CN105755177A - 一种四重rt-pcr同时检测多种辣椒病毒的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四重RT?PCR同时检测四种常见辣椒病毒的方法及其应用。其步骤包括：1）取田间花叶症状的辣椒幼嫩叶片，冰上保存并带回实验室，采取Trizol方法提取RNA；2）以步骤1）得到的RNA为模板，以6碱基随机引物Random Primers为反向引物，通过反转录，得到cDNA；3）以步骤2）得到的cDNA为模板，用四对引物对其进行PCR扩增；4）PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。该检测方法用一个RT?PCR同时检测辣椒主要病毒黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和蚕豆萎蔫病毒?2（BBWV?2）。检测的病毒种类增多，检测效率提高，检测的成本低。

Description

一种四重RT-PCR同时检测多种辣椒病毒的方法及其应用
技术领域
本发明属于作物病毒检测技术领域，涉及一种四重RT-PCR同时检测多种辣椒病毒的方法及其应用，更具体地说，采用四重RT-PCR方法同时检测辣椒主要病毒黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和蚕豆萎蔫病毒-2（BBWV-2）。
背景技术
辣椒属茄科辣椒属植物，是在中南美、欧洲、亚洲等地区被广泛种植的一种重要蔬菜作物和调味品，可鲜食，也可加工成各种辣椒产品，其营养价值丰富，深受人们喜爱，辣椒的维生素C含量居蔬菜之首，辣椒中的红色素还是目前被人们广泛使用的天然食品着色剂。近年，辣椒的需求量、销量日益增加，椒农对辣椒种植的热情也有所提升。我国是世界上辣椒栽培面积最大的国家，如今，辣椒甚至成为某些城市蔬菜产业的主导产业之一[1]。然而，在辣椒生产中，多种病害成为阻碍椒农增收的障碍。其中，辣椒病毒病在世界范围内广泛发生，危害巨大，至今已发现四十多种病毒能侵染辣椒，我国辣椒病毒病亦日趋严重，常导致辣椒落叶、落花、落果，可造成减产30%-50%甚至绝收，成为影响辣椒产量的主要因素之一[2]。
我国已检测到的毒源主要有烟草花叶病毒（TobaccoMosaicVirus，TMV）、黄瓜花叶病毒（CucumberMosaicVirus，CMV）、马铃薯Y病毒（PotatoVirusY，PVY）、蚕豆萎蔫病毒-2（BroadBeanVasculaWiltVirus2，BBWV-2）、马铃薯X病毒（PotatoVirusX，PVX）、番茄花叶病毒（TomatoMosaicVirus，ToMV）、烟草蚀纹病毒（TobaccoEtchVirus，TEV）、苜蓿花叶病毒（AlfalfaMosaicVirus，AMV）、烟草脆裂病毒（TobaccoRattleVirus，TRV）、辣椒轻斑驳病毒(PepperMildMottleVirus，PMMoV)、辣椒环斑病毒（ChilliRingspotVirus，ChiRSV）及辣椒脉斑驳病毒（PepperVeinalMottleirus，PVMV）等，其中TMV、CMV、PVY和BBWV-2是我国辣椒生产中的主要病毒[3,4]，BBWV-2有逐年加重的趋势，一旦发生便可造成巨大损失[5]。因此，生产上要加强对TMV、CMV、PVY和BBWV-2病毒的防控，减少病毒危害造成的损失；了解主产区病毒病的流行情况是该地区辣椒病毒病防治的基础。
目前常用的植物病毒检测方法有生物学方法又叫指示植物法、血清学方法又叫酶联免疫法、电子显微镜法、反转录聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）。生物学方法测定耗时长、工作量大、灵敏度较差，不同病毒侵染后也常常表现出相似症状，显症反应也会受到复合侵染的影响；血清学检测方法在一定范围内可能出现假阴性和假阳性的现象，且对于检测样本较小的试验来说，试剂盒的成本较高；生物学方法和血清学方法的每一次检测只能针对单种病毒，检测效率低。电镜法对于病毒科或属以下的分类不能判定，且设备昂贵，样本数量不宜过大。而RT-PCR因其特异性最强、灵敏度最高，已成为当前病原检测的首选方法，并广泛应用于植物病毒检测。对于多种病毒复合侵染，可以通过多重RT-PCR方法同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，提高了检测效率，降低了检测成本，而且检测成本低，是其他检测方法所不能比拟的。辣椒病毒单重RT-PCR检测研究较多，但多重RT-PCR研究较少。姚玉荣等运用RT-PCR法在辣椒上检测出CMV和PMMoV等毒原[6]，郭京泽等运用实时荧光定量RT-PCR对PMMoV进行快速检测[7]，王健华等建立了ChiRSV的RT-PCR检测方法[8]。因此，国内外辣椒病毒的RT-PCR检测大多停留在单重和双重RT-PCR[9,10]，较少报道三重及三重以上的RT-PCR检测方法，虽然黄娅建立了辣椒PMMoV、ChiVMV、PVY、TSWV及TuMV的五重RT-PCR检测体系[11]，但没有包含我国辣椒生产上最常见的CMV、TMV和BBWV-2，因此，利用现有的RT-PCR检测方法对TMV、CMV、PVY和BBWV-2病毒进行检测，需要多次反应才能完成，费时、费力，浪费试剂盒耗材，成本高，也造成环境污染。为提高RT-PCR检测效率，降低检测成本，本发明针对我国辣椒生产上常见的黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和蚕豆萎蔫病毒-2（BBWV-2）4种病毒，根据Genbank发布的这些病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计通用引物，发明一种四重RT-PCR检测法，同时检测这4种病毒。
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发明内容
本发明所要解决的技术问题是：由于目前尚无针对TMV、CMV、PVY和BBWV-2等4种辣椒常见病毒的多重RT-PCR检测报道，旨在建立一种高效的四重RT-PCR病毒检测方法，同时检测这4种辣椒主要病毒。
从单重PCR到多重PCR，实验设计的难度加大数倍，扩增1个片段需要2条引物，4个片段就需要8条引物，这些引物自身及引物之间不能相互作用，形成二聚体，也不能与模板上目标片段以外的区域结合，出现非特异条带，还要考虑4个扩增片段大小相差在100bp以上，便于区分，同时多重PCR中的不同扩增片段会互相竞争资源，此外，还要考虑4对引物的Tm值要比较接近。
为保证检测体系建立成功，我们比对分析了这四种病毒的全基因组序列，根据多重PCR对引物的要求和各病毒保守序列，设计了2组共8对引物，对2组引物进行了预备RT-PCR试验，筛选出工作较好的一组，在此基础上，对BBWV2的引物进行重新设计和试验，最后确定四对引物。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种四重RT-PCR检测四种辣椒病毒的方法，针对我国辣椒主要病毒的基因组保守序列设计4对通用引物，并建立四重RT-PCR反应体系和程序，同时检测辣椒主要病毒黄瓜花叶病毒（CMV），烟草花叶病毒（TMV），马铃薯Y病毒（PVY），蚕豆萎蔫病毒-2（BBWV-2）。
RT-PCR检测所用引物的序列如下：
表1四重RT-PCR检测辣椒病毒的引物及其检测的病毒
此检测方法具体包括以下步骤：
1）辣椒植株叶片RNA的获得
取田间花叶症状的辣椒幼嫩叶片，冰上保存并带回实验室，采取Trizol方法提取RNA；
2）以步骤1）得到的RNA为模板，以6碱基随机引物RandomPrimers为反向引物，通过反转录，得到cDNA；
3）以步骤2）得到的cDNA为模板，用表1中的四对引物对其进行PCR扩增；本发明中四重PCR的条件为：
PCR反应体系（50μl）：2×PCRmix25μl、模板（cDNA）4μl、表1中每对正向引物和反向引物各2μl、超纯水补至所需体积；
PCR程序：94℃5min预变性后，40个循环参数为，94℃30s，53℃40s，72℃1min，最后72℃10min。
4）PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。
本发明的效果：
本发明用四重RT-PCR检测4种辣椒主要病毒。筛选了四对引物对组合以便同时检测四种不同的病毒，并对其四重PCR反应条件进行了筛选，获得优化条件。与目前单重RT-PCR和双重RT-PCR检测方法相比，用一个RT-PCR可检测4种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率提高，检测所用试剂和耗材减少，检测所需的成本显著降低，。
附图说明
图1单重与四重RT-PCR检测CMV、TMV、PVY、BBWV-2病毒，M：DNAladder；1，2，3，4分别为TMV、CMV、PVY、BBWV-2的单重PCR产物；5-10为四对引物两两组合的双重PCR产物；11-14为三重PCR产物；15为TMV、CMV、PVY、BBWV-2的四重PCR产物。
图2不同退火温度下四重RT-PCR检测CMV、TMV、PVY、BBWV-2病毒，M：DNAladder；1-12的温度分别为49.0、49.3、50.1、51.2、52.5、53.8、55.2、56.5、57.8、58.9、59.7、60.0℃。
图3不同稀释倍数模板四重RT-PCR检测CMV、TMV、PVY、BBWV-2病毒，M：DNAladder；1-6RNA浓度分别为初始cDNA浓度的100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5倍，7为阴性对照。
图4四重RT-PCR检测湖南辣椒植株样品中CMV、TMV、PVY、BBWV-2病毒，M：DNAladder；1-43为湖南省辣椒样品，44为阳性对照，45为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1四重RT-PCR检测体系的建立与优化
引物设计：
其中TMV、CMV、PVY和BBWV-2是我国辣椒生产中的主要病毒，由于未见针对这四种病毒的多重RT-PCR检测的报道，为保证检测体系建立成功，我们比对分析了这四种病毒的全基因组序列，根据多重PCR对引物的要求和各病毒保守序列，用Primer5.0设计2组共8对引物，对2组引物进行了预备RT-PCR试验，筛选出工作较好的1组，在此基础上，对BBWV2的引物进行重新设计和试验，最后确定四对引物，引物序列见如表1，为避免凝胶电泳后四条目的条带距离太近而无法区分开来，四对引物的长度至少相差100bp，并且四对引物之间没有互作或互作影响很小。
引物由上海生工生物技术有限公司合成。
辣椒总RNA的提取：
取经单重RT-PCR检测黄瓜花叶病毒（CMV），烟草花叶病毒（TMV），马铃薯Y病毒（PVY），蚕豆萎蔫病毒-2（BBWV-2）分别为阳性的辣椒植株叶片，液氮研磨后，采用Trizol试剂盒提取总RNA，电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量和浓度。
用上述引物分别对提取的总RNA进行单重RT-PCR和四重RT-PCR扩增：
第一步是反转录，
RNA变性：取RNA2.5μl65℃温浴8分钟，冰上冷却；
配置反转录反应液（7.5μl），5×反应缓冲液2μl，、100mMDTT1μl,10mMdNTPs1μl、RNA酶抑制剂0.125μl、反转录酶0.5μl、10μM随机引物0.5μl,超纯水补至7.5μl。
将7.5μl反应液加入到变性的2.5μlRNA中，混匀，42℃延伸1小时，95℃变性2分钟。
第二步PCR
根据实验室常用的PCR反应体系，进行PCR扩增，针对扩增结果对影响PCR结果的因素如2×PCRmix（含Mg+、dNTP、Taq酶）、引物、模版等进行适当调整，根据PCR结果（图1）确定最佳反应体系：
单重PCR反应体系（50μl）：2×PCRmix25μl、模板（cDNA）2μl、分别加入表1中的正向引物和反向引物各2μl、超纯水补至所需体积。
四重PCR反应体系（50μl）：2×PCRmix25μl、模板（cDNA）4μl、表1中每对正向引物和反向引物各2μl、超纯水补至所需体积。
为筛选合适的退火温度，使四重RT-PCR获得四个目的片段。退火温度设置为49.0、49.3、50.1、51.2、52.5、53.8、55.2、56.5、57.8、58.9、59.7、60.0℃共12个温度梯度，PCR产物电泳结果见图2。结果表明四重RT-PCR能获得4个清晰的目的片段，这四对引物对退火温度不敏感，能适用的温度范围较广，引物设计效果好。
为检验四重RT-PCR检测的灵敏度，初始RNA分别稀释10，100、1000、10000和100000倍，PCR产物电泳结果见图3。可见初始RNA稀释10倍时，还能扩增出4个目的片段。
根据实验室常用的PCR反应程序，由不同退火温度的实验得出最适宜的退火温度，根据凝胶电泳结果确定最佳PCR反应程序：94℃5min预变性后，40个循环参数为，94℃30s，53℃40s，72℃1min，最后72℃10min。
凝胶电泳：
10μlPCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相。
结果见图1。结果表明四重RT-PCR能检测CMV、TMV、PVY、BBWV-2病毒。
实施例2四重RT-PCR检测田间辣椒植株样品
在湖南辣椒主产区长沙田间调查和采取具有黄化和花叶症状的辣椒植株样品43个，带土带回实验室，选取幼嫩叶片，液氮研磨后，提取RNA，用建立好的四重RT-PCR检测其是否存在CMV、TMV、PVY及BBWV-2侵染，检测结果见图4，结果表明四重RT-PCR能很好地检测湖南主产区辣椒样品的病毒。43个样品中检测出CMV、TMV、BBWV-2和PVY的样品数分别为35、16、10和1个，CMV、TMV、BBWV-2和PVY的检出率分别为81.4%、37.21%、23.26%和2.33%，43个样品为单个病毒侵染或多个病毒复合侵染，说明此次我们采样地区辣椒CMV发生最为严重，PVY发生最轻，也说明此四重RT-PCR方法能很好地运用于这四种病毒的检测，为今后这四种病毒的检测提供了快速、便捷、高效的方法。

Claims (6)

1.一种四重RT-PCR同时检测四种常见辣椒病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）取待测辣椒幼嫩叶片，提取其RNA；
2）以步骤1）得到的RNA为模板，通过反转录得到cDNA；
3）以步骤2）得到的cDNA为模板，用四对引物对其进行四重PCR扩增；
4）PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况；
其中所用的四对引物的序列如下：
1）检测黄瓜花叶病毒的引物：
正向引物：CCCACTCTTAACCACCCAACC
反向引物：GACGCAGCATACTGATAAACCAA
2）检测烟草花叶病毒的引物：
正向引物：TAGACCCGCTAGTCACAG
反向引物：CAGAGGTCCAAACCAAAC
3）检测马铃薯Y病毒的引物：
正向引物：ACGTCCAAAATGAGAATGCC
反向引物：TGGTGTTCGTGATGTGACCT
4）检测蚕豆萎蔫病毒-2的引物：
正向引物：GCCAGAACTTGGGAGTGATAC
反向引物：ACTTGTTAGCCATTCGGGTC。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：四重PCR扩增条件为：四重PCR反应体系（50μl）：2×PCRmix25μl、模板（cDNA）4μl、四对引物的正向引物和反向引物各2μl、超纯水补至所需体积。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，其中四重PCR扩增程序：94℃5min预变性后，40个循环参数为，94℃30s，53℃40s，72℃1min，最后72℃10min。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，第1步是取田间花叶症状的辣椒幼嫩叶片，冰上保存，采取Trizol方法提取RNA。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，第2步是以步骤1）得到的RNA为模板，以6碱基随机引物RandomPrimers为反向引物，通过反转录，得到cDNA。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，第4步的判断标准是：如果扩增获得323bp的片段，则表明待测辣椒感染了黄瓜花叶病毒；如果扩增获得237bp的片段，则表明待测辣椒感染了烟草花叶病毒；如果扩增获得480bp的片段，则表明待测辣椒感染了马铃薯Y病毒；如果扩增获得1057bp的片段，则表明待测辣椒感染了蚕豆萎蔫病毒-2。
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