CN106434879A

CN106434879A - 快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法

Info

Publication number: CN106434879A
Application number: CN201610750082.0A
Authority: CN
Inventors: 梁月
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-08-29
Also published as: CN106434879B

Abstract

本发明提供一种快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法。基于双重PCR技术，设计检测蛹虫草不同菌种交配型MAT1‑1和MAT1‑2的PCR引物组合Cm1F/Cm1R(Seq ID No:1‑2)和Cm2F/Cm2R(Seq ID No:3‑4)，实现“一步法”快速、准确地鉴定不同菌种交配型目的，缩减了鉴定时间，节约了试剂用量，降低了鉴定成本，为开展高效经济型人工栽培蛹虫草及天然蛹虫草资源保护与利用提供理论基础和技术支持。

Description

快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法

技术领域

本发明涉及多重PCR检测技术，具体地说，涉及一种快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris)俗称北虫草、北冬虫夏草，是一种珍贵的药用真菌及中药材，世界性分布天然资源数量很少。蛹虫草作为一种“药食同源”滋补佳品，在中西医治疗与保健方面得到广泛认可和应用。蛹虫草也作为一种营养价值较高的药(食)用菌。但是野生蛹虫草的产地生态环境条件特殊，极大地限制了蛹虫草的生长区域范围及产量，加之近年来野生资源过度开发导致其野生资源日趋枯竭。随着对蛹虫草生物学特性的认识深入和技术探索提高，蛹虫草实现了人工培养，其药用及营养价值不逊于野生蛹虫草，其药用价值可与冬虫夏草相媲美，部分营养价值甚至更高。作为替代名贵中药冬虫夏草作为药(食)用菌已被广泛接受。

目前，蛹虫草生产中通常以传统方法分离蛹虫草菌株，作为生产使用的菌种。这类菌种由于生物学及遗传背景等特征不清楚，导致栽培过程中出现菌种退化及变异严重，从而引起蛹虫草栽培形成的子实体畸形、品质下降甚至减产等严重问题，极大地制约了蛹虫草的生产与开发规模。蛹虫草的主要药用组织—子实体为有性生殖的产物。真菌交配型是调控有性生殖的重要遗传基础之一，蛹虫草作为一种典型的异宗配合子囊门真菌，其交配型具有二极性特点，即有性生殖的发生与子实体的形成需要两个不同交配型(MAT1-1和MAT1-2)。利用分子生物学链式聚合酶反应(PCR)方法，可以有效针对蛹虫草的单分生孢子和子囊孢子来源的菌种，进而对蛹虫草菌种的遗传背景进行有效鉴定，为后续不同交配型菌种的混合杂交以实现子实体的形成，以及相关的蛹虫草生物学特性研究提供良好的理论基础和技术支持。

目前为止，为明确不同来源菌种的交配型，避免部分遗传背景不单一或混杂的菌种同时存在两个交配型的现象，需要分别进行两次PCR反应用以明确菌种的交配型类型，这种对不同菌种的交配型进行鉴定的方法存在鉴定方案效率低，鉴定周期较长，试剂消耗量大等缺陷。因此，有必要研发一套快速高效的蛹虫草交配型鉴别方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于双重PCR技术的，快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供用于双重PCR检测蛹虫草不同菌种交配型的引物组合，所述引物组合包括，

用于鉴定交配型MAT1-1的特异性引物对(Seq ID No:1-2)：

Cm1F：5′-TCCAAGCCTCAATCGAC-3′

Cm1R：5′-AACAAGCATCTTGGTAC-3′；以及

用于鉴定交配型MAT1-2的特异性引物对(Seq ID No:3-4)：

Cm2F：5′-ACCGACATACGCTTGTC-3′

Cm2R：5′-ATGCCGTTCGAGGAGAG-3′。

本发明还提供含有所述引物组合的用于PCR检测蛹虫草不同菌种交配型的试剂盒。

所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

本发明还提供所述引物组合、含有所述引物组合的试剂盒在PCR检测蛹虫草不同菌种交配型中的应用。

本发明进一步提供一种快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用引物组合Cm1F/Cm1R和Cm2F/Cm2R进行双重PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

其中，PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃30秒，45-53℃30-45秒，72℃30秒，25-40个循环；72℃5-15分钟；4℃保存。

可采用0.8-1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。如果扩增出396bp和205bp两条特征条带，则表明样品中含有MAT1-1和MAT1-2两种交配型；如果仅扩增出396bp一条特征条带，则表明样品中含有交配型MAT1-1；如果仅扩增出205bp一条特征条带，则表明样品中含有交配型MAT1-2。

可按照如下方法提取样品DNA：

挑取少量蛹虫草菌丝，与650μL提取缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 8.0；50mM EDTA，pH 8.0；1％SDS；10μg/mL RNase A)混合，震荡10-60秒；加入100μL醋酸钾(KAc，3.0M，pH5.5，4℃保存)溶液，震荡混匀,在8 000-12 000rpm离心2-5min；取上清液300-750μL到另一无菌离心管中；加入500-800μL氯仿，与上清液混合，在8000-12 000rpm离心2-5min；取上清液300-750μL到新的无菌离心管中，加入500-800μL冰冻预冷-20℃的异丙醇，混合均匀，-20℃静置10-60min，然后在8 000-12 000rpm离心2-5min，去除上清液后；离心沉淀用500-1000μL 70％乙醇，清洗2-5次；无菌风或真空离心浓缩仪干燥后，溶解于10-100μL无菌水或TE缓冲液中，通过超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

本发明结合现代真菌学研究技术手段，建立了一套高效和经济的蛹虫草菌种交配型鉴定技术体系，首次提出“一步法”快速检测鉴定方法，即在一个PCR反应中加入两对不同交配型基因引物，实现快速、准确地鉴定不同菌种交配型目的，同时缩减了鉴定时间，节约了试剂用量，降低了鉴定成本，为开展高效经济型人工栽培蛹虫草及天然蛹虫草资源保护与利用提供理论基础和技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例2中蛹虫草基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M为DNA Marker，1和2分别为2000ng和4000ng基因组DNA。

图2为本发明实施例2中对蛹虫草基因组DNA模板量的优化结果；其中，M为DNAMarker，1-5分别为模板DNA用量500ng，200ng，100ng，10ng，1ng。

图3为本发明实施例2中对PCR反应退火温度的优化结果；其中，M为DNA Marker，1-6分别为退火温度45℃，47℃，49℃，51℃，53℃，55℃。

图4为本发明实施例2中“一步法”与常规“二步法”的PCR检测结果比较；其中，M为DNA Marker，常规“二步法”PCR(分别使用交配型引物之一)：其中1-3和4-6为交配型MAT1-1引物扩增单子囊孢子代表菌株S1-3(MAT1-1)和S4-6(MAT1-2)的模板DNA，7-9和10-12为交配型MAT1-2引物扩增菌株S1-3和S4-6的模板DNA；13-22，快速“一步法”PCR(同时使用两个交配型引物)：其中13-15和16-18为扩增菌株S1-3和S4-6的模板DNA，19-21扩增菌株S1和S4，S2和S5，S3和S6的混合模板DNA，22扩增子实体模板DNA。

图5为本发明实施例3中对不同来源的蛹虫草菌种交配型进行“一步法”PCR检测；其中，M为DNA Marker，1-18为不同来源的单子囊孢子菌株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中所用蛹虫草菌株S1-S6为子实体分离获得的单子囊孢子菌株，保藏于沈阳农业大学真菌生物学实验室。

实施例1用于双重PCR检测蛹虫草不同菌种交配型的特异性引物设计与合成

根据蛹虫草全基因组及交配型基因序列，利用Premier Primer 3软件设计，并人工合成鉴定交配型MAT1-1(gi 573987612或XM_006671664.1)和MAT1-2(gi 38175274或AB124626.1)的特异性引物对Cm1F/Cm1R和Cm2F/Cm2R，引物序列见表1。另外，为了方便扩增后期电泳检测，不同交配型PCR扩增产物大小通过设计分别为396和205bp，以便快速并直观的区分不同菌株的交配型。

引物设计原则：①引物大小控制在20bp以内，引物3’端以C或G结尾；②通过在线软件(http://www.oligoevaluator.com/OligoCalcServlet)分析所设计的引物，避免出现引物二聚体(self-dimer和cross-dimer)或发卡结构(hairpin)。

表1蛹虫草交配型MAT1-1和MAT1-2快速检测引物序列

实施例2基于双重PCR快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法

1、蛹虫草基因组DNA的快速提取

挑取少量蛹虫草菌丝，与650μL提取缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 8.0；50mM EDTA，pH 8.0；1％SDS；10μg/mL RNase A)混合，震荡10-60秒；加入100μL醋酸钾(KAc，3.0M，pH5.5，4℃保存)溶液，震荡混匀,在8 000-12 000rpm离心2-5min；取上清液300-750μL到另一无菌离心管中；加入500-800μL氯仿，与上清液混合，在8000-12 000rpm离心2-5min；取上清液300-750μL到新的无菌离心管中，加入500-800μL冰冻预冷-20℃的异丙醇，混合均匀，-20℃静置10-60min，然后在8 000-12 000rpm离心2-5min，去除上清液后；离心沉淀用500-1000μL 70％乙醇，清洗2-5次；无菌风或干燥浓缩仪干燥后，溶解于10-100μL无菌水或TE缓冲液中，通过超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度(表2)，并使用0.5-1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测(图1)。

表2蛹虫草基因组DNA检测

2、蛹虫草交配型快速检测PCR反应体系

PCR反应体系见表3。其中，对作为体系中模板DNA的用量进行优化，结果表明，反应体系中模板DNA用量在10-200ng之间，其中推荐模板用量控制在100-200ng之间，可有效扩增并鉴定交配型(图2)。

表3蛹虫草交配型PCR反应体系

注：x为10-200ng，优选100-200ng。

3、蛹虫草交配型快速检测PCR反应条件

PCR反应条件如下：95℃3分钟；95℃30秒，45-53℃30-45秒，72℃30秒，25-40个循环；72℃8-20分钟；4℃保存。通过0.8-1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明退火温度在45-53℃之间，均可以有效检测不同交配型基因(图3)。

4、蛹虫草交配型快速检测“一步法”PCR

通过对已知交配型的蛹虫草单子囊孢子菌株(交配型MAT1-1单子囊孢子代表菌株S1-3和交配型MAT1-2单子囊孢子代表菌株S4-6)进行PCR检测，比较快速检测“一步法”与常规“二步法”的PCR方法，以获得快速检测PCR体系的稳定性和灵敏度等信息。结果表明，利用交配型引物MAT1-1或MAT1-2对不同交配型但子囊孢子代表菌株进行检测，只能扩增其对应已知交配型片段(图4)。另外，通过快速检测PCR方法，当只有一个交配型基因存在条件下，检测体系只能扩增其已知的片段，而当不同交配型菌株混合时，可以同时扩增两个不同交配型。快速PCR方法可以达到与常规PCR方法同样检测的结果和灵敏度，而时间和试剂成本等，相应减半(图4)。

实施例3对不同来源的蛹虫草菌种交配型进行PCR检测

利用优化的蛹虫草交配型PCR反应条件及体系，对不同来源的单子囊孢子菌株进行鉴定，以确定其交配型及“一步法”检测体系的实用性。随机选取通过单子囊孢子分离技术选取的不同单子囊孢子菌株，进行PCR检测。结果表明，设计的特异性混合引物可以快速准确检测不同来源菌株的交配型(图5)。其中，在检测的群体中，交配型MAT1-1占55.6％，交配型MAT1-2占44.4％，二者比例为10:8，符合理论上MAT1-1:MAT1-2＝1:1的比例。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.用于双重PCR检测蛹虫草不同菌种交配型的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括，

用于鉴定交配型MAT1-1的特异性引物对：

Cm1F：5′-TCCAAGCCTCAATCGAC-3′

Cm1R：5′-AACAAGCATCTTGGTAC-3′；以及

用于鉴定交配型MAT1-2的特异性引物对：

Cm2F：5′-ACCGACATACGCTTGTC-3′

Cm2R：5′-ATGCCGTTCGAGGAGAG-3′。

2.含有权利要求1所述引物组合的用于PCR检测蛹虫草不同菌种交配型的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

4.权利要求1所述引物组合、权利要求2或3所述试剂盒在PCR检测蛹虫草不同菌种交配型中的应用。

5.一种快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行双重PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃30秒，45-53℃30-45秒，72℃30秒，25-40个循环；72℃5-15分钟；4℃保存。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)采用0.8-1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；如果扩增出396bp和205bp两条特征条带，则表明样品中含有MAT1-1和MAT1-2两种交配型；如果仅扩增出396bp一条特征条带，则表明样品中含有交配型MAT1-1；如果仅扩增出205bp一条特征条带，则表明样品中含有交配型MAT1-2。

9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，样品DNA的提取方法如下：

挑取少量蛹虫草菌丝，与650μL提取缓冲液混合，震荡10-60秒；加入100μL醋酸钾溶液，震荡混匀,在8 000-12 000rpm离心2-5min；取上清液300-750μL到另一无菌离心管中；加入500-800μL氯仿，与上清液混合，在8 000-12 000rpm离心2-5min；取上清液300-750μL到新的无菌离心管中，加入500-800μL冰冻预冷-20℃的异丙醇，混合均匀，-20℃静置10-60min，然后在8 000-12 000rpm离心2-5min，去除上清液后；离心沉淀用500-1000μL 70％乙醇，清洗2-5次；无菌风或真空离心浓缩仪干燥后，溶解于10-100μL无菌水或TE缓冲液中，通过超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度；

其中，所述提取缓冲液中含有100mM Tris-HCl,pH 8.0；50mMEDTA，pH 8.0；1％SDS；10μg/mL RNase A；所述醋酸钾溶液的浓度为3.0M，pH 5.5。