CN112126718A - 同时检测辣椒三种病毒的多重rt-pcr引物组及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测辣椒三种病毒的多重RT‑PCR引物组，引物对PepMoV‑F和PepMoV‑R为检测辣椒斑驳病毒(PepMoV)的引物，引物对PeVYV‑F和PeVYV‑R为检测辣椒脉黄化病毒(PeVYV)的引物，引物对HPEV‑F和HPEV‑R为检测辣椒内源RNA病毒(HPEV)的引物。本发明用三重RT‑PCR检测常见的3种辣椒病毒即辣椒斑驳病毒(PepMoV)、辣椒脉黄化病毒(PeVYV)以及辣椒内源RNA病毒(HPEV)，与目前单重RT‑PCR和双重RT‑PCR检测方法相比，用一次RT‑PCR反应可检测3种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率进一步提高，检测的成本显著降低。
Description
技术领域
本发明属于作物病毒检测技术领域，特别涉及一种同时检测辣椒三种病毒的多重RT-PCR引物组及其方法。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)是世界第三大蔬菜作物，也是我国种植面积和产值第一大蔬菜作物(郑井元等，2018)。其营养价值丰富，如维生素C含量居蔬菜之首，既可鲜食，也可加工成各种辣椒产品，如辣椒红色素是目前使用最为广泛的天然食品着色剂之一。然而，在辣椒种植过程中，病害普遍成为阻碍椒农增收的主要障碍，其中危害较大的是炭疽病、病毒病和疫病等。病毒病常可导致辣椒减产30％～70％，且使其品质变劣，失去商品价值，成为影响辣椒产量和质量的主要因素之一。目前已知侵染辣椒的病毒不少于60 种(Kenyon et al.，2014)，其中马铃薯Y病毒属(Potyvirus)中的病毒是中国辣椒生产中为害的主要病毒，如Potyvirus中的辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus，PepMoV)是近年报道较多的为害辣椒的主要病毒类型之一。PepMoV 最先在美国报道，随后在韩国、墨西哥、日本等地相继有危害的报道，2011 年在我国台湾报道有该病毒的发生，2015年在我国湖南和福建等省的辣椒上均检测到该病毒，随后逐渐蔓延扩散到其他辣椒主产区。辣椒脉黄化病毒(Pepper vein yellows virus，PeVYV)是黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)成员之一，最早是由日本的Tetsuyoshi(1995)在辣椒上发现的，随着全球植物资源的交流，2013年在印度、泰国、中国台湾等地的辣椒上检测到PeVYV；2015年中国的湖南和山东两地在田间辣椒上检测到 PeVYV(Zhang et al.,2015；Tan et al.,2015)，随后美国也在辣椒上检测到该病毒(Alabi et al.,2015)，现在PeVYV已经成为对全世界辣椒都存在潜在威胁的一种辣椒病毒。辣椒内源RNA病毒(Hot pepper endornavirus，HPEV) 是内源RNA病毒科(Endornaviridae)内源RNA病毒属(Endornavirus)的一种病毒。内源RNA病毒自第一次从蚕豆中发现以来，其寄主范围在不断扩大，2007年首次在辣椒上发现该病毒。该病毒能独立于宿主的基因进行自制，且大多数对宿主不引起任何病症，在寄主体内能够持续慢性感染，因此在研究中一直以来被忽视。近来的研究表明：内源RNA病毒能够与寄主之间相互作用，并可以在寄主体内产生一定的影响，由此，在实际应用中可将此类病毒作为生物防治因子和育种考虑的因素之一。
随着辣椒品种的引进和交流的发展、栽培制度及气候条件的变化，各地主要病毒种类也在发生变化，且不同的地域可能不同。生产和育种中迫切需要病毒病原鉴定相关研究作指导，以促进有针对性地开展当地主要为害病毒的防治技术、抗病育种等方面工作的发展。因此，及时准确、高效地检测和鉴定辣椒病毒病的种类具有很重要的意义。
传统的病毒检测和鉴定方法有生物学方法、电镜法、血清学法、反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-PCR，即RT-PCR)法等。其中，生物学方法耗时耗力、灵敏度差，不同病毒侵染后也常常表现出相似症状而影响鉴定的准确性。电镜法需要昂贵的仪器，操作方法不易掌握，且对病毒属以下的分类不能判定。血清学法容易出现假阴性或假阳性，且试剂盒的成本高。RT-PCR法具有灵敏度高、快速、特异性较强等其它检测方法所不能比拟的优点，已成为当前植物病毒病检测的首选方法。生产实际中往往是多种病毒复合侵染植株，可以通过多重RT-PCR法同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，大大提高了检测效率，也大幅降低了检测成本。目前，辣椒病毒单重RT-PCR检测研究较多，而多重RT-PCR研究仍然较少。虽然国内外对辣椒上的常见病毒开发出了一些多重检测方法，然而针对PepMoV、PeVYV及 HPEV三种病毒的多重RT-PCR检测技术没有报道过。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种高效的、同时检测辣椒中三种RNA病毒的三重RT-PCR检测引物及方法。针对国内发现的辣椒3种病毒，即辣椒斑驳病毒(PepMoV)、辣椒脉黄化病毒(PeVYV)以及辣椒内源RNA 病毒(HPEV)，根据Genebank发布的这三种病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计引物，建立一个简单、高效、灵敏的三重RT-PCR检测技术体系以同时检测这三种病毒。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种同时检测辣椒三种病毒的多重RT-PCR引物组，引物对PepMoV-F和 PepMoV-R为检测辣椒斑驳病毒(PepMoV)的引物，产物片段大小为385bp；引物对PeVYV-F和PeVYV-R为检测辣椒脉黄化病毒(PeVYV)的引物，片段大小为361bp；引物对HPEV-F和HPEV-R为检测辣椒内源RNA病毒 (HPEV)的引物，片段大小为600bp，具体如下：
PepMoV-F：GGACTTCTGTTTGTCGGTGAT，如SEQ ID NO.1所示；
PepMoV-R：AGATGTCTGAAGTGAGTCATCAG，如SEQ ID NO.2所示；
PeVYV-F：GACGACGAAATGGAGGC，如SEQ ID NO.3所示；
PeVYV-R：CATTAATCTGCGAAGCCCG，如SEQ ID NO.4所示；
HPEV-F：TGTTGCGTCCAAAAACCACAC，如SEQ ID NO.5所示；
HPEV-R：GTGCCAATTGTGTGCCTTGG，如SEQ ID NO.6所示。
包含上述引物组的试剂或试剂盒。
采用如上所述的引物组检测辣椒PepMoV、PeVYV及HPEV三种病毒的多重RT-PCR检测方法，包括以下操作步骤：
(1)辣椒植株叶片RNA的提取：取田间带病毒症状的辣椒幼嫩叶片，液氮中保存，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用如上所述的3对引物进行PCR 扩增，获得扩增产物；
(3)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。
优选地，所述PCR的反应体系25μL，包括2×Taq PCR Mix反应液12.5μL、 cDNA模板3μL、辣椒斑驳病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒脉黄化病毒正向引物和反向引物各0.5μL、辣椒内源RNA病毒正向引物和反向引物各 0.3μL，超纯水补至所需体积。
优选地，所述PCR的反应程序：94℃预变性2min；30个循环参数为： 94℃变性20s，51℃退火20s，72℃延伸20s；最后72℃2min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明用三重RT-PCR检测常见的3种辣椒病毒即辣椒斑驳病毒 (PepMoV)、辣椒脉黄化病毒(PeVYV)以及辣椒内源RNA病毒(HPEV)，与目前单重RT-PCR和双重RT-PCR检测方法相比，用一次RT-PCR反应可检测3种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率进一步提高，检测的成本显著降低。
附图说明
图1是本发明引物组同时检测辣椒三种病毒的多重RT-PCR及各病毒单重 PCR产物电泳图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
实施例1
引物设计
根据Genebank发布的上述3种辣椒病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计了3对引物(见表1)，其中引物对PepMoV-F和PepMoV-R为检测辣椒斑驳病毒(PepMoV)的引物，扩增的目的片段大小为385bp；引物对PeVYV-F和PeVYV-R为检测辣椒脉黄化病毒(PeVYV)的引物，扩增的目的片段大小为361bp；引物对HPEV-F和HPEV-R为检测辣椒内源RNA病毒(HPEV)的引物，扩增的目的片段大小为600bp。各引物对扩增的目的片段大小分别为385、361和600bp，片段之间能很清晰地分开，不会出现重叠，设计引物时排除了各对引物和其它几种病毒之间的错配以及各引物之间的互补。目的片段经克隆测序，均为各病毒的特异片段。
表1三重RT-PCR检测辣椒病毒的引物及其检测的病毒
采用同时检测辣椒三种病毒的多重RT-PCR引物组检测辣椒PepMoV、 PeVYV及HPEV三种病毒的多重RT-PCR检测方法，具体操作步骤如下：
(1)辣椒植株叶片RNA的提取：取田间带病毒症状的辣椒幼嫩叶片，液氮中保存，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量和浓度，反转录为cDNA，反转录过程如下：
①配制反转录变性反应混合液(10.0μL)：Oligo dT Primer(50μM)1.0 μL、dNTPMixture(10mM each)1.0μL、模板总RNA1.0μg，用去RNase 超纯水补至10.0μL；
②变性：65℃保温5min后，冰上迅速冷却；
③配制反转录反应液：向上述变性后的混合液(10.0μL)中分别加入5×反应缓冲液4.0μL、RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL、反转录酶(200U/μL) 1.0μL，用去RNase超纯水补至20.0μL，缓慢混匀，配制成反转录反应液；
④反转录反应。反应条件为：42℃温浴1h；95℃5min；冰上冷却；
(2)以步骤(1)反转录后得到的cDNA为模板，用如上所述的3对引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
PCR的反应体系25μL，包括2×Taq PCR Mix反应液12.5μL、cDNA模板 3μL、辣椒斑驳病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒脉黄化病毒正向引物和反向引物各0.5μL、辣椒内源RNA病毒正向引物和反向引物各0.3μL，超纯水补至所需体积；
PCR的反应程序：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性20s， 51℃退火20s，72℃延伸20s；最后72℃2min；
(3)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照(图1)，判断病毒感染情况。
图中1、2、3、4和5泳道分别是DNAMarker2000、本发明三种病毒(PepMoV、PeVYV及HPEV)多重RT-PCR产物、HPEV单重RT-PCR产物、 PepMoV单重RT-PCR产物以及PeVYV单重RT-PCR产物。
从图1中可以看出，在本次检测过程中，同时检测出辣椒具有PepMoV、 PeVYV及HPEV三种病毒。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 同时检测辣椒三种病毒的多重RT-PCR引物组及其方法
<130> JC
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggacttctgt ttgtcggtga t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
agatgtctga agtgagtcat cag 23
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gacgacgaaa tggaggc 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cattaatctg cgaagcccg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tgttgcgtcc aaaaaccaca c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gtgccaattg tgtgccttgg 20
Claims (5)
1.一种同时检测辣椒三种病毒的多重RT-PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括PepMoV引物对、PeVYV引物对和HPEV引物对，引物对PepMoV-F和PepMoV-R为检测辣椒斑驳病毒(PepMoV)的引物，产物片段大小为385bp；引物对PeVYV-F和PeVYV-R为检测辣椒脉黄化病毒(PeVYV)的引物，片段大小为361bp；引物对HPEV-F和HPEV-R为检测辣椒内源RNA病毒(HPEV)的引物，片段大小为600bp，具体如下：
PepMoV-F：GGACTTCTGTTTGTCGGTGAT，如SEQ ID NO.1所示；
PepMoV-R：AGATGTCTGAAGTGAGTCATCAG，如SEQ ID NO.2所示；
PeVYV-F：GACGACGAAATGGAGGC，如SEQ ID NO.3所示；
PeVYV-R：CATTAATCTGCGAAGCCCG，如SEQ ID NO.4所示；
HPEV-F：TGTTGCGTCCAAAAACCACAC，如SEQ ID NO.5所示；
HPEV-R：GTGCCAATTGTGTGCCTTGG，如SEQ ID NO.6所示。
2.一种包含如权利要求1所述多重RT-PCR引物组的试剂或试剂盒。
3.一种采用如权利要求1所述所述的多重RT-PCR引物组检测辣椒PepMoV、PeVYV及HPEV三种病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)辣椒植株叶片RNA的提取：取田间带病毒症状的辣椒幼嫩叶片，液氮中保存，提取总RNA，反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用如上所述的3对引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。
4.根据如权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于：所述PCR的反应体系25μL，包括2×Taq PCR Mix反应液12.5μL、cDNA模板3μL、辣椒斑驳病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒脉黄化病毒正向引物和反向引物各0.5μL、辣椒内源RNA病毒正向引物和反向引物各0.3μL，超纯水补至所需体积。
5.根据如权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR的反应程序：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性20s，51℃退火20s，72℃延伸20s；最后72℃2min。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100625010B1 (ko) * | 2005-05-06 | 2006-09-20 | 대한민국 | 고추 및 파프리카에 발생하는 고추모틀바이러스,잠두위조바이러스2, 오이모자이크바이러스 및고추마일드모틀바이러스 진단용 프라이머 조합 |
| CN105695626A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-06-22 | 湖南农业大学 | 检测辣椒叶脉黄化病毒的rt-pcr引物及其方法 |
| CN106755597A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-31 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种同步检测4种辣椒病毒的多重pcr方法 |
-
2020
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100625010B1 (ko) * | 2005-05-06 | 2006-09-20 | 대한민국 | 고추 및 파프리카에 발생하는 고추모틀바이러스,잠두위조바이러스2, 오이모자이크바이러스 및고추마일드모틀바이러스 진단용 프라이머 조합 |
| CN105695626A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-06-22 | 湖南农业大学 | 检测辣椒叶脉黄化病毒的rt-pcr引物及其方法 |
| CN106755597A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-31 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种同步检测4种辣椒病毒的多重pcr方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YU ZHANG等: "First report of hot pepper endornavirus infecting pepper in China", 《JOURNAL OF PLANT PATHOLOGY》 * |
| 丁超等: "辣椒三种病毒的多重", 《分子植物育种》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113403429A (zh) * | 2021-07-22 | 2021-09-17 | 广西壮族自治区农业科学院 | 同时检测辣椒三种rna病毒的多重rt-pcr引物组及其方法 |
| CN113403429B (zh) * | 2021-07-22 | 2023-08-04 | 广西壮族自治区农业科学院 | 同时检测辣椒三种rna病毒的多重rt-pcr引物组及其方法 |
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