CN103820462B - 禾谷缢管蚜act1内参基因部分序列、克隆方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“禾谷缢管蚜ACT1内参基因部分序列、克隆方法及应用”属分子生物学领域，具体地，涉及禾谷缢管蚜内参基因ACT1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所获得的禾谷缢管蚜内参基因ACT1（1131bp）的核苷酸序列可作为今后研究禾谷缢管蚜功能基因或在不同发育时期基因表达，以及作为传毒介体时病毒在其体内表达的相对水平的内参基因。

Description

禾谷缢管蚜ACT1内参基因部分序列、克隆方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及禾谷缢管蚜参照基因ACT1基因部分序列、克隆方法及其作为内参基因在RT-qPCR中的应用。

背景技术

禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi L.，RP）隶属于同翅目蚜科(Homoptera:Aphididae)。这种蚜虫在世界范围广泛分布，是禾本科植物重要的害虫之一。除了能通过吸食植株营养而直接影响谷物产量外，它主要是做为禾本科作物和杂草病毒病的传播介体造成危害。禾谷缢管蚜以持久性非增殖方式传播黄矮病毒，是黄症病毒科黄症病毒属多种大麦黄矮病毒的优势传毒介体。

在禾谷缢管蚜刺吸取食受黄矮病感染的植株韧皮部汁液的同时，它也取食到了存在于韧皮部病毒粒体。在介体蚜虫的中肠和/或后肠以及唾液腺中发生受体介导的胞吞胞吐。黄矮病在寄主植物体内的增殖一般地采用绝对和相对定量的方法，但是还没有关于在获毒期，接毒期以及影响传毒效率、传毒周期田间植物病毒流行的所有关键时期的介体体内病毒的滴度和积累变化的研究报道。病毒进入介体蚜虫体内后，伴随着无数的基因表达呈上调或下调，许多蛋白通过一种转胞吞的方式被整合成与病毒传播相关。应用反转录实时定量PCR(RT-qPCR)，我们能迅速地评价分子功能和生物学过程中病毒的影响以及病毒的实时浓度。

近年来，定量PCR（qPCR）中相对定量的方法较为流行，它消除了在实验处理间、RNA提取效率及RNA完整性方面等系统误差，应用到了分子研究工作的许多方面。在生物体中，看家基因（House-keeping gene）在所有细胞中都是保守的，在正常或非正常情况下都是持续表达的。因此，在RT-qPCR实验中，选择适合的、可信的看家基因作为内参基因是必不可少的。随着果蝇（Drosophila melanogaster）和小菜蛾（Plutella xylostella L.）等不同的昆虫全基因组序列的发表，寻找看家基因作为内参基因成为这些完全变态昆虫的研究重点之一。在运用RT-qPCR分析昆虫基因表达的实验中通常用下列内参基因，如18S rRNA,ACT1,EF-1α,GAPDH,UBI,RPSs,RPLs和TUB等。对于不完全变态昆虫，特别是传播多种植物病毒的蚜虫，近年来开展了大豆蚜（Aphis glycines）看家基因的研究。对于监测介体禾谷缢管蚜体内病毒基因的变化，用RT-qPCR确定病毒基因表达的相对水平，还没有找到有效适用的看家基因。尽管有研究中ACT1基因已被用来作为检测禾谷缢管蚜中两种植物病毒的内参基因，但这个基因实际上是参考家蚕(Bombyx mori)的、并不是禾谷缢管蚜自身的ACT1基因，而本发明的结果也证实了两个物种的ACT1基因在核苷酸序列上确实存在一定的差异。所以在定量禾谷缢管蚜体内的病毒含量时，使用其它物种的基因作为内参基因的做法是不准确的。

发明内容

本发明提供禾谷缢管蚜ACT1基因片段，可作为禾谷缢管蚜内参基因的应用。

并同时提供克隆禾谷缢管蚜的ACT1的特异性引物，建立基于SYBR Green I染料技术的RT-qPCR方法，从而为禾谷缢管蚜的ACT1作为内参基因，在利用qPCR对禾谷缢管蚜功能基因或作为传毒介体病毒在体内增殖变化的研究中提供有用的方法。

禾谷缢管蚜ACT1基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种禾谷缢管蚜ACT1基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷缢管蚜基因组总RNA，采用引物ACT1R进行RT-PCR扩增，以产物第一链cDNA作为模板、以引物对ACT1F/ACT1R进行PCR扩增，得到阳性克隆，最后经测序验证。其中引物序列为：

ACT1F:5′-ATGTGTGACGAAGAAGTAGC-3′；

ACT1R:5′-TTAGAAGCACTTTCTGTGC-3′。

所获得的目的片段大小为1131bp。

所述PCR扩增的反应条件如下：94℃3min、[94℃45s、56℃1min、72℃1min]30个循环、72℃延长10min，4℃保存。

本发明还提供一种qPCR扩增ACT1基因部分序列的方法，抽提禾谷缢管蚜基因组总RNA，以试剂盒中自带的引物混合物为引物进行RT反应，然后以产物第一链cDNA作为模板进行定量PCR扩增，荧光染料为SYBR Green I，其中定量PCR扩增中的禾谷缢管蚜的定量引物，其序列为：

QACT1F：5′-AACGGAAGCACCTTTGAACC-3′；

QACT1R：5′-GGAAGAAGCAGCAGTAGCCAT-3′。

所获得的目的片段大小为385bp。

所述定量PCR扩增采用两步法，即在95℃预变性15min之后，先运行40个循环的95℃10sec，59.2℃32sec，72℃32sec，再运行溶解曲线阶段的95℃15sec，60℃1min，95℃30sec，60℃15sec。

禾谷缢管蚜ACT1基因片段作为内参基因应用于禾谷缢管蚜功能基因或介体内黄矮病毒基因表达定量PCR检测的应用。

本发明根据NCBI其它昆虫的核苷酸序列，克隆了禾谷缢管蚜的ACT1看家基因的部分序列。设计相应的特异性的定量引物，建立基于SYBR GreenI染料技术的RT-qPCR方法，从而为禾谷缢管蚜的ACT1作为内参基因，在利用qPCR对禾谷缢管蚜功能基因或作为传毒介体病毒在体内增殖变化的研究中提供有用的方法。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明首次克隆得到禾谷缢管蚜的ACT1基因片段。

2.本发明首次提出在禾谷缢管蚜定量PCR检测中建立通用的内参基因；

3.本发明首次提出将禾谷缢管蚜的ACT1基因作为内参基因在禾谷缢管蚜不同发育时期的定量PCR检测；

4.本发明提出的禾谷缢管蚜的ACT1基因作为内参基因可以相对定量黄矮病毒的基因在介体中的相对表达水平；

5.本发明提出的检测引物具有特异性，优化了PCR扩增程序，大大的提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度。

附图说明

图1.禾谷缢管蚜ACT1内参基因的PCR电泳图；

其中M代表DL2000DNA Marker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,

100bp；1～4泳道为4次重复。

图2-1.禾谷缢管蚜ACT1内参基因的溶解曲线（无翅成蚜）；

其中：横坐标代表在溶解曲线扩增阶段，从60℃到95℃之间的温度范围；纵坐标代表SYBRGreen I荧光染料结合到18S rRNA目标片段的双链DNA后，进入溶解曲线扩增阶段，随温度升高，被ROX标准化后的SYBR Green I荧光信号值即Rn的导数值，峰值指在所对应的温度下Rn急剧降低的拐点处的导数值。

图2-2.禾谷缢管蚜ACT1内参基因的溶解曲线（有翅成蚜）；

其中：横坐标代表在溶解曲线扩增阶段，从60℃到95℃之间的温度范围；纵坐标代表SYBRGreen I荧光染料结合到18S rRNA目标片段的双链DNA后，进入溶解曲线扩增阶段，随温度升高，被ROX标准化后的SYBR Green I荧光信号值即Rn的导数值，峰值指在所对应的温度下Rn急剧降低的拐点处的导数值。

图3-1.禾谷缢管蚜ACT1内参基因的标准曲线（无翅成蚜）；

其中：横坐标代表对cDNA模板不同稀释浓度下的量化值，从左到右表示cDNA浓度按梯度依次升高；纵坐标代表在这些稀释浓度下扩增ACT1，Rn超过阈值，开始进入指数增长期的循环数，即定量循环数Cq，曲线拟合方程为y=－3.446x+31.119（相关系数R2=0.999），代表扩增效率E为95.067%。

图3-2.禾谷缢管蚜ACT1内参基因的标准曲线（有翅成蚜）；

其中：横坐标代表对cDNA模板不同稀释浓度下的量化值，从左到右表示cDNA浓度按梯度依次升高；纵坐标代表在这些稀释浓度下扩增ACT1，Rn超过阈值，开始进入指数增长期的循环数，即定量循环数Cq，曲线拟合方程为y=－3.484x+30.220（相关系数R2=0.999），代表扩增效率E为93.665%。

图4-1.禾谷缢管蚜ACT1内参基因的扩增曲线（无翅成蚜）；

其中：横坐标代表qPCR扩增ACT1时的循环数；纵坐标代表在对应循环数下的Rn值。

图4-2.禾谷缢管蚜ACT1内参基因的扩增曲线（有翅成蚜）；

其中：横坐标代表qPCR扩增ACT1时的循环数；纵坐标代表在对应循环数下的Rn值。

图5.BYDV-PAV CP基因在有翅成蚜中的相对表达量；

其中：横坐标代表有翅成蚜取食带毒植株的时间间隔，从左到右时间依次增长；纵坐标代表BYDV-PAV CP基因相对于ACT1的表达量，柱状图和误差线代表每个时间间隔处3个重复样品的相对表达量平均值M和平均值的标准误（±SE）。

图6.BYDV-PAV CP基因在无翅成蚜中的相对表达量；

其中：横坐标代表无翅成蚜取食带毒植株的时间间隔，从左到右时间依次增长；纵坐标代表BYDV-PAV CP基因相对于ACT1的表达量，柱状图和误差线代表每个时间间隔处3个重复样品的相对表达量的平均值M和平均值的标准误（±SE）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1.禾谷缢管蚜ACT1基因的克隆

1.1禾谷缢管蚜总RNA提取：

采用TRIzol（Amion,USA）法提取禾谷缢管蚜(无翅成蚜)的总RNA。

根据研磨样品时所用的工具不同（使用无RNase/DNase的进口产品），RNA的提取过程为：将约0.05～0.1g新鲜样品或冰冻的禾谷缢管蚜在液氮中充分研磨成粉末，迅速转移入液氮冷冻过的1.5mL离心管中，然后加入1mLTRIzol，剧烈摇晃混匀，冰上静置5min；4℃，12,000rpm离心10min；吸取上清到新的1.5mL离心管中，加入200μl氯仿，用力摇15s，冰上静置5min。4℃，12,000rpm离心10min；将上层上清转入到新的离心管，加入400μL氯仿上清，剧烈摇晃混匀，冰上静置5min。4℃，12,000rpm离心10min；将上清转入新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃过夜沉淀；4℃，12,000rpm离心15min，去上清；加入1mL预冷的75%乙醇（灭菌的DEPC水配制），洗涤沉淀。4℃，12,000rpm离心5min重复上述洗涤步骤，以彻底洗干净盐分；弃上清，4℃，12,000rpm离心1min，用枪头尽量吸出上清。在通风厨中，开口朝上，干燥5～10min。用50μL灭菌的DEPC水溶解。取1μLRNA用NanoDrop-2000紫外分光光度计测定RNA样品的纯度和浓度值。将1μL原始样品稀释10倍或100倍后，取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整性检测。并取1μL RNA用NanoDrop-2000紫外分光光度计测定RNA样品的纯度和浓度值。合格样品置于-70℃冰箱保存待用。

1.2.PCR扩增引物序列

ACT1的上游引物（SEQ ID NO2）：5′-ATGTGTGACGAAGAAGTAGC-3′；

ACT1的下游引物（SEQ ID NO3）：5′-TTAGAAGCACTTTCTGTGC-3′。

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.反转录（RT）

以蚜虫总RNA（浓度在0.05～1μg/μL）为模板，利用目标基因的下游引物来合成第一链cDNA。25μL反转录体系设置和反应过程按以下步骤：首先加入DEPC水7μL，下游引物（5μM）0.5μL，总RNA1μL，短暂离心混匀后，75℃温浴10min，迅速置于冰上5min。DEPC水3.5μL，dNTPs(2.5mM)5μL，5×RT reaction buffer5μL，M-MLV(200U/μL)2μL，Recombinant RNaseInhibitor(RRI,40U/μL)1μL。混合物短暂离心混匀后，42℃温浴1h，95℃失活5min，迅速置于冰上。所得到的第一链cDNA立即进行PCR或-20℃保存。

1.4.聚合酶链式反应（PCR）

以RT得到的第一链cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR采用以下25μL反应体系：ddH2O17μL，10×EX Taq PCR buffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上游引物（5μM）0.25μL，下游引物（5μM）0.25μL，ExTaq0.5μL，cDNA2.5μL。PCR反应程序设置为：94℃预变性3min，然后94℃变性45sec，56℃退火1min，和72℃延伸1min扩增，30个循环，循环结束后进行72℃补充延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳来检测目的片段（图1）。

1.5.目的基因的获得

对目标片段进行切胶回收，纯化后的DNA片段连接到pMD18T simple vector载体上，转化入感受态大肠杆菌细胞中，经过PCR检测的阳性克隆进行测序，得到ACT1的核苷酸序列(具体序列见SEQ ID No.1)。

实施例2.ACT1基因在禾谷缢管蚜两种不同虫态中的特异性RT-qPCR的检测

2.1.样品制备

分别以禾谷缢管蚜的两种不同虫态（有翅成蚜和无翅成蚜）提取的总RNA为模板,具体提取方法详见实施例1中1.1所述。

2.2.PCR扩增引物合成

qPCR扩增上游引物(SEQ ID NO4)：5′-AACGGAAGCACCTTTGAACC-3′；

qPCR扩增下游引物(SEQ ID NO5)：5′-GGAAGAAGCAGCAGTAGCCAT-3′。

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（PAGE纯化法）。

2.3.荧光定量PCR（RT-qPCR）

利用两步法来进行RT-qPCR，在7500real time PCR仪（Applied Biosystems）运行。RT部分利用北京天根(TIANGEN)公司的试剂盒FastQuant RT Kit(with gDNase)，分别以禾谷缢管蚜的有翅成蚜和无翅成蚜材料提取的总RNA为模板，以试剂盒中自带的引物混合物（包括OigodT Primer和Random6mers）为引物进行RT反应，来获取第一链cDNA。再利用基于SYBRGreen I染料的qPCR来检测目标基因，所用反应体系和程序参考TIANGEN公司的SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)试剂盒的说明书。PCR反应体系为20μL，其中2×SuperReal PreMixPlus10μL，上下游定量引物10μmol/L各0.6μL，模板cDNA（10ng/μL）2μL，50×ROX ReferenceDye0.4μL，用灭菌双蒸水补齐至20μL，其余按照说明书进行。定量PCR扩增采用两步法，即在95℃预变性15min之后，先运行40个循环的95℃10sec，59.2℃32sec，72℃32sec，再运行溶解曲线阶段的95℃15sec，60℃1min，95℃30sec，60℃15sec。实验得到熔解曲线（melting curve）（图2-1，2-2）、定量循环数（quantification cycle，Cq）（图3-1、3-2）和扩增曲线（amplification plot）（图4-1，4-2）用于后期分析。

2.4.实验结果

本发明按照定量PCR反应程序将50ng含量的禾谷缢管蚜的无翅成蚜和有翅成蚜总RNA样品进行定量PCR扩增，并结合溶解曲线来判断扩增产物的特异性。一般理想的熔解曲线应该是单峰型曲线，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生。从引物的溶解曲线分析得出，无翅成蚜和有翅成蚜基本都呈现单峰性曲线，且峰值都高于引物二聚体的峰值（75℃左右），在82℃处开始起峰，85℃处峰值最高，87～88℃之间落峰，说明本发明涉及的定量扩增引物（SEQ ID No4和5）扩增条带单一，特异性强，没有非特异性扩增出现。本发明从两组不同虫态（无翅成蚜和有翅成蚜）的荧光定量PCR扩增曲线可以看出，该对引物在模板的不同稀释浓度下进行扩增，DNA数量都经历了典型的扩增过程（包括基线、指数增长期、线性期和平台期），说明该对引物可以用于扩增无翅成蚜和有翅成蚜两种虫态体内的ACT1基因。标准曲线的拟合方程分别为y=－3.446x+31.119（相关系数R²=0.999），和y=－3.484x+30.220（相关系数R2=0.999），根据公式扩增效率E=10^(-1/斜率)-1，得出该对引物对无翅成蚜和有翅成蚜两种虫态体内的ACT1基因的扩增效率E分别为95.067%和93.665%，说明该对引物的扩增效率很高，已接近100%。

实施例3.作为检测带毒蚜虫体内大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)CP基因的内参基因

3.1.样品制备

无毒的禾谷缢管蚜有翅成蚜和无翅成蚜取食感染BYDV-PAV的燕麦植株，在取食时间间隔为12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h时分别取样。每个取食时间间隔处，每种翅型的蚜虫取8头，合在一起作为一个样品提取RNA。整体实验设3次重复。所有样品的RNA提取方法详见实施例1中1.1所述。

3.2.CP基因的qPCR扩增引物合成

qPCR扩增上游引物(SEQ ID NO6)：5′-CGGGGCTGAGGTATTCGTAT-3′；

qPCR扩增下游引物(SEQ ID NO7)：5′-AGGACTTTGAGGCGGATTTG-3′。

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（PAGE纯化法）。

3.3.RT-qPCR扩增

ACT1基因的RT-qPCR扩增方法见实施例2中2.3所述，每个样品的ACT1Cq值（Cq_re）用于相对定量分析。CP基因的RT-qPCR扩增使用引物对Q CP F和Q CP R，其它试剂的使用和RT-qPCR的反应程序与ACT1基因的RT-qPCR扩增方法完全一致，每个样品的CP Cq值(Cq_target)用于相对定量分析。

3.4.BYDV-PAV CP基因的相对表达量

每个样品中CP基因的相对表达量（Relative Quantification，RQ）使用一下系列公式进行计算得到。

ΔCq_target=minCq_target-sampleCq_target     1

Q_target=E_target'^ΔCqtarget     2

ΔCq_re=minCq_re-sampleCq_re     3

Q_re=E_re'^ΔCqre     4

$\mathrm{RQ}=\frac{Q_{t\arg \mathrm{et}}}{Q_{\mathrm{re}}}---5$

其中E'=E+1

通过上述公式计算，有翅成蚜在不同时间间隔内取食带毒植株，体内的BYDV-PAV CP基因相对于ACT1的表达量如图5；无翅成蚜在不同时间间隔内取食带毒植株，体内的BYDV-PAV CP基因相对于ACT1的表达量如图6。

3.5.实验结果

随着蚜虫（禾谷缢管蚜有翅成蚜或无翅成蚜）在带毒燕麦上取食时间间隔的增长，BYDV-PAV CP基因的相对表达量也逐渐增加，并且都在取食时间间隔为72h之后开始呈波动状态。这种情况与BYDV植物病毒在蚜虫体内的积累和循环方式相一致：在饲毒初期（一般在蚜虫饲毒48h左右）就可以传毒，BYDV逐渐积累于蚜虫的肠道，然后穿过肠道壁进入血淋巴和（副）唾液腺，此阶段病毒在蚜虫体内都呈增长趋势；饲毒后期（48h之后接着饲毒），部分BYDV随蚜虫的唾液会再分泌到植物之内，此阶段病毒含量略降低；蚜虫继续取食带毒植株，病毒含量又会增加，如此循环下去。最终表明，ACT1基因在禾谷缢管蚜体内表达稳定，可作为定量蚜虫体内植物病毒的内参基因。

Claims (6)

1.禾谷缢管蚜ACT1基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种禾谷缢管蚜ACT1基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷缢管蚜基因组总RNA，采用引物ACT1R进行RT-PCR扩增，以产物第一链cDNA作为模板、以引物对ACT1F/ACT1R进行PCR扩增，得到阳性克隆，最后经测序验证；其中引物序列为：

ACT1F:5′-ATGTGTGACGAAGAAGTAGC-3′；

ACT1R:5′-TTAGAAGCACTTTCTGTGC-3’。

3.根据权利要求2所述的方法，所述PCR扩增的反应条件如下：94℃3min；94℃45s，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延长10min，4℃保存。

4.一种qPCR扩增ACT1基因部分序列的方法，抽提禾谷缢管蚜基因组总RNA，以试剂盒自带引物混合物为引物进行RT反应，然后以产物第一链cDNA作为模板进行定量PCR扩增，荧光染料为SYBR Green I，其中定量PCR扩增中的禾谷缢管蚜的定量引物，其序列为：

QACT1F：5′-AACGGAAGCACCTTTGAACC-3′；

QACT1R：5′-GGAAGAAGCAGCAGTAGCCAT-3′。

5.根据权利要求4所述的方法，所述定量PCR扩增采用两步法，即在95℃预变性15min之后，先运行40个循环的95℃10sec，59.2℃32sec，72℃32sec，再运行溶解曲线阶段的95℃15sec，60℃1min，95℃30sec，60℃15sec。

6.权利要求1所述的禾谷缢管蚜ACT1基因片段作为内参基因在检测禾谷缢管蚜体内黄矮病毒CP基因中的应用。