CN112680441B - 一种检测4种紫花苜蓿rna病毒的成套试剂与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂与方法。本发明公开的检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂包括名称分别为AMV‑P、MsAPV1‑P、MsDPV1‑P和MsAV1‑P的引物对；AMV‑P由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成，MsAPV1‑P由序列表中序列3和4所示的两条单链DNA组成，MsDPV1‑P由序列表中序列5和6所示的两条单链DNA组成，MsAV1‑P由序列表中序列7和8所示的两条单链DNA组成。实验证明，本发明的成套试剂可以成功检测紫花苜蓿的AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1这4种病毒，可广泛应用于田间紫花苜蓿是否感染这4种病毒的检测工作中。
Description
技术领域
本发明涉及植物检疫技术领域中，一种检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂与方法。
背景技术
紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，其营养成分高，广泛应用在我国畜牧业。紫花苜蓿在我国的种植逐年增加，在其生长过程中遇到的病害种类也逐渐增多。病毒病是紫花苜蓿主产区的重要病害之一，紫花苜蓿被病毒侵染后终身带毒，病毒粒子的增殖、扩散严重干扰植株的正常生长发育，使植物矮化、叶片褪绿、花叶、皱缩等，导致产量下降，对苜蓿产业造成极大的经济损失。目前，我国紫花苜蓿上苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus,AMV)，紫花苜蓿alpha双分病毒1(Medicago sativa alphapartitivirus 1,MsAPV1)，紫花苜蓿delta双分病毒1(Medicago sativa deltapartitivirus 1,MsDPV1)，紫花苜蓿amavirus病毒1(Medicago sativa amalgavirus 1,MsAV1)这4种病毒分布极广，且在植物体内通常会伴生出现，共同危害，因此加强紫花苜蓿病毒病的检疫检测极为重要。
紫花苜蓿病毒病防治极其困难，至今无完全有效的方法，因此加强病毒的早期检测，及时采取防控措施，是预防与控制紫花苜蓿病毒的重要手段。目前针对紫花苜蓿病毒鉴定方法主要包括生物学检测、电镜观察、血清学检测和分子生物学检测四种方法，其中PCR检测方法以其较高的灵敏度和特异性广受青睐，但是面对紫花苜蓿病毒病通常是存在复合侵染的现象，单重PCR检测需要进行多次实验，成本高且费时费力，目前急需一种可以同时检测四种病毒的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何同时检测4种紫花苜蓿RNA病毒，这4种紫花苜蓿RNA病毒为AMV(苜蓿花叶病毒，Alfalfa mosaic virus)、MsAPV1(紫花苜蓿alpha双分病毒1，Medicago sativa alphapartitivirus 1)、MsDPV1(紫花苜蓿delta双分病毒1，Medicago sativa deltapartitivirus 1)和MsAV1(紫花苜蓿amavirus病毒1，Medicagosativa amalgavirus 1)。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套试剂，所述成套试剂包括名称分别为AMV-P、MsAPV1-P、MsDPV1-P和/或MsAV1-P的引物对；
所述AMV-P由名称分别为AMV-F和AMV-R的单链DNA组成，所述AMV-F和所述AMV-R的序列分别为序列表中序列1和2；
所述MsAPV1-P由名称分别为MsAPV1-F和MsAPV1-R的单链DNA组成，所述MsAPV1-F和所述MsAPV1-R的序列分别为序列表中序列3和4；
所述MsDPV1-P由名称分别为MsDPV1-F和MsDPV1-R的单链DNA组成，所述MsDPV1-F和所述MsDPV1-R的序列分别为序列表中序列5和6；
所述MsAV1-P由名称分别为MsAV1-F和MsAV1-R的单链DNA组成，所述MsAV1-F和所述MsAV1-R的序列分别为序列表中序列7和8。
上述成套试剂还可包括名称为actin2-P的引物对，所述actin2-P由名称分别为actin2-F和actin2-R的单链DNA组成，所述actin2-F和所述actin2-R的序列分别为序列表中序列9和10。
所述成套试剂可由所述AMV-P、所述MsAPV1-P、所述MsDPV1-P和/或所述MsAV1-P组成，还可由所述actin2-P与AMV-P、所述MsAPV1-P、所述MsDPV1-P和/或所述MsAV1-P组成。所述成套试剂中各单链DNA均可独立包装。
所述成套试剂中，所述actin2-F、所述actin2-R、所述AMV-F、所述AMV-R、所述MsAPV1-F、所述MsAPV1-R、所述MsDPV1-F、所述MsDPV1-R、所述MsAV1-F和所述MsAV1-R的摩尔比可为24:24:1:1:2:2:28:28:28:28。
所述成套试剂可具有如下任一用途：
A1、检测紫花苜蓿RNA病毒；所述紫花苜蓿RNA病毒为AMV、MsAPV1、MsDPV1和/或MsAV1；
A2、制备检测所述紫花苜蓿RNA病毒的产品；
A3、检测待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒；
A4、制备检测待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒的产品。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述成套试剂。
所述试剂盒可具有如下任一用途：
A1、检测紫花苜蓿RNA病毒；所述紫花苜蓿RNA病毒为AMV、MsAPV1、MsDPV1和/或MsAV1；
A2、制备检测所述紫花苜蓿RNA病毒的产品；
A3、检测待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒；
A4、制备检测待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒的产品。
本发明还提供了所述成套试剂或所述试剂盒的下述任一应用：
A1、检测紫花苜蓿RNA病毒；所述紫花苜蓿RNA病毒为为AMV、MsAPV1、MsDPV1和/或MsAV1；
A2、制备检测所述紫花苜蓿RNA病毒的产品；
A3、检测待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒；
A4、制备检测待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒的产品。
上文中，所述待测植物可为紫花苜蓿。
上文中，所述产品可为试剂盒。
本发明还提供了检测待测植物是否感染了紫花苜蓿RNA病毒的方法，所述紫花苜蓿RNA病毒为为AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1，所述方法包括：以待测植物的总RNA转录得到的cDNA为模板，利用所述成套试剂进行多重PCR扩增，得到PCR产物，检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物中不含有144bp的DNA片段，实验不成立，如所述PCR产物中含有144bp的DNA片段，根据所述PCR产物中DNA片段的有无和大小确定所述待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒：
如所述PCR产物含有351bp且不含有517、237、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV且未感染或候选未感染MsAPV1、MsDPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有517bp且不含有351、237、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAPV1且未感染或候选未感染AMV、MsDPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有237bp且不含有351、517、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsDPV1且未感染或候选未感染AMV、MsAPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有721bp且不含有351、517、237bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAV1且未感染或候选未感染AMV、MsAPV1、MsDPV1；
如所述PCR产物含有351、517bp且不含有237、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAPV1且未感染或候选未感染MsDPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有351、237bp且不含有517、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsDPV1且未感染或候选未感染MsAPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有351、721bp且不含有517、237bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAV1且未感染或候选未感染MsAPV1、MsDPV1；
如所述PCR产物含有517、237bp且不含有351、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAPV1、MsDPV1且未感染或候选未感染AMV、MsAV1；
如所述PCR产物含有517、721bp且不含有351、237bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAPV1、MsAV1且未感染或候选未感染AMV、MsDPV1；
如所述PCR产物含有237、721bp且不含有351、517bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsDPV1、MsAV1且未感染或候选未感染AMV、MsAPV1；
如所述PCR产物含有351、517、237bp且不含有721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAPV1、MsDPV1且未感染或候选未感染MsAV1；
如所述PCR产物含有351、517、721bp且不含有237bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAPV1、MsAV1且未感染或候选未感染MsDPV1；
如所述PCR产物含有351、237、721bp且不含有517bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsDPV1、MsAV1且未感染或候选未感染MsAPV1；
如所述PCR产物含有517、237、721bp且不含有351bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAPV1、MsDPV1、MsAV1且未感染或候选未感染AMV；
如所述PCR产物含有351、517、237、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAPV1、MsDPV1、MsAV1；
如所述PCR产物不含有351、517、237、721bp的DNA片段，所述待测植物未感染或候选未感染AMV、MsAPV1、MsDPV1、MsAV1。
上述方法中，所述多重PCR扩增的反应体系中，所述actin2-F、所述actin2-R、所述AMV-F、所述AMV-R、所述MsAPV1-F、所述MsAPV1-R、所述MsDPV1-F、所述MsDPV1-R、所述MsAV1-F、所述MsAV1-R的浓度分别可为0.24、0.24、0.1、0.1、0.2、0.2、0.28、0.28、0.28、0.28μM。
所述多重PCR扩增的反应体系可为实施例中表2的D体系。
上述方法中，所述多重PCR扩增的退火温度为55℃。
所述多重PCR扩增的反应条件可为94℃预变性3min；然后94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
上述方法中，所述待测植物可为紫花苜蓿。
实验证明，本发明检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂与方法可以成功检测紫花苜蓿是否感染苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)，紫花苜蓿alpha双分病毒1(Medicago sativa alphapartitivirus 1,MsAPV1)，紫花苜蓿delta双分病毒1(Medicagosativa deltapartitivirus 1,MsDPV1)，紫花苜蓿amavirus病毒1(Medicago sativaamalgavirus 1,MsAV1)这4种病毒，还可以准确检测出紫花苜蓿是单一或混合感染，还具有特异性强、省事便捷、节省成本、可靠实用的特点，可广泛应用于田间紫花苜蓿是否感染这4种病毒的检测工作中。
附图说明
图1为单重PCR产物凝胶电泳图。泳道M为DNA分子量标准DNA maker，泳道1-5依次为actin2，MsDPV1,AMV,MsAPV1,MsAV1结果。
图2为不同引物浓度组合PCR产物的凝胶电泳图。泳道A-E依次为A体系-E体系的结果，泳道M为DNA分子量标准。
图3为不同退火温度PCR产物的凝胶电泳图。泳道M为DNA分子量标准，泳道1-3的退火温度依次为55℃、58℃和60℃。
图4引物对灵敏性凝胶电泳图.泳道M为DNA分子量标准，泳道1-4的cDNA模板依次稀释了10倍、100倍、1000倍和10000倍。
图5为单重及多重PCR产物的电泳结果。泳道M为DNA分子量标准，从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道1-10分别为10份待测样品，泳道11为阳性对照(实施例2的样品1)，泳道12为阴性对照(以ddH2O为模板)。该图中上面五排结果为单重PCR结果，最下面一排为多重PCR结果。1号样品感染MsAPV1、MsDPV1和MsAV1；2号样品感染MsAPV1、MsDPV1和MsAV1；3号样品感染MsAPV1和MsDPV1；4号样品感染AMV、MsAPV1和MsDPV1；5号样品感染MsDPV1和MsAV1；6号样品感染AMV和MsDPV1；7号样品感染AMV、MsAPV1和MsAV1；8号样品感染AMV、MsAPV1和MsAV1；9号样品感染AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1；10号样品感染AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂的制备
本发明提供的检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂由检测苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)的引物对AMV-P、检测紫花苜蓿alpha双分病毒1(Medicagosativa alphapartitivirus 1,MsAPV1)的引物对MsAPV1-P、检测紫花苜蓿delta双分病毒1(Medicago sativa deltapartitivirus 1,MsDPV1)的引物对MsDPV1-P、检测紫花苜蓿amavirus病毒1(Medicago sativa amalgavirus 1,MsAV1)的引物对MsAV1-P组成。其中，AMV-P由名称分别为AMV-F和AMV-R的单链DNA组成；MsAPV1-P由名称分别为MsAPV1-F和MsAPV1-R的单链DNA组成；MsDPV1-P由名称分别为MsDPV1-F和MsDPV1-R的单链DNA组成；MsAV1-P由名称分别为MsAV1-F和MsAV1-R的单链DNA组成，各引物的序列见表1。
检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂中AMV-F、AMV-R、MsAPV1-F、MsAPV1-R、MsDPV1-F、MsDPV1-R、MsAV1-F、MsAV1-R的摩尔比为1:1:2:2:28:28:28:28，各引物均可独立包装。
后续实验所用内参引物(actin2-F和actin2-R)的序列见表1，actin2-F和actin2-R与AMV-F、AMV-R、MsAPV1-F、MsAPV1-R、MsDPV1-F、MsDPV1-R、MsAV1-F、MsAV1-R的摩尔比为24:24:1:1:2:2:28:28:28:28。
表1、引物序列及片段大小
实施例2、单重RT-PCR验证
1.待检测样品信息
选取北京市采集的病毒病症状紫花苜蓿样品10份。混样进行转录组测序，结果显示这些样品中存在多种病毒复合侵染的现象，因此用特异性引物进行RT-PCR验证分析。
2.RNA提取
取紫花苜蓿叶片0.05-0.1g，用液氮快速研磨，之后加入1ml Trizol裂解液，室温静置5min；加入0.2ml三氯甲烷，剧烈涡旋振荡15s，室温孵育2-3min；12000g、4℃高速离心15min，取上清液至新管中；加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；12000g、4℃高速离心10min；移除上清，DEPC水配置的75％乙醇清洗两次；12000g、4℃高速离心5min；移除乙醇，RNA干燥5-10min，根据RNA量选择20-40μl RNase-free水溶解RNA。取1μl RNA溶液于琼脂糖凝胶电泳中检测，1μL用NanoDrop测定其浓度，其余置于-80℃冰箱保存备用。
3.反转录
向RNase-free的20μL离心管中加入1μg RNA，按照TAKARA公司的1st strand cDNASynthesis Kit(6110A)试剂盒说明书步骤获得第一链cDNA，置于-20℃保存备用。
4.PCR反应体系与条件
反应体系：cDNA 0.5μL，2×Tag PCR Mix(天根生化科技有限公司(货号：KT201))12.5μL，引物浓度为10μmol/L的各病毒或内参正向引物0.5μL、反向引物0.5μL，ddH2O 11μL。
PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后94℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，如此共30个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸5min，之后置于4℃，反应结束。
5.电泳及序列验证
取5μl反应产物在1×TAE缓冲液配置的2％琼脂糖凝胶中120V电泳30min，之后置于凝胶成像系统观察。
为验证所所使用的引物对目标基因的检测特异性，对PCR产物进行电泳(图1)和测序。电泳结果显示，PCR反应产物在相应位置有清晰条带。测序结果提交NCBI进行BLAST，结果显示，利用AMV-P得到的PCR产物序列为AMV的序列，利用MsAPV1-P得到的PCR产物的序列为MsAPV1的序列，利用MsDPV1-P得到的PCR产物的序列为MsDPV1的序列，利用MsAV1-P得到的PCR产物的序列为MsAV1的序列。
实验结果还显示，所采集的10份紫花苜蓿样品均含有四种紫花苜蓿RNA病毒AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1。将这10份紫花苜蓿样品混样后作为阳性对照：样品1，其cDNA浓度为1082.7ng/ul。
实施例3、检测4种紫花苜蓿RNA病毒的多重PCR的方法的建立
1.多重PCR反应体系的建立和优化
以实施例2的紫花苜蓿样品1的cDNA为模板，建立检测4种病毒的25μL多重PCR体系。按照表2中A体系-E体系调整反应体系中各物质的添加量，依次得到A体系-E体系，筛选合适的引物浓度。表2中，2×Taq表示2×Tag PCR Mix，天根生化科技有限公司(货号：KT201)。
表2、引物浓度配比组合筛选
将所得A体系-E体系按照如下反应条件进行反应：94℃预变性3min；然后94℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
各取5μl反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶，如图2所示，D体系的PCR反应产物在相应位置有清晰分明的条带，该体系中actin2-P的两条引物的浓度均为0.24μM，AMV-P的两条引物的浓度均为0.1μM，MsAPV1-P的两条引物的浓度均为0.2μM，MsDPV1-P的两条引物的浓度均为0.28μM，MsAV1-P的两条引物的浓度均为0.28μM。
2.多重PCR反应条件的建立和优化
按照表2制备D体系，将所得D体系在不同的退火温度下进行PCR反应，退火温度设为55℃、58℃、60℃。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性10s，相应退火温度下退火10s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
将所得不同退火温度下的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶，如图3所示，结果显示最佳退火温度为55℃。
3.检测4种紫花苜蓿RNA病毒的多重PCR的方法
根据上文，得到检测4种紫花苜蓿RNA病毒的多重PCR的方法如下：
提取待测样品的总RNA，并反转录为cDNA，按照表2中体系D的制备检测待测样品cDNA的多重PCR体系，进行多重PCR，PCR反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
通过电泳或测序检测所得PCR产物，如PCR产物中不含有144bp的DNA片段，实验不成立，如PCR产物中含有144bp的DNA片段，实验成立。根据PCR产物中DNA片段的有无和大小确定待测样品是否感染了4种紫花苜蓿RNA病毒，如PCR产物中含有相应病毒引物对所识别靶片段大小的DNA片段，则待测样品感染了相应病毒，如PCR产物中不含相应病毒引物对所识别靶片段大小的DNA片段，则待测样品未感染相应病毒，具体如下：
如PCR产物含有351bp且不含有517、237、721bp的DNA片段，待测样品感染了AMV且未感染MsAPV1、MsDPV1、MsAV1；
如PCR产物含有517bp且不含有351、237、721bp的DNA片段，待测样品感染了MsAPV1且未感染AMV、MsDPV1、MsAV1；
如PCR产物含有237bp且不含有351、517、721bp的DNA片段，待测样品感染了MsDPV1且未感染AMV、MsAPV1、MsAV1；
如PCR产物含有721bp且不含有351、517、237bp的DNA片段，待测样品感染了MsAV1且未感染AMV、MsAPV1、MsDPV1；
如PCR产物含有351、517bp且不含有237、721bp的DNA片段，待测样品感染了AMV、MsAPV1且未感染MsDPV1、MsAV1；
如PCR产物含有351、237bp且不含有517、721bp的DNA片段，待测样品感染了AMV、MsDPV1且未感染MsAPV1、MsAV1；
如PCR产物含有351、721bp且不含有517、237bp的DNA片段，待测样品感染了AMV、MsAV1且未感染MsAPV1、MsDPV1；
如PCR产物含有517、237bp且不含有351、721bp的DNA片段，待测样品感染了MsAPV1、MsDPV1且未感染AMV、MsAV1；
如PCR产物含有517、721bp且不含有351、237bp的DNA片段，待测样品感染了MsAPV1、MsAV1且未感染AMV、MsDPV1；
如PCR产物含有237、721bp且不含有351、517bp的DNA片段，待测样品感染了MsDPV1、MsAV1且未感染AMV、MsAPV1；
如PCR产物含有351、517、237bp且不含有721bp的DNA片段，待测样品感染了AMV、MsAPV1、MsDPV1且未感染MsAV1；
如PCR产物含有351、517、721bp且不含有237bp的DNA片段，待测样品感染了AMV、MsAPV1、MsAV1且未感染MsDPV1；
如PCR产物含有351、237、721bp且不含有517bp的DNA片段，待测样品感染了AMV、MsDPV1、MsAV1且未感染MsAPV1；
如PCR产物含有517、237、721bp且不含有351bp的DNA片段，待测样品感染了MsAPV1、MsDPV1、MsAV1且未感染AMV；
如PCR产物含有351、517、237、721bp的DNA片段，待测样品感染了AMV、MsAPV1、MsDPV1、MsAV1；
如PCR产物不含有351、517、237、721bp的DNA片段，待测样品未感染AMV、MsAPV1、MsDPV1、MsAV1。
实施例4、利用实施例1的成套试剂检测4种紫花苜蓿RNA病毒的灵敏性
按照实施例2获得的样品1的cDNA浓度分别稀释10倍，100倍，1000倍和10000倍(即10-1-10-4)后作为模板，按照实施例3的D体系和最佳退火温度为55℃下进行多重PCR，结果表明(如图4)当cDNA稀释10和100倍时均能很好的检测出AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1四种病毒；当稀释1000倍时，AMV、MsAPV1能被检测出来，但条带模糊；当稀释到10000倍时，已检测不到四种病毒。因此该多重PCR体系的检测底线是实施例2获得的样品1的cDNA稀释100倍。
实施例5、利用实施例1的成套试剂检测野外紫花苜蓿是否感染4种紫花苜蓿RNA病毒
待测样品：采集10份野外紫花苜蓿叶片，提取总RNA并取1μg RNA反转录为cDNA。
1.紫花苜蓿叶片感染4种紫花苜蓿RNA病毒的检测
按照实施例2的方法分别对10份野外采集紫花苜蓿叶片是否感染4种紫花苜蓿RNA病毒进行检测，结果显示，这10份样品单独或同时感染了AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1中不同种类。
2.利用实施例1的成套试剂检测野外紫花苜蓿是否感染4种紫花苜蓿RNA病毒
按照实施例2中的最佳体系D体系制备各样品的反应体系，然后将所得反应体系在最佳退火温度(55℃)下按照实施例2的反应条件进行反应，分别得到10份样品的多重PCR产物。
然后采用实施例1的actin2-P、MsDPV1-P、AMV-P、MsAPV1-P和MsAV1-P分别对这10份样品分别进行单重PCR，分别得到这10份样品的各引物对的单重PCR产物。
actin2-P的单重PCR的反应体系为：cDNA 0.5μL，2×Tag PCR Mix 12.5μL，actin2-F(浓度为10nM)1μL，actin2-R(浓度为10nM)1μL，ddH2O补足25μL。
MsDPV1-P的单重PCR的反应体系为：cDNA 0.5μL，2×Tag PCR Mix 12.5μL，MsDPV1-F(浓度为10nM)1μL，MsDPV1-R(浓度为10nM)1μL，ddH2O补足25μL。
AMV-P的单重PCR的反应体系为：cDNA 0.5μL，2×Tag PCR Mix 12.5μL，AMV-F(浓度为10nM)1μL，AMV-R(浓度为10nM)1μL，ddH2O补足25μL。
MsAPV1-P的单重PCR的反应体系为：cDNA 0.5μL，2×Tag PCR Mix 12.5μL，MsAPV1-F(浓度为10nM)1μL，MsAPV1-R(浓度为10nM)1μL，ddH2O补足25μL。
MsAV1-P的单重PCR的反应体系为：cDNA 0.5μL，2×Tag PCR Mix 12.5μL，MsAV1-F(浓度为10nM)1μL，MsAV1-R(浓度为10nM)1μL，ddH2O补足25μL。
所用单重PCR的反应条件均为：94℃预变性3min；然后94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
对各PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳并进行测序，结果如图5所示，测序和电泳结果表明这10份样品的多重PCR反应结果与单重PCR反应结果均一致，也与步骤1的结果均一致，表明，本发明的实施例1的成套试剂可以进行多重PCR检测待测样品是否感染AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1，且准确性高。
说明本发明建立的多重PCR检测紫花苜蓿内参基因与四种病毒病的方法可靠实用，有特异性强、省事便捷、节省成本的优点，可被广泛应用于田间紫花苜蓿感染病毒的检测工作中。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂与方法
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
tccatcatga gttcttcaca aaag 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
cgtcacgtca tcagtgagac aa 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tctgacttgc gccattaccc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gcatcctaga ggaggcccat t 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gaagcgttct tatcccactg gtcc 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
cgcaagcacg acatcatact cat 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
gctgtcccaa gttcttatcc tgc 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
gatctaattc catcgagcca cctc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
caaaagatgg cagatgctga ggat 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
catgacacca gtatgacgag gtcg 24
Claims (8)
1.成套试剂，由名称分别为actin2-P、AMV-P、MsAPV1-P、MsDPV1-P和MsAV1-P的引物对组成；
所述AMV-P由名称分别为AMV-F和AMV-R的单链DNA组成，所述AMV-F和所述AMV-R的序列分别为序列表中序列1和2；
所述MsAPV1-P由名称分别为MsAPV1-F和MsAPV1-R的单链DNA组成，所述MsAPV1-F和所述MsAPV1-R的序列分别为序列表中序列3和4；
所述MsDPV1-P由名称分别为MsDPV1-F和MsDPV1-R的单链DNA组成，所述MsDPV1-F和所述MsDPV1-R的序列分别为序列表中序列5和6；
所述MsAV1-P由名称分别为MsAV1-F和MsAV1-R的单链DNA组成，所述MsAV1-F和所述MsAV1-R的序列分别为序列表中序列7和8；
所述actin2-P由名称分别为actin2-F和actin2-R的单链DNA组成，所述actin2-F和所述actin2-R的序列分别为序列表中序列9和10；
所述成套试剂中，所述actin2-F、所述actin2-R、所述AMV-F、所述AMV-R、所述MsAPV1-F、所述MsAPV1-R、所述MsDPV1-F、所述MsDPV1-R、所述MsAV1-F和所述MsAV1-R的摩尔比为24:24:1:1:2:2:28:28:28:28。
2.一种试剂盒，包括权利要求1所述成套试剂。
3.权利要求1所述成套试剂或权利要求2所述试剂盒的下述任一应用：
A1、检测紫花苜蓿RNA病毒；所述紫花苜蓿RNA病毒为AMV、MsAPV1、MsDPV1和/或MsAV1；
A2、制备检测所述紫花苜蓿RNA病毒的产品；
A3、检测待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒；
A4、制备检测待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒的产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述待测植物为紫花苜蓿。
5.检测待测植物是否感染了紫花苜蓿RNA病毒的方法，所述紫花苜蓿RNA病毒为AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1，所述方法包括：以待测植物的总RNA转录得到的cDNA为模板，利用权利要求1所述的成套试剂进行多重PCR扩增，得到PCR产物，检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物中不含有144bp的DNA片段，实验不成立，如所述PCR产物中含有144bp的DNA片段，根据所述PCR产物中DNA片段的有无和大小确定所述待测植物是否感染了所述紫花苜蓿RNA病毒：
如所述PCR产物含有351bp且不含有517、237、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV且未感染或候选未感染MsAPV1、MsDPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有517bp且不含有351、237、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAPV1且未感染或候选未感染AMV、MsDPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有237bp且不含有351、517、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsDPV1且未感染或候选未感染AMV、MsAPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有721bp且不含有351、517、237bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAV1且未感染或候选未感染AMV、MsAPV1、MsDPV1；
如所述PCR产物含有351、517bp且不含有237、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAPV1且未感染或候选未感染MsDPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有351、237bp且不含有517、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsDPV1且未感染或候选未感染MsAPV1、MsAV1；
如所述PCR产物含有351、721bp且不含有517、237bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAV1且未感染或候选未感染MsAPV1、MsDPV1；
如所述PCR产物含有517、237bp且不含有351、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAPV1、MsDPV1且未感染或候选未感染AMV、MsAV1；
如所述PCR产物含有517、721bp且不含有351、237bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAPV1、MsAV1且未感染或候选未感染AMV、MsDPV1；
如所述PCR产物含有237、721bp且不含有351、517bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsDPV1、MsAV1且未感染或候选未感染AMV、MsAPV1；
如所述PCR产物含有351、517、237bp且不含有721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAPV1、MsDPV1且未感染或候选未感染MsAV1；
如所述PCR产物含有351、517、721bp且不含有237bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAPV1、MsAV1且未感染或候选未感染MsDPV1；
如所述PCR产物含有351、237、721bp且不含有517bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsDPV1、MsAV1且未感染或候选未感染MsAPV1；
如所述PCR产物含有517、237、721bp且不含有351bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了MsAPV1、MsDPV1、MsAV1且未感染或候选未感染AMV；
如所述PCR产物含有351、517、237、721bp的DNA片段，所述待测植物感染了或候选感染了AMV、MsAPV1、MsDPV1、MsAV1；
如所述PCR产物不含有351、517、237、721bp的DNA片段，所述待测植物未感染或候选未感染AMV、MsAPV1、MsDPV1、MsAV1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述多重PCR扩增的反应体系中，所述actin2-F、所述actin2-R、所述AMV-F、所述AMV-R、所述MsAPV1-F、所述MsAPV1-R、所述MsDPV1-F、所述MsDPV1-R、所述MsAV1-F、所述MsAV1-R的浓度分别为0.24、0.24、0.1、0.1、0.2、0.2、0.28、0.28、0.28、0.28μM。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述多重PCR扩增的退火温度为55℃。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述待测植物为紫花苜蓿。
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| KR20120119457A (ko) * | 2011-04-21 | 2012-10-31 | 대한민국(농촌진흥청장) | 콩 바이러스 다중 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도 |
| CN105755177A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-07-13 | 湖南农业大学 | 一种四重rt-pcr同时检测多种辣椒病毒的方法及其应用 |
| CN109486781A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-03-19 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种紫花苜蓿过表达鲨烯合酶基因的方法与应用 |
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| Characterisation of a novel nucleorhabdovirus infecting alfalfa(Medicago sativa);Yahya Z. A. Gaafar等;《Virology Journal》;20191231;第55号文章 * |
| 紫花苜蓿种带病毒的检测;文朝慧等;《草业科学》;20181231;2704-2710 * |
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