CN108728568B - 一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灵芝80‑108菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，其序列如SEQ ID NO.1‑3所示。获得方法括：(1)提取基因组DNA；(2)进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；(4)对切胶纯化产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的灵芝菌株中具有80‑108菌株的专一性。

Description

一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用

技术领域

本发明属于菌株分子标记技术领域，特别涉及一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用。

背景技术

灵芝[Ganoderma Lucidum(Fr.)Karst]隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyporaceae)，灵芝属(Ganoderma)，是一种为人熟知的药用真菌。又被称为“灵芝草”、“仙草”、“瑞草”，也叫长生草、灵草、还魂草，在我国有悠久的药用历史。全世界已知的灵芝有100多种，在我国的南北山区均有分布。我国灵芝的人工栽培已经有60多年的历史，野生灵芝的资源十分有限，近年来灵芝的开发越来越受到人们的重视，人工栽培规模越来越大，同时出现了栽培技术和栽培原料的多样化。

灵芝的栽培和生产的发展在很大程度上必须依赖菌种，它是灵芝生产的前提和关键。而菌种的选育只有依靠长期的积累才能有所收获，但是由于灵芝是无性繁殖，其菌种生产工艺具有可复制性，使得容易被仿冒，导致国内菌种同物异名、同名异物的现象普遍存在。这给菇农和生产厂家带来极大的损失，影响他们栽培和生产的积极性，对整个灵芝产业的发展产生伤害。要想真正保护品种产权就必须先建立成熟的品种鉴定技术。另外，随着工厂化生产的推广，对栽培菌种的要求越来越高，需要更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证生产。

针对目前对于灵芝菌种存在的问题，急需加强菌株鉴定技术的研究，建立方便快捷有效的菌株鉴定体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的灵芝菌株中具有80-108菌株的专一性。

本发明的一种灵芝80-108菌株(CGMCC NO.13692)的特异性分子标记，其序列如SEQ ID NO.1-3所示。

本发明所采用的灵芝80-108菌株(Ganoderma lucidum)，保藏单位名称：CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.13692，保藏日期为2017年3月13日。建议分类命名为：灵芝(Ganoderma lucidum)。

本发明的一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：

(1)提取灵芝80-108菌株的基因组DNA；

(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：

L2F4：CCTAGCCCAACTGCACAAGA；

L2R4：CGTGAGTTTAGCCACCGGAT；(引物序列基于灵芝80-108菌株的pyrF基因的前后DNA片段的碱基序列设计)。

(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；

(4)对切胶纯化产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

所述步骤(1)中的灵芝80-108菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将灵芝80-108菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。

所述改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法具体为：将液氮冷冻干燥的灵芝菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；12000rpm、4℃离心10min，取上清液；在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；加入100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA 1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。

所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。

所述步骤(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1414bp左右的条带进行回收。

所述步骤(4)对切胶纯化产物进行酶切的体系为50μL，包含：10×M buffer 5μL，DNA≤2.5μg，BSSH II 2.5μL，加入双蒸水到50μL。

所述步骤(4)对切胶纯化产物进行酶切的条件为：50℃孵育2h。

所述步骤(4)对琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取切胶纯化产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。

本发明的一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记的应用，用于鉴别灵芝80-108菌株。

本发明原理：根据灵芝80-108菌株的pyrF基因突变，分析突变序列的特异性和稳定性，建立以突变基因为分子标记的快速鉴别灵芝80-108菌株的分子生物学方法。采用特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，对PCR产物回收并酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，灵芝80-108酶切出的DNA片段为三段，分别为503bp、269bp、645bp；而其它灵芝菌株酶切出的DNA片段为两段，分别为503bp和911bp。

有益效果

(1)本发明方法简单，成本低，对灵芝菌株pyrF基因进行PCR扩增后回收，并进行酶切和琼脂糖凝胶电泳检测，将得到的带型与80-108菌株的条带进行对照，与该条带一致即为80-108菌株；

(2)本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点；常规拮抗试验需要2周左右，出菇试验至少3个月的时间；本发明仅需4天，并且在收集的灵芝菌株中具有80-108菌株的专一性，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为灵芝不同菌株pyrF基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测；其中，M：DL2000marker；1：沪农灵芝1号；2：80；3：80-108；

图2为灵芝不同菌株pyrF基因的PCR产物酶切电泳检测；其中，M：DL2000marker；1：沪农灵芝1号；2：80；3：80-108；4：沪农灵芝1号酶切；5：80酶切；6：80-108酶切。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.材料：试验所使用的灵芝菌株80-108(CGMCC NO.13692)由中国普通微生物菌株保藏管理中心保藏。沪农灵芝1号菌株由中国农业微生物保藏中心食用菌分中心保藏，80菌株为灵芝沪农灵芝1号菌株原生质体分离得到的单核菌株。

2.PCR引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

表1 扩增pyrF基因的PCR引物

3.培养基：马铃薯葡萄糖培养基(PD培养基)：马铃薯20g、葡萄糖20g，加水至1L，灭菌后使用。

4.菌丝培养：将灵芝菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25℃下避光摇瓶培养，4d后收集菌丝。

5.用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取灵芝菌株基因组DNA：

(1)将液氮冷冻干燥的灵芝菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；

(2)12000rpm、4℃离心10min，取上清液；

(3)在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；

(4)在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；

(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；

(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；

(7)加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；

(8)加入100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；

(9)加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

(10)将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

6.PCR克隆相关基因：

PCR扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq(5U/μL)0.5μL，10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)4μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，引物各1μL(见表1)，双蒸水(ddH₂O)37.5μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。

提取灵芝菌株基因组DNA后对pyrF基因进行PCR扩增，PCR结果显示所有的灵芝菌株都在1414bp左右出现条带。如图1箭头标注所示。

7.对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化：

取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1414bp左右的条带进行回收。

8.对切胶纯化产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测：

对切胶纯化产物进行酶切的体系为50μL，包含：10×M buffer 5μL，DNA≤2.5μg，BSSH II2.5μL，加入双蒸水到50μL；酶切的条件为：50℃孵育2h；琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取上述步骤中的切胶纯化产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。

琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的条带DNA，经过酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示灵芝80-108菌株酶切出的DNA片段条带为三段，分别为503bp、269bp、645bp，如图2空心箭头所示；而其它灵芝菌株酶切出的DNA片段条带为二段，分别为503bp和911bp，相比增加一条即可确定该菌株为80-108菌株。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用

<130> 20180422

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctagcccaa ctgcacaaga ctaagtggag acccaacagg ggacatgtca catccagtgt 60

ccaccgtcca cctcccctcc tgcaccggct cggcccgacg gtgcggtact aattaaatta 120

tgtaaaaagc aaagtcccgc tacttatcta cataatatta atctctagta gttttcaatc 180

gaatcgagct catcgtcgac tccgtcgtcc tcaccaggct ctccttgtcc ctccttgtcc 240

tcagccaaaa tgtctctgga acagtaccaa acagaactca tcgagcacgc catggccgtc 300

ggcgccctca agttcggcac cttcaccctc aagtcaggcc ggtccgtccc ctcccccgcg 360

cccatcttct gaacccacct ctgaatcctc cgtcctccct tcgccgcgtc cagcacttcc 420

ccctacttct tcaacgccgg cctcctcgcc tcggggcccg tcctcgacac cctctgctcc 480

gcatacgccg cgacgatcgc gcg 503

<210> 2

<211> 269

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcgctccag tccacgcccg gcctccccgc gttcgacgtt ctcttcggcc ccgcgtacaa 60

gggcattccc ttcgccgccg gcaccgcgct tctcctccac cgcgaccacc agatcgcggt 120

cgacttcgcg tatgaccgca aggaggccaa ggaccacggc gagggcggcg tcaccgtcgg 180

cgcccccatc aagggcaagc gcgtcctcgt cctcgacgac gtcgccaccc gccggcactg 240

ccatccgcgg cgcgattaac accgtcacg 269

<210> 3

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcgcgaggg cggtgaggtc atcggcgctg tgctcatgct cgaccggcag gaggtcggca 60

aggactcggg gcgcagcatg gtcgcggagg tcgaggggct gcttgggggc gagggccgcg 120

tgtcgacgat cctcaagatg catgatctca tggcgtggtt gcgggcgcat gggcgcacgg 180

aggagcttga gaagatgcag gcgtattggg accagtacgg cgcgaaggat gccgctgcat 240

gagcagcgtt tgcagatggg gcgagcgcct gaggacgaga aaggcgaacg gaaggtcttc 300

aagaacttag aagccgtttc gtttcgtcgc ttctgcgtac caagcacact tttgtaatac 360

agcggagcac gcacatgcga ctgtttgctg ggccccccgc ttttggcggt gtagatcacg 420

cccgacggtg gagcgaggtt aactcgcatg gttctgaccc ccgtagccag actcgacctc 480

cggggagcgc atcaagctaa ccggacgcgg ttaggaataa tacggaccta caagcacagc 540

tatatagaac agggccctgg ctggccctgg atgaacacaa caccgaaatc tctctcggcc 600

aaataaccgc tctccgcctc cggacatccg gtggctaaac tcacg 645

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctagcccaa ctgcacaaga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgtgagttta gccaccggat 20

<210> 6

<211> 1414

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctagcccaa ctgcacaaga ctaagtggag acccaacagg ggacatgtca catccagtgt 60

ccaccgtcca cctcccctcc tgcaccggct cggcccgacg gtgcggtact aattaaatta 120

tgtaaaaagc aaagtcccgc tacttatcta cataatatta atctctagta gttttcaatc 180

gaatcgagct catcgtcgac tccgtcgtcc tcgccaggct caccttgtcc ctccttgtcc 240

tcagccaaaa tgtctctgga acagtaccaa acagaactca tcgagcacgc catggccgtc 300

ggcgccctca agttcggcac cttcaccctc aagtcaggcc ggtccgtccc ctcccccgcg 360

cccatctcct gaacccacct ctgaatcctc cgtcctccct tcgtcgcgtc cagcacttcc 420

ccctacttct tcaacgctgg cctcctcgcc tcggggcccg tccttgacac tctctgctcc 480

gcatacgcca cggccatcgc ccgcgcgctc cagtccacgc ccggccttcc cgcctttgat 540

gtcctcttcg gccccgcgta caagggcatc cccttcgccg ccggcaccgc gctccttctc 600

caccgcgacc accagatcgc ggtcgacttc gcgtatgacc gcaaggaggc caaggaccac 660

ggcgagggcg gcgtcaccgt cggcgccccc atcaagggca agcgcgtcct cgtcctcgac 720

gacgtcgcca ccgccggcac tgccatccgc ggcgcgatta acaccgtcac gcgcgagggc 780

ggtgaggtca tcggcgctgt gctcatgctc gaccggcagg aggtcggcaa ggactcgggg 840

cgcagcatgg tcgcggaggt cgaggggctg cttgggggcg agggccgcgt gtcgacgatc 900

ctcaagatgc atgatctcat ggcgtggttg cgggcgcatg ggcgcacgga ggagcttgag 960

aagatgcagg cgtattggga ccagtacggc gcgaaggatg ccgctgcatg agcagcgttt 1020

gcagatgggg cgagcgcctg aggacgagaa aggcgaacgg aaggtcttca agaacttaga 1080

agccgtttcg tttcgtcgct tctgcgtacc aagcacactt ttgtaataca gcggagcacg 1140

cacatgcgac tgtttgctgg gccccccgct tttggcggtg tagatcacgc ccgacggtgg 1200

agcgaggtta actcgcatgg ttctgacccc cgtagccaga ctcgacctcc ggggagcgca 1260

tcaagctaac cggacgcggt taggaataat acggacctac aagcacagct atatagaaca 1320

gggccctggc tggccctgga tgaacacaac accgaaatct ctctcggcca aataaccgct 1380

ctccgcctcc ggacatccgg tggctaaact cacg 1414

<210> 7

<211> 911

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcgctccag tccacgcccg gccttcccgc ctttgatgtc ctcttcggcc ccgcgtacaa 60

gggcatcccc ttcgccgccg gcaccgcgct ccttctccac cgcgaccacc agatcgcggt 120

cgacttcgcg tatgaccgca aggaggccaa ggaccacggc gagggcggcg tcaccgtcgg 180

cgcccccatc aagggcaagc gcgtcctcgt cctcgacgac gtcgccaccg ccggcactgc 240

catccgcggc gcgattaaca ccgtcacgcg cgagggcggt gaggtcatcg gcgctgtgct 300

catgctcgac cggcaggagg tcggcaagga ctcggggcgc agcatggtcg cggaggtcga 360

ggggctgctt gggggcgagg gccgcgtgtc gacgatcctc aagatgcatg atctcatggc 420

gtggttgcgg gcgcatgggc gcacggagga gcttgagaag atgcaggcgt attgggacca 480

gtacggcgcg aaggatgccg ctgcatgagc agcgtttgca gatggggcga gcgcctgagg 540

acgagaaagg cgaacggaag gtcttcaaga acttagaagc cgtttcgttt cgtcgcttct 600

gcgtaccaag cacacttttg taatacagcg gagcacgcac atgcgactgt ttgctgggcc 660

ccccgctttt ggcggtgtag atcacgcccg acggtggagc gaggttaact cgcatggttc 720

tgacccccgt agccagactc gacctccggg gagcgcatca agctaaccgg acgcggttag 780

gaataatacg gacctacaag cacagctata tagaacaggg ccctggctgg ccctggatga 840

acacaacacc gaaatctctc tcggccaaat aaccgctctc cgcctccgga catccggtgg 900

ctaaactcac g 911

Claims (8)

1.一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记的应用，其特征在于：用于鉴别灵芝80-108菌株，灵芝80-108菌株保藏编号：CGMCC NO.13692；所述特异性分子标记的序列如SEQ IDNO.1-3所示；所述特异性分子标记的获得方法步骤如下：

(1)提取灵芝80-108菌株的基因组DNA；

(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：

L2F4：CCTAGCCCAACTGCACAAGA；

L2R4：CGTGAGTTTAGCCACCGGAT；

(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；

(4)对切胶纯化产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，酶切所用酶是BSSHII。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)中的灵芝80-108菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将灵芝80-108菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1400bp左右的条带进行回收。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(4)中对切胶纯化产物进行酶切的体系为50μL，包含：10×M buffer 5μL，DNA≤2.5μg，BSSH II 2.5μL，加入双蒸水到50μL。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(4)中对切胶纯化产物进行酶切的条件为：50℃孵育2h。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取切胶纯化产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。

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