置6min，观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10和质控线C线11；
2）结果判读：同实施例1。
发明人从2016年至今一直在研究能够同步检测多种病毒的试纸条，进行了上万次的实验，在此随机列举发明人研发过程中的尝试过的几种实验方法、即对比例1-6实验，来验证某一参数的改变对其检测结果的影响。
对比例1
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K4，加入1ml胶体金溶液然后加入5µLPVX兔多克隆抗体、5µLPVY兔多克隆抗体、5µLPVS羊多克隆抗体、5µLPVM羊多克隆抗体，5µLPLRV兔多克隆抗体和5µLPVA兔多克隆抗体，再加入2µL0.2mol/L的K2CO3，，混匀后震荡30min；向K4加入100µL封闭剂，静置30min，在10200rpm，4℃条件下，离心30min，弃上清，向K4中加入100µL复溶液悬浮沉淀，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例2
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K5，加入1ml胶体金溶液然后加入5µLPLRV兔多克隆抗体，5µLPVA兔多克隆抗体，5µLPVX兔多克隆抗体、5µLPVY兔多克隆抗体、5µLPVS羊多克隆抗体、5µLPVM羊多克隆抗体，再加入2µL0.2mol/L的K2CO3，，混匀后震荡30min；向K5加入100µL封闭剂，静置30min，在10200rpm，4℃条件下，离心30min，弃上清，向K5中加入100µL复溶液悬浮沉淀，在500rpm，4℃条件下离心15min，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例3
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K6，加入1ml胶体金溶液然后加入5µLPLRV兔多克隆抗体，5µLPVA兔多克隆抗体，5µLPVX兔多克隆抗体、5µLPVY兔多克隆抗体、5µLPVS羊多克隆抗体、5µLPVM羊多克隆抗体，再加入2µL0.2mol/L的K2CO3，，混匀后震荡30min；向K6加入100µL封闭剂，震荡30min，在10200rpm，4℃条件下，离心30min，弃上清，向K6中加入100µL复溶液悬浮沉淀，在500rpm，4℃条件下离心15min，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例4
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K7，加入1ml胶体金溶液然后加入5µLPLRV兔多克隆抗体，5µLPVA兔多克隆抗体，5µLPVX兔多克隆抗体、5µLPVY兔多克隆抗体、5µLPVS羊多克隆抗体、5µLPVM羊多克隆抗体，再加入2µL0.2mol/L的K2CO3，，混匀后震荡30min；向K7加入100µL封闭剂，静置30min，在10200rpm，4℃条件下，离心30min，弃上清，向K7中加入100µL复溶液悬浮沉淀，在500rpm，4℃条件下离心15min，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
步骤2：NC膜的制备：
1）检测线T1线5的制备：用缓冲液稀释待包被PVX兔多克隆抗体至2.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV兔多克隆抗体划膜到距离金标垫24mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T1线5；
2）检测线T2线6的制备：用缓冲液稀释待包被PVA兔多克隆抗体至2.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA兔多克隆抗体划膜到距离检测线T1线53mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T2线6；
3）检测线T3线7的制备：用缓冲液稀释待包被PVM羊多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM羊多克隆抗体划膜到距离检测线T2线63mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T3线7；
4）检测线T4线8的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊多克隆抗体划膜到距离检测线T3线73mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T4线8；
5）检测线T5线9的制备：用缓冲液稀释待包被PVY兔多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY兔多克隆抗体划膜到距离检测线T4线83mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T5线9；
6）检测线T6线10的制备：用缓冲液稀释待包被PLRV兔多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX兔多克隆抗体划膜到距离检测线T5线93mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T6线10；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例5
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K8，加入1mL胶体金溶液、5μLPVX兔多克隆抗体和4μL0.1mol/LK2CO3；取一支离心管，标记为K9，加入1mL胶体金溶液、5μLPVY兔多克隆抗体和2μL0.1mol/LK2CO3；取一支离心管，标记为K10，加入1mL胶体金溶液、5μLPVS羊多克隆抗体和4μL0.1mol/LK2CO3；取一支离心管，标记为K11加入1mL胶体金溶液、5μLPVM羊多克隆抗体和4μL0.1mol/LK2CO3；取一只离心管，标记为K12，加入1mL胶体金溶液、5μLPLRV兔多克隆抗体和2μL0.2mol/LK2CO3；取一只离心管，标记为K13，加入1mL胶体金溶液、5μLPVA兔多克隆抗体和2μL0.2mol/LK2CO3；分别混匀后震荡30min；向K8-K13中分别加入100μL封闭剂，静置30min；在10200rpm，4℃条件下，离心30min，弃上清，分别向K8-K13加入100μL复溶液悬浮沉淀，在500rpm，4℃条件下，离心15min，将各管复溶液混在一起，作为马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
步骤2：NC膜的制备：
1）检测线T1线5的制备：用缓冲液稀释待包被PVX兔多克隆抗体至2.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV兔多克隆抗体划膜到距离金标垫2 4mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T1线5；
2）检测线T2线6的制备：用缓冲液稀释待包被PVA兔多克隆抗体至2.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA兔多克隆抗体划膜到距离检测线T1线5 3mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T2线6；
3）检测线T3线7的制备：用缓冲液稀释待包被PVM羊多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM羊多克隆抗体划膜到距离检测线T2线6 3mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T3线7；
4）检测线T4线8的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊多克隆抗体划膜到距离检测线T3线7 3mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T4线8；
5）检测线T5线9的制备：用缓冲液稀释待包被PVY兔多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY兔多克隆抗体划膜到距离检测线T4线8 3mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T5线9；
6）检测线T6线10的制备：用缓冲液稀释待包被PLRV兔多克隆抗体至1.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX兔多克隆抗体划膜到距离检测线T5线9 3mm处NC膜3上，以0.5µL/cm的浓度划膜于NC膜3上，构成检测线T6线10；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例6
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取一支离心管，标记为K14，加入1mL胶体金溶液、5μLPVX兔多克隆抗体和4μL0.1mol/LK2CO3；取一支离心管，标记为K15，加入1mL胶体金溶液、5μLPVY兔多克隆抗体和2μL0.1mol/LK2CO3；取一支离心管，标记为K16，加入1mL胶体金溶液、5μLPVS羊多克隆抗体和4μL0.1mol/LK2CO3；取一支离心管，标记为K17，加入1mL胶体金溶液、5μLPVM羊多克隆抗体和4μL0.1mol/LK2CO3；取一支离心管，标记为K18，加入1mL胶体金溶液、5μLPLRV兔多克隆抗体和2μL0.2mol/LK2CO3；取一支离心管，标记为K19，加入1mL胶体金溶液、5μLPVA兔多克隆抗体和2μL0.2mol/LK2CO3；分别混匀后震荡30min；向离心管K14-K19分别加入100μL封闭剂，静置30min；在10200rpm，4℃条件下，离心30min，弃上清，向离心管K14-K19分别加入100μL封闭剂，在10200rpm，4℃条件下，离心30min，分别弃上清，然后向K14加入200μL复溶液悬浮沉淀，将K14中的悬浮液加入到K15中，悬浮沉淀后，将K15中的悬浮液加入到K16中悬浮沉淀，悬浮沉淀后，将K16中的悬浮液加入到K17中悬浮沉淀，悬浮沉淀后，将K17中的悬浮液加入到K18中悬浮沉淀，悬浮沉淀后，将K18中的悬浮液加入到K19中悬浮沉淀，然后在500rpm，4℃条件下，离心15min，上清就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用。
其余步骤均与实施例1相同。
特异性实验一：选只含有PVA病毒的马铃薯样品，取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:9的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.5；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫1上，静置5min，观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10和质控线C线11，实验结果如表1所示。
由表1结果可知：实施例1-3只检测出检测线T2对应的PVA病毒，与实验设定数据一致，对比例1、3未检出马铃薯病毒、出现假阴性反应，对比例2和对比例5的检测线T1出现假阳性反应，对比例4检测线T6出现假阳性反应，对比例6检测线T3和检测线T4出现假阳性反应。
特异性实验二：选只含有PVX病毒的马铃薯样品，取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:9的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.5；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫1上，静置5min，观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10和质控线C线11，实验结果如表2所示。
由表2结果可知：实施例1-3只检测出检测线T6对应的PVX病毒，与实验设定数据一致，对比例1检测线T3出现假阳性反应，对比例2、3、5未检出马铃薯病毒、出现假阴性反应，对比例4检测线T5出现假阳性反应，对比例6检测线T4出现假阳性反应。
特异性实验三：只含有PLRV病毒的马铃薯样品，取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:9的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.5；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫1上，静置5min，观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10和质控线C线11，实验结果如表3所示。
由表3结果可知：实施例1-3只检测出检测线T1对应的PLRV病毒，与实验设定数据一致，对比例1、2、3、5未检出马铃薯病毒、出现假阴性反应，对比例4、6检测线T3出现假阳性反应。
从表1、表2和表3的结果可以看出，马铃薯病毒快速检测试纸条中每一个参数的变化将直接影响加测结果的准确性，本发明提供的马铃薯病毒快速检测试纸条准确度很高，对于单一病毒有很强的特异性，而且检测时间短，可以快速判定马铃薯病毒的种类，检测线包被的6种马铃薯病毒抗体不会相互影响，不会产生假阳性。
特异性实验四：去只含有PVM病毒的马铃薯样品，只含有PVS病毒的马铃薯样品和只含有PVY病毒的马铃薯样品，分别取其叶片，混合，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:9的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.5；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫1上，静置5min，观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6 线10和质控线C线11，实验结果如表4所示。
由表4结果可知：实施例1-3检测出检测线T3、T4、T5对应的PVM、PVS和PVY病毒，与实验设定数据一致，对比例1检测线T4和检测线T5出现假阴性反应，对比例2检测线T1出现假阳性反应，对比例3、5未检出病毒、出现假阴性反应，对比例4检测线T3和检测线T4出现假阴性反应，对比例6检测线T3和检测线T5出现假阴性反应。
特异性实验五：取只含有PLRV病毒的马铃薯样品，只含有PVS病毒的马铃薯样品、含有PVA病毒的马铃薯样品、只含有PVM病毒的马铃薯样品和只含有PVY病毒的马铃薯样品，分别取其叶片，混合，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:9的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.5；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫1上，静置5min，观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10和质控线C线11，实验结果如表5所示。
由表5结果可知：实施例1-3检测出检测线T1-T5对应的PVA、PVS、PVY、PLRV和PVM病毒，与实验设定数据一致，对比例1检测线T1和检测线T2出现假阴性反应，对比例2检测线T2、T3、T5出现假阴性反应，对比例3检测线T1、T2、T4、T5出现假阴性反应，对比例4检测线T1、T2、T3、T4出现假阴性反应，对比例5检测线T1、T2、T3、T5出现假阴性反应，对比例6检测线T1、T2、T5出现假阴性反应。
从表4和表5的实验结果可知，当马铃薯含有多种病毒时，本发明可以快速检测，检测结果准确，特异性强，检测线所包被的马铃薯病毒抗体不会相互影响，可精准的对马铃薯感染的病毒作出判断，为马铃薯脱毒、种薯级别定级和马铃薯病毒病的防控提供了检测手段，解决了传统检测方法检测效率低，成本高，当马铃薯同时感染多种病毒时容易误判马铃薯感染病毒的种类的问题，为马铃薯病毒病综合防治工作的开展奠定了理论和实践基础。
从表1-表6实验结果可知，本发明试纸条涉及到的制备参数有数十种，任一改变某一步骤的制备参数，将直接影响检测加过的准确性，出现假阳性或假阴性的结果，因此要严格按照本发明的工艺及参数制备，才能获得准确的检测结果。
本发明技术中确定的马铃薯病毒试纸条制备的参数，包括：步骤1：金标垫2的制备；
步骤2：NC膜3的制备；步骤3：样品垫1的制备；每个步骤中的制备工艺和参数是保证马铃薯病毒试纸条能够同步检测出马铃薯六种病毒感染结果，保证准确性和高效性的关键和核心，并且，金标垫2的制备、NC膜3的制备、样品垫1的制备各阶段会相互影响，上述制备工艺及参数的选择可以使马铃薯病毒试纸条检测确确性和检测精度不断提高。本发明试纸条准确度高，特异性强，使用本发明提供的试纸条检测马铃薯病毒与使用一个试纸条只检测一种马铃薯病毒及用国内外通用的酶联免疫吸附实验法检测马铃薯样品的实验结果完全吻合，准确率高达100%，不会发生假阳性结果。
为了测试马铃薯病毒快速检测试纸条稳定性、准确性实验，实验过程及结果如下所示：
实验六 马铃薯病毒快速检测试纸条稳定性的测定实验
马铃薯病毒快速检测试纸条稳定性的测定将试纸条用铝箔袋密封，加入干燥剂，分别置于4℃、37℃、室温条件下，其中置于4℃和室温条件试纸条每隔7天取出3条，置于37℃的每天取出3条，分别检测阴性样本和阳性样本。观察检测线T1线5、T2线6、T3线7、T4线8、T5线9、T6线10和质控线C线11的有无、颜色深浅及金标垫2上马铃薯病毒胶体金标记物上的释放程度。从试纸条测试结果来看，将试纸条放在内放干燥剂的密封铝箔袋中，室温和37℃下保存长时间后颜色略减弱，其他不同温度、不同时间的测试结果无明显变化，说明在适当条件下保存，本试纸条具有较好的稳定性。马铃薯病毒包括PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA。
实验七 马铃薯病毒快速检测试纸条准确性的测定实验
用本发明提供的试纸条检测马铃薯样品，判定马铃薯的植株做是否含有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA六种病毒的一种或几种。将随机选取的马铃薯样品编号为①②③④⑤⑥⑦⑧，其中①②采用实施例1的方法进行检测，③④采用实施例2的方法检测，⑤⑥采用实施例3的方法检测，⑦⑧采用实施例4的方法检测。检测结果如图4所示：
①号样品未感染马铃薯病毒；②号样品感染PVX马铃薯病毒；③号样品感染PVY马铃薯病毒；
④号样品感染PVS马铃薯病毒；⑤号样品感染PVM马铃薯病毒；⑥号样品感染PVA马铃薯病毒；⑦号样品感染PLRV马铃薯病毒；⑧号样品感染PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA共六种马铃薯病毒。
为验证本实用新型检测结果的准确性，用检测单一病毒的马铃薯检测试纸条检测上述马铃薯样品，再用国内外通用的酶联免疫吸附实验法检测上述马铃薯样品，所得结果与本实用新型检测结果完全一致，说明本实用新型不论是检测单一马铃薯病毒还是多种马铃薯病毒都有较好的准确性，为多种马铃薯病毒快速检测奠定了基础。
实验八 马铃薯病毒快速检测试纸条准确性扩大实验
为进一步验证本发明提供的快速检测试纸条的准确性，对100个马铃薯的植株用本发明所提供的快速检测试纸条、RT-PCR检测技术和双抗体夹心酶联免疫吸附实验法三种方法进行检测，判定马铃薯样品是否含有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA六种病毒的一种或几种。三种方法检测结果完全一致，符合率高达100%，说明本发明可以准确的检测6种马铃薯病毒，而且与其他两种方法相比，本发明可同步检测6种病毒，检测时间短，成本低，对样品、实验环境和操作人员没有要求，为马铃薯病毒快速体系的建立提供了理论和实践基础。
Claims (8)
1.一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，包括样品垫（1）、金标垫（2）、NC膜（3）、检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6 线（10）、质控线C线（11）、吸水垫（4）和PVC底板（12），所述PVC底板（12）的上部贴合有NC膜（3），所述NC膜（3）上部两端分别搭接有金标垫（2）和吸水垫（4），所述金标垫（2）上部搭接有样品垫（1），所述检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6线（10）依次设置在靠近样品垫（1）的NC膜（3）表面上，且检测线T1线（5）距离样品垫（1）最近，检测线T6线（10）距离样品垫（1）最远，所述质控线C线（11）设置在靠近吸水垫（4）的NC膜（3）上，其特征在于：
所述检测线T1线（5）包被有PLRV兔多克隆抗体,所述PLRV兔多克隆抗体划膜浓度为0.5-1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PLRV兔多克隆抗体溶液浓度为1.8-2.5mg/mL；
所述检测线T2线（6）包被有PVA兔多克隆抗体,所述PVA兔多克隆抗体划膜浓度为0.5-1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVA兔多克隆抗体溶液浓度为1.5-2.0mg/mL；
所述检测线T3线（7）包被有PVM羊多克隆抗体,所述PVM羊多克隆抗体划膜浓度为0.5-1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVM羊多克隆抗体溶液浓度为0.5-1.5mg/mL；
所述检测线T4线（8）包被有PVS羊多克隆抗体,所述PVS羊多克隆抗体划膜浓度为0.5-1.1µL/cm,所述用来进行划膜的PVS羊多克隆抗体溶液浓度为0.5-1.5mg/mL；
所述检测线T5线（9）包被有PVY兔多克隆抗体,所述PVY兔多克隆抗体划膜浓度为0.6-1.0µL/cm,所述用来进行划膜的PVY兔多克隆抗体溶液浓度为0.5-1.5mg/mL；
所述检测线T6线（10）包被有PVX兔多克隆抗体,所述PVX兔多克隆抗体划膜浓度为0.6-1.0µL/cm，所述用来进行划膜的PVX兔多克隆抗体溶液浓度为0.5-1.5mg/mL；
所述质控线C线（11）上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体；所述包被在质控线C线（11）上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为0.5-1.2µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为0.8-1.5mg/mL；
所述金标垫（2）上结合有马铃薯病毒胶体金标记物混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物为PVA胶体金标记物、PVM胶体金标记物、PVS胶体金标记物、PVX胶体金标记物、PVY胶体金标记物和PLRV胶体金标记物的混合物；所述马铃薯病毒胶体金标记物混合物溶液的喷涂浓度为4-6µL/cm；
同步检测多种马铃薯病毒的试纸条的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：金标垫（2）的制备；
步骤2：NC膜（3）的制备；步骤3：
样品垫（1）的制备；
步骤4：试纸条的组装；
所述步骤1：金标垫（2）的制备,包括如下步骤：
1)马铃薯病毒胶体金标记物的制备：
复溶液配方：PH8.0-8.8，8-12%蔗糖，3-6%海藻糖，0.5-2%牛血清白蛋白，溶剂为0.1-0.2mol/L的Tris-HCL溶液；
胶体金溶液的制备：取297-300 mL超纯水于圆底烧瓶中，加入2-4 mL浓度为1-2%氯金酸溶液，混匀；将圆底烧瓶置于恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；一次性加入2-4mL1-2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；观察溶液颜色变化，由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当变为酒红色时，继续煮沸20-30min，补充超纯水至原体积，停止加热，冷却至室温；超纯水做空白对照，扫描胶体金溶液在500-550nm 之间的吸收值，吸收峰值在515-525nm出现，则制备的胶体金溶液合格；
马铃薯病毒胶体金标记物制备工艺：取1支离心管，标记为K1，加入1-2ml胶体金溶液，然后加入4-6µL PVX兔多克隆抗体、4-6µLPVY兔多克隆抗体、4-6µLPVS羊多克隆抗体、4-6µLPVM羊多克隆抗体，再加入1.5-3µL0.1mol/L的K2CO3，，混匀后静置25-35min；另取2支离心管，标记为K2和K3，分别加入1-2ml胶体金溶液，K2中加入4-6µLPLRV兔多克隆抗体和0.5-1.5µL0.2mol/L的K2CO3，K3中加入4-6µLPVA兔多克隆抗体和0.5-1.5µL0.2mol/L的K2CO3，混匀后震荡25-35min；向K1、K2和K3中分别加入80-120µL封闭剂，静置25-35min,在9000-12000rpm，4℃条件下，离心45-55min，弃上清，向K1、K2和K3分别加入80-120µL封闭剂，在9000-12000rpm，4℃条件下，离心25-35min，分别弃上清，向K1中加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，悬浮好后将K1中的悬浮液转入到K2中，在K2中悬浮沉淀，最后将K2中的悬浮液转入K3中，在K3中悬浮沉淀，随后将K3在400-600rpm，4℃条件下离心10-20min，吸取上清液，上清液就是马铃薯病毒胶体金标记物，保存备用；
金标垫（2）与马铃薯病毒胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫（2）的支撑材料，将制备好的马铃薯病毒胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂马铃薯病毒胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL/cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间1.5-2.5h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃热合封口，保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，其特征在于：试纸条外部还设有卡壳（13），所述卡壳（13）上部表面与样品垫（1）对应的位置上设有加样孔（14），所述卡壳（13）上部表面与所述NC膜（3）对应的位置上设有观察槽（15）。
3.根据权利要求1所述的一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，其特征在于：所述试纸条长度为56-73mm，所述样品垫（1）的长度为16mm-18mm，所述金标垫（2）的长度为8mm-12mm，所述NC膜（3）的长度为24mm-28mm，所述吸水垫（4）的长度为16mm-20mm；所述NC膜（3）与金标垫（2）搭接的长度为1-2mm，所述NC膜（3）与吸水垫（4）搭接的长度为2-3mm，所述金标垫（2）与样品垫（1）搭接的长度为2-3mm，所述质控线C线（11）与吸水垫（4）的距离为2-3.5mm，所述检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6 线（10）之间的距离为2.5-3.5mm，所述检测线T1与金标垫之间的距离为3-4.5mm，检测线T6线和质控线C线距离为2-4mm。
4.根据权利要求1所述的一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条，其特征在于：所述马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVA羊抗兔抗体、PVM羊抗兔抗体，PVS羊抗兔抗体，PVX羊抗兔抗体，PVY羊抗兔抗体和PLRV羊抗兔抗体中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的的一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条的制备方法，其特征在于：
所述步骤2：NC膜（3）的制备,包括如下步骤：
检测线T1线（5）的制备：用缓冲液稀释待包被PLRV兔多克隆抗体至1.8-2.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV兔多克隆抗体划膜到距离金标垫（2）3-4.5mm处NC膜（3）上，以0.5-1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜（3）上，构成检测线T1线（5）；
检测线T2线（6）的制备：用缓冲液稀释待包被PVA兔多克隆抗体至1.5-2.0mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA兔多克隆抗体划膜到距离检测线T1（5）2.5-3.5mm处NC膜（3）上，以0.5-1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜（3）上，构成检测线T2线（6）；
检测线T3线（7）的制备：用缓冲液稀释待包被PVM羊多克隆抗体至0.5-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM羊多克隆抗体划膜到距离检测线T2（6）2.5-3.5mm处NC膜（3）上，以0.5-1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜（3）上，构成检测线T3线（7）；
检测线T4线（8）的制备：用缓冲液稀释待包被PVS羊多克隆抗体至0.5-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊多克隆抗体划膜到距离检测线T3（7） 2.5-3.5mm处NC膜（3）上，以0.5-1.1µL/cm的浓度划膜于NC膜（3）上，构成检测线T4线（8）；
检测线T5线（9）的制备：用缓冲液稀释待包被PVY兔多克隆抗体至0.5-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY兔多克隆抗体划膜到距离检测线T4（8）2.5-3.5mm处NC膜（3）上，以0.6-1.0µL/cm的浓度划膜于NC膜（3）上，构成检测线T5线（9）；
检测线T6线（10）的制备：用缓冲液稀释待包被PVX兔多克隆抗体至0.5-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX兔多克隆抗体划膜到距离检测线T5（9） 2.5-3.5mm处NC膜（3）上，以0.6-1.0µL/cm的浓度划膜于NC膜（3）上，构成检测线T6线（10）；
质控线C线（11）的制备：用缓冲液稀释待包被马铃薯病毒羊抗兔抗体至0.8-1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将马铃薯病毒羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫（4）2-3.5mm处NC膜上，以0.5-1.2µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜（3）上，构成质控线C（11）线；检测线T6线（10）和质控线C线（11）距离为2-4mm；
NC膜（3）的封装：将划有检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6线（10）和质控线C线（11）的NC膜（3）置于35-40℃条件下烘干，封装备用；
缓冲液是pH值为7.0-7.4的PB溶液。
6.根据权利要求1所述的一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条的制备方法，其特征在于：
所述步骤3：样品垫（1）的制备,包括如下步骤：
选用玻璃纤维膜做为制备样品垫（1）的材料，玻璃纤维膜经处理后方可使用；
玻璃纤维膜的处理步骤：戴手套，将玻璃纤维膜放入处理液中，完全浸泡，浸泡5-15min ,后取出脱水2-4min，平置在筛网上，放入35-40℃干燥箱，烘干至湿度恒定在15-25%，烘干3-5h，将烘干后的玻璃纤维膜加干燥剂后装入铝箔袋热封保存；
处理液的配方：PH7.8-8.0磷酸缓冲液，0.5-1.5%S9表面活性剂溶液，0.4-0.5%吐温20，0.5-1.5%牛血清白蛋白，0.1-0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶剂为水。
7.根据权利要求1所述的的一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条的制备方法，其特征在于：
所述步骤4：试纸条的组装,包括如下步骤：
把步骤1-3所制作完成材料，根据PVC底板（12）的规格切割成一定的长度和宽度，粘贴PVC底板（12）上并安装在卡壳（13）里；
试纸条的组装步骤：
将NC膜（3）非点样面粘贴在PVC底板（12）上；
将金标垫（2）搭接在NC膜（3）一端的上方，搭接长度为1-2mm；
将吸水垫（4）搭接在NC膜（3）另一端的上方，搭接长度为2-3mm；
将样品垫（1）搭接在金标垫（2）的上方，搭接长度为2-3mm；
在斩切机中将粘贴好的PVC底板（12）剪切成条，试纸条长度为56-73mm,宽度为30-40mm；
将试纸条装入卡壳（13），并和干燥剂一同装入铝箔袋，密封后贴上标签。
8.一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条的应用，其特征在于：
用权利要求1所述的一种同步检测多种马铃薯病毒的试纸条对待检马铃薯样品进行检测，具体检测步骤为：
样品处理：
取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:8-1:10的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.4-7.8；把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫（1）上，静置4-6min，观察检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6线（10）和质控线C线（11）；
2）结果判读：
当质控线C线（11）显现紫红色，检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6线（10）中的一条或几条线显现紫红色，检测结果为阳性，马铃薯样品中含有呈现紫红色的检测线所对应的病毒；
当质控线C线（11）显现紫红色，检测线T1线（5）、T2线（6）、T3线（7）、T4线（8）、T5线（9）、T6线（10）均不显现紫红色；检测结果为阴性，马铃薯样品中不含有检测线所对应的病毒；
当质控线C线（11）不显现紫红色或其他现象，提示试纸条失效。
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