CN111856008A - 一种多种呼吸道病原体快速检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多种呼吸道病原体快速检测试纸及其制备方法，包括粘贴支架，粘贴支架上粘贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有若干条沿其长度方向间隔分布的低温蜡带，硝酸纤维素膜垂直于低温蜡带还设置有间隔分布的质控线和检测线，粘贴支架的其中一端上还粘贴有吸水纸，吸水纸叠压在硝酸纤维素膜的其中一端上的所有疏水区和亲水区，硝酸纤维素膜远离吸水纸一端叠压有结合垫，结合垫远离硝酸纤维素膜的一端向外延伸后粘贴在粘贴支架上，粘贴支架上远离吸水纸的一端上粘贴有样品垫，样品垫的其中一端叠压在结合垫上，本发明可以在一张检测试纸上同时进行五种呼吸道病原体的检测。
Description
技术领域
本发明涉及病原体检测领域，尤其是涉及一种多种呼吸道病原体快速检测试纸及其制备方法。
背景技术
感染呼吸道病原体的患者人数每年增加，所造成的死亡人数亦逐年增多。给患者提供合适治疗方案的关键环节是快速精准的诊断。然而由于呼吸道病原体种类多，引起的发病症状相似，给医生的诊断带来阻碍。开发一种可以快速、简便、廉价和功能多样的病原体快速检测产品具有十分重要的社会意义和巨大的经济价值。针对此需求，本发明提出一种多种呼吸道病原体快速检测试纸。
病原体快速检测试纸采用胶体金免疫层析技术，这种技术是综合了单克隆抗体制备、免疫分析、层析分离、材料标记等技术的一种新型免疫学快速检测技术。该技术打破了传统诊断技术检测慢、成本高和准确度低的问题，促进了免疫检测技术研究的向前推进。胶体金免疫层析技术已成功应用于多种动物病毒疫病、细菌疫病和寄生虫疫病的快速诊断和监控。市面上的病原体检测试纸大多基于这种技术进行研发与制备。
目前，市面上大多数的病原体检测试纸只能检测单一的病原体，或者把几种检测单一病原体的快速检测试纸简单的拼接在一起，亦有产品在同一张试纸上进行多联的病原体检测，这些产品都存在各自的优点和缺点。本发明提供一种多种呼吸道病原体快速检测试纸及其制作方法，涉及生物医药领域，采用抗原抗体夹心法和胶体金免疫层析法原理定性检测血液样品中是否存在新冠病毒（COVID-19）IgG/IgM抗体、流感病毒（Flu）IgG/IgM抗体、腺病毒（ADV）IgG/IgM抗体、鼻病毒（RV）IgG/IgM抗体和呼吸道合胞病毒（RSV）IgG/IgM抗体，利用胶体金标记的兔抗人IgG/IgM抗体作为指示标记物，在硝酸纤维素膜上包被新冠病毒、流感病毒、腺病毒、鼻病毒和呼吸道病毒的特异性重组抗原，以夹心法来实现对样品中五种呼吸道病原体人IgG/IgM的定性检测，能方便地检测样品中是否存在五种病原体的人IgG/IgM中的一种或者多种。该试纸灵敏度高、检测时间短、抗干扰强，可供临床医生快速判断是否确诊某种呼吸道病原体。
已有与本发明比较接近的实现方案，有如下两个。一、一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用免疫层析试剂盒及其制备方法。此方案包括三条试纸条，每条试纸条上设有三条检测线用于检测三项呼吸道感染病原体抗原。每条试纸条独立进行检测。专利申请公布号：CN 105866434 A。二、一种呼吸道病毒快速检测试剂盒及其制备方法。此方案在一张硝酸纤维素膜上平行的包被不同的病毒抗体，用以检测样品中不同的病毒抗原。专利申请公布号：CN 106841604 A。
现有方案一的缺点：
（1）三条试纸是相互独立的，检测时需要进行三次样品的添加，可能会由于添加样品的方式不一致导致结果有偏差。
（2）三条试纸中每条试纸上有三条检测线，同一条试纸上进行多项指标的检测可能会导致结果有偏差，灵敏性降低。
现有方案二的缺点：
（1）此方案所使用的硝酸纤维素膜没有进行亲疏水修饰，没有实现病原体分通道检测。
（2）同一张结合垫上的胶体金标记物种类过多，会导致灵敏度较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种多种呼吸道病原体快速检测试纸及其制备方法，解决现有技术中需要多次采样加样，从而使试纸灵敏性降低的问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种多种呼吸道病原体快速检测试纸，包括粘贴支架，粘贴支架上粘贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有若干条沿其长度方向间隔分布的低温蜡带，硝酸纤维素膜垂直于低温蜡带还设置有间隔分布的质控线和检测线，低温蜡带所在位置形成疏水区，低温蜡带两侧亲水区，质控线和检测线均被低温蜡带分割为间隔的多段，粘贴支架的其中一端上还粘贴有吸水纸，吸水纸叠压在硝酸纤维素膜的其中一端上的所有疏水区和亲水区，硝酸纤维素膜远离吸水纸一端的每个亲水区上均叠压有结合垫，结合垫远离硝酸纤维素膜的一端向外延伸后粘贴在粘贴支架上，粘贴支架上远离吸水纸的一端上粘贴有样品垫，样品垫的其中一端叠压在结合垫上。
所述的粘贴支架外部设置有用于容纳粘贴支架的试纸盒。
制备所述的一种多种呼吸道病原体快速检测试纸的方法，包括如下步骤：
步骤一、胶体金的制备：采用化学还原法，在氯金酸水溶液中加入柠檬酸三钠还原剂，制备胶体金颗粒；
步骤二、胶体金标记物的制备：兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物的制备过程是，取1支离心管，加入兔抗人IgG/IgM抗体和胶体金，室温反应并用高速冷冻离心机离心处理，弃去上清，用缓冲液重悬，混匀，保存备用；
步骤三、胶体金标记物在结合垫上喷涂：将兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物和兔抗鼠IgG抗体胶体金标记物混合，并将其喷涂在不同的玻璃纤维膜上，干燥后得到结合垫；
步骤四、硝酸纤维素膜的修饰：在硝酸纤维素膜上用低温蜡进行修饰若干条间隔设置的低温蜡带；
步骤五、抗原抗体在硝酸纤维素膜上包被：在修饰过的硝酸纤维素膜的每个亲水区通道上分别包被待检测病原体抗原作为检测线，并包被鼠IgG作为质控线；
步骤六、样品垫与吸水纸的处理：将样品垫在样品垫处理液中充分浸泡， 56 ℃干燥1h，置于内有干燥剂的自封袋中真空密封，4℃保存，将吸水垫密封，室温保存；
步骤七、切割装配：在干燥环境下取粘贴支架，在粘贴支架的中央贴上经过低温蜡修饰的喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，吸水纸紧贴粘贴支架叠压在硝酸纤维素膜的一端，硝酸纤维素膜的另一端粘贴结合垫，结合垫远离硝酸纤维素膜的一端粘贴样品垫，完成试纸组成后，用切割机将贴好的粘贴支架切成宽度10-14 mm宽的试纸条，将裁切好的试纸条正确放在试纸盒内。
所述的酸纤维素膜上用低温蜡修饰的方法是通过将液态的低温蜡直接在硝酸纤维素膜画出所需线条，待低温蜡凝固后形成低温蜡带。
所述的酸纤维素膜上用低温蜡修饰的方法是在硝酸纤维素膜上覆盖有镂空图案的遮挡板，然后将液态低温蜡涂抹在有镂空图案的遮挡板上，液态低温蜡通过镂空图案涂抹在硝酸纤维素膜上，待低温蜡凝固后形成低温蜡带。
所述的干燥环境为温度30-40℃，湿度<30%的环境下。
所述的粘贴支架采用聚氯乙烯塑料。
所述缓冲液的成分包括：体积摩尔浓度为20 mmol/L四硼酸钠、体积百分浓度1 %牛血清白蛋白、质量百分浓度2 %蔗糖、体积百分浓度0.1 %TritonX-100、质量百分浓度0.1%叠氮钠、余量为水；所述的样品垫处理液的成分包括：体积百分浓度0.08-0.3 % TritonX-100、质量百分浓度0.01-0.05 % 叠氮钠、溶剂采用体积摩尔浓度0.005-0.02mol/L 磷酸盐缓冲液。
本发明的有益效果是：
1、可以在一张检测试纸上同时进行五种呼吸道病原体的检测。
2、五种呼吸道病原体检测的过程互不干扰，能提高灵敏度和准确率。
3、仅需一次取样一次加样即可进行五项指标的检测，可减少耗时，保证加样一致性。
4、一张试纸即可检测五种呼吸道病原体，可降低检测成本，简化操作，方便快捷。
5、低温蜡修饰方法无需使用专业仪器，如光固化树脂打印机、紫外灯等。本发明所提供的方案简单易行，制作成本低，有大规模应用的潜力。
附图说明
图1为本发明中试纸的结构示意图。
图2为本发明中低温蜡直接修饰方法。
图3为本发明中低温蜡配合镂空图案的修饰方法。
图示标记：1、粘贴支架，2、吸水纸，3、硝酸纤维素膜，3.1、质控线，3.2、检测线，3.2.1、包被了重组新冠病毒抗原的检测线，3.2.2、包被了重组流感病毒抗原的检测线，3.2.3、包被了重组腺病毒抗原的检测线，3.2.4、包被了重组鼻病毒抗原的检测线，3.2.5、包被了重组呼吸道合胞病毒抗原的检测线，3.3、疏水区，3.4、亲水区，4、结合垫，喷涂了兔抗鼠IgG抗体胶体金标记物和兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物，5、样品垫。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围 。
一种多种呼吸道病原体快速检测试纸，包括采用聚氯乙烯塑料的粘贴支架1，粘贴支架1上粘贴有硝酸纤维素膜3，硝酸纤维素膜3上设置有若干条沿其长度方向间隔分布的低温蜡带，硝酸纤维素膜垂直与低温蜡带还设置有间隔分布的质控线3.1和检测线3.2，低温蜡带所在位置形成疏水区3.3，低温蜡带两侧亲水区3.4，质控线3.1和检测线3.2均被低温蜡带分割为间隔的多段，粘贴支架的其中一端上还粘贴有吸水纸2，吸水纸叠压在硝酸纤维素膜的其中一端上的所有疏水区和亲水区，硝酸纤维素膜远离吸水纸一端叠压有结合垫4，结合垫远离硝酸纤维素膜的一端向外延伸后粘贴在粘贴支架上，粘贴支架上远离吸水纸的一端上粘贴有样品垫5，样品垫的其中一端叠压在结合垫上。
所述的粘贴支架1外部设置有用于容纳粘贴支架的试纸盒。
制备所述的一种多种呼吸道病原体快速检测试纸的方法，包括如下步骤：
步骤一、胶体金的制备：采用化学还原法，在氯金酸水溶液中加入柠檬酸三钠还原剂，制备胶体金颗粒，将500mL超纯水加热至沸腾，加入5mL质量含量为1 %氯金酸水溶液和15mL质量含量为1 %柠檬酸三纳水溶液，搅拌均匀，保持沸腾，待胶体金溶液颜色由蓝变紫再变酒红色后，冷却，用0.1 mol/L的碳酸钾水溶液调节pH值至7.2，室温避光保存备用，所制得的胶体金粒径为15-35nm；
步骤二、胶体金标记物的制备：兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物的制备过程是，取1支2 mL离心管，加入800 μL兔抗人IgG/IgM抗体和1 mL胶体金，室温反应30 min，用高速冷冻离心机4 ℃ 12000 r/min离心30 min，弃去上清，用100 μL缓冲液（所述缓冲液的成分包括：体积摩尔浓度为20 mmol/L四硼酸钠、体积百分浓度1 %牛血清白蛋白、质量百分浓度2%蔗糖、体积百分浓度0.1 %TritonX-100、质量百分浓度0.1 %叠氮钠、余量为水），混匀，置于4 ℃备用；
兔抗鼠IgG抗体胶体金标记物的制备过程是，取1支2 mL离心管，加入800 μL兔抗鼠IgG抗体和1 mL胶体金，室温反应30 min，用高速冷冻离心机4 ℃ 12000 r/min离心30 min，弃去上清，用100 μL 缓冲液重悬（体积摩尔浓度为20 mmol/L四硼酸钠、体积百分浓度1 %牛血清白蛋白、质量百分浓度2 %蔗糖、体积百分浓度0.1 %TritonX-100、质量百分浓度0.1 %叠氮钠、余量为水），混匀，置于4 ℃备用；
步骤三、胶体金标记物在结合垫上喷涂：将兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物与兔抗鼠IgG抗体胶体金标记物混合，并将其喷涂在不同的玻璃纤维膜上，干燥得到结合垫。每种胶体金标记物喷涂量为1.0-3.0μL/cm。试纸组装前将结合垫裁剪成2 x 7mm的尺寸；
步骤四、硝酸纤维素膜的修饰：在硝酸纤维素膜上用低温蜡进行修饰若干条间隔设置的低温蜡带；
步骤五、抗原抗体在硝酸纤维素膜上包被：在修饰过的硝酸纤维素膜的每个亲水通道上分别包被重组新冠病毒抗原、重组流感病毒抗原、重组腺病毒抗原、重组鼻病毒抗原和重组呼吸道合胞病毒抗原作为五种病原体的人IgG/IgM检测线。每种病原体重组抗原包被蛋白浓度为0.75-1mg/mL。同时，在硝酸纤维素膜的每个亲水通道上包被鼠IgG抗体，作为质控线。鼠IgG抗体包被蛋白浓度为1.0-1.5mg/mL；
步骤六、样品垫与吸水纸的处理：将样品垫在样品垫处理液（所述样品垫处理液的成分包括：体积百分浓度0.1 % TritonX-100、质量百分浓度0.03 % 叠氮钠、溶剂采用体积摩尔浓度0.01mol/L 磷酸盐缓冲液。）中充分浸泡，56 ℃干燥1 h，置于内有干燥剂的自封袋中真空密封，4℃保存，将吸水垫密封，室温保存；
步骤七、切割装配：在干燥环境下，温度35℃，湿度<30%中取粘贴支架，在粘贴支架的中央贴上经过低温蜡修饰的喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，吸水纸紧贴粘贴支架叠压在硝酸纤维素膜的一端，硝酸纤维素膜的另一端粘贴结合垫，结合垫远离硝酸纤维素膜的一端粘贴样品垫，完成试纸组成后，用切割机将贴好的粘贴支架切成宽度10-14 mm宽的试纸条，每张试纸条上包含可以检测五种呼吸道病原体的检测通道，将裁切好的试纸条正确放在试纸盒内，经过低温蜡修饰的区域即为疏水区3.3，未经低温蜡修饰的区域即为亲水区3.4，作为病原体检测通道，质控线3.1包被了鼠IgG抗体，检测线包括包被了重组新冠病毒抗原的检测线3.2.1、包被了重组流感病毒抗原的检测线3.2.2、包被了重组腺病毒抗原的检测线3.2.3、包被了重组鼻病毒抗原的检测线3.2.4、包被了重组呼吸道合胞病毒抗原的检测线3.2.5作为五种病原体的人IgG/IgM检测线，结合垫4喷涂了兔抗鼠IgG抗体胶体金标记物和兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物。
所述的酸纤维素膜上用低温蜡修饰的方法是通过挑取液态的低温蜡，直接在硝酸纤维素膜画出，待低温蜡凝固后低温蜡带，具体为将硝酸纤维素膜裁剪为20mm x 14mm 的尺寸如图2，取0.5~1g低温蜡置于药勺中，利用酒精灯加热，待低温蜡熔化成液态，用干净的1mL注射器针头等工具挑取液态的低温蜡，并在硝酸纤维素膜上画出宽约1mm直线，共画4条。该4条只是为了演示低温蜡修饰方法，可以根据需要增加为5条或者其他数量与试纸对应，各相隔2mm，最左侧与最右侧的直线与硝酸纤维素膜的长边相距约2mm，等待低温蜡冷却凝固，硝酸纤维素膜上即疏水区和亲水区。其中经过低温蜡修饰的地方为疏水区，其余地方为亲水区。滴加样品后，样品会沿着亲水区流动。
所述的酸纤维素膜上用低温蜡修饰的方法是在硝酸纤维素膜上覆盖有镂空图案的遮挡板，然后将液态低温蜡涂抹在有镂空图案的遮挡板上，液态低温蜡通过镂空图案涂抹在硝酸纤维素膜上，待低温蜡凝固后低温蜡带，将硝酸纤维素膜裁剪为合适的大小，如图3取适量的低温蜡置于药勺中，利用酒精灯加热至低温蜡变为液态。将有镂空图案的遮挡板覆盖在硝酸纤维素膜上面。将低温蜡填涂到镂空图案中，亦是硝酸纤维素膜上，涂抹完后待低温蜡冷却，拿开遮挡板，即在硝酸纤维素膜上疏水区与亲水区。
多种呼吸道病原体检测试纸的检测过程。取适量的血液，滴加到样品垫上，等待15分钟，然后读取结果。正常人的血液中没有呼吸道病原体的人IgG/IgM。样品通过样品垫流向结合垫，携带结合垫上的胶体金标记物通过硝酸纤维素膜，经过硝酸纤维素膜的检测线时无反应，经过质控线时兔抗鼠IgG抗体胶体金标记物与鼠IgG结合，质控线显红色。患有五种呼吸道病原体中的一种或多种时，病人的血液中含有相应的人IgG/IgM，样品流到结合垫时，该种病原体的人IgG/IgM会与兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物结合形成复合物。此复合物经过相应的硝酸纤维素膜的检测线时，复合物的人IgG/IgM与重组病原体抗原结合，相应的病原体检测线显红色。样品继续经过质控线时兔抗鼠IgG抗体胶体金标记物与鼠IgG结合，质控线显红色。所以，只有质控线显红色时，检测结果为呼吸道病原体检测阴性。当一种或多种病原体的检测线显红色，同时质控线显红色时，检测结果为一种或多种呼吸道病原体检测阳性。若质控线不显红色，则检测结果无效。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种多种呼吸道病原体快速检测试纸，其特征在于：包括粘贴支架，粘贴支架上粘贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有若干条沿其长度方向间隔分布的低温蜡带，硝酸纤维素膜垂直于低温蜡带还设置有间隔分布的质控线和检测线，低温蜡带所在位置形成疏水区，低温蜡带两侧为亲水区，质控线和检测线均被低温蜡带分割为间隔的多段，粘贴支架的其中一端上还粘贴有吸水纸，吸水纸叠压在硝酸纤维素膜的其中一端上的所有疏水区和亲水区，硝酸纤维素膜远离吸水纸一端上的所有疏水区和亲水区叠压有结合垫，结合垫远离硝酸纤维素膜的一端向外延伸后粘贴在粘贴支架上，粘贴支架上远离吸水纸的一端上粘贴有样品垫，样品垫的其中一端叠压在结合垫上。
2.根据权利要求1所述的一种多种呼吸道病原体快速检测试纸，其特征在于：所述的粘贴支架外部设置有用于容纳粘贴支架的试纸盒。
3.制备权利要求1或2所述的一种多种呼吸道病原体快速检测试纸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、胶体金的制备：采用化学还原法，在氯金酸水溶液中加入柠檬酸三钠还原剂，制备胶体金颗粒；
步骤二、胶体金标记物的制备：兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物的制备过程是，取离心管加入兔抗人IgG/IgM抗体和胶体金，室温反应并用高速冷冻离心机离心处理，弃去上清，用缓冲液重悬，混匀保存备用；
步骤三、胶体金标记物在结合垫上喷涂：将兔抗人IgG/IgM抗体胶体金标记物和兔抗鼠IgG抗体胶体金标记物混合，并将其喷涂在不同的玻璃纤维膜上，干燥后得到结合垫；
步骤四、硝酸纤维素膜的修饰：在硝酸纤维素膜上用低温蜡进行修饰若干条间隔设置的低温蜡带；
步骤五、抗原抗体在硝酸纤维素膜上包被：在修饰过的硝酸纤维素膜的每个亲水区通道上分别包被不同待检测病原体抗原作为检测线，并包被鼠IgG作为质控线；
步骤六、样品垫与吸水纸的处理：将样品垫在样品垫处理液中充分浸泡， 在50-60 ℃干燥处理，置于内有干燥剂的自封袋中真空密封保存，将吸水垫密封，室温保存；
步骤七、切割装配：在干燥环境下取粘贴支架，在粘贴支架的中央贴上经过低温蜡修饰的喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，吸水纸紧贴粘贴支架叠压在硝酸纤维素膜的一端，硝酸纤维素膜的另一端粘贴结合垫，结合垫远离硝酸纤维素膜的一端粘贴样品垫，完成试纸组成后，用切割机将贴好的粘贴支架切成宽度10-14 mm宽的试纸条，将裁切好的试纸条正确放在试纸盒内。
4.根据权利要求3所述的制备一种多种呼吸道病原体快速检测试纸的方法，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜上用低温蜡修饰的方法是通过将液态的低温蜡直接在硝酸纤维素膜画出所需线条，待低温蜡凝固后形成低温蜡带。
5.根据权利要求3所述的制备一种多种呼吸道病原体快速检测试纸的方法，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜上用低温蜡修饰的方法是在硝酸纤维素膜上覆盖有镂空图案的遮挡板，然后将液态低温蜡涂抹在有镂空图案的遮挡板上，液态低温蜡通过镂空图案涂抹在硝酸纤维素膜上，待低温蜡凝固后形成低温蜡带。
6.根据权利要求3所述的制备一种多种呼吸道病原体快速检测试纸的方法，其特征在于：所述的干燥环境为温度30-40℃，湿度<30%的环境下。
7.根据权利要求3所述的制备一种多种呼吸道病原体快速检测试纸的方法，其特征在于：所述的粘贴支架采用聚氯乙烯塑料。
8.根据权利要求3所述的制备一种多种呼吸道病原体快速检测试纸的方法，其特征在于：所述缓冲液的成分包括：体积摩尔浓度为20 mmol/L四硼酸钠、体积百分浓度1 %牛血清白蛋白、质量百分浓度2 %蔗糖、体积百分浓度0.1 %TritonX-100、质量百分浓度0.1 %叠氮钠、余量为水；所述的样品垫处理液的成分包括：体积百分浓度0.08-0.3 % TritonX-100、质量百分浓度0.01-0.05 % 叠氮钠、溶剂采用体积摩尔浓度0.005-0.02mol/L 磷酸盐缓冲液。
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