CN107557360A - 一种杏鲍菇nx2‑0菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种杏鲍菇NX2‑0菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，其序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。获得方法包括：(1)提取基因组DNA；(2)进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；(4)对切胶纯化产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的杏鲍菇菌株中具有NX2‑0菌株的专一性。
Description
技术领域
本发明属于菌株分子标记技术领域，特别涉及一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用。
背景技术
杏鲍菇(Pleurotus eryngii)又名刺芹侧耳，在分类上属于担子菌亚门(Basidinmycotina)，层菌纲(Hornenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae)，伞菌目(Agaricales) 侧耳科(Pleurotaceae)，侧耳属(Pleurotus)，是一种品质优良的大型伞菌，其菌肉质地肥厚，口感脆爽，被人们称作“平菇王”、“干贝菇”、“草原上的美味牛肝菌”。杏鲍菇具有高蛋白，富含膳食纤维，食用价值很高，不仅能够降血压、血脂，而且其含有的多糖对某些肿瘤也有一定的抑制作用，能够增强人体的免疫力、降低脉粥样硬化的风险，是21世纪的健康食品。
杏鲍菇的栽培和生产的发展在很大程度上必须依赖菌种，它是杏鲍菇生产的前提和关键。而菌种的选育只有依靠长期的积累才能有所收获，但是由于杏鲍菇是无性繁殖，其菌种生产工艺具有可复制性，使得容易被仿冒，导致国内菌种同物异名、同名异物的现象普遍存在。这给菇农和生产厂家带来极大的损失，影响他们栽培和生产的积极性，对整个杏鲍菇产业的发展产生伤害。要想真正保护品种产权就必须先建立成熟的品种鉴定技术。另外，随着工厂化生产的推广，对栽培菌种的要求越来越高，需要更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证生产。
针对目前对于杏鲍菇菌种存在的问题，急需加强菌株鉴定技术的研究，建立方便快捷有效的菌株鉴定体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的杏鲍菇菌株中具有NX2-0菌株的专一性。
本发明的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记，其序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。
所述杏鲍菇NX2-0菌株的保藏编号为：CGMCC NO.12880。扩增后的pyrF基因序列如SEQ ID NO.1所示。保藏日为2016年9月19日，保藏单位CGMCC（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号），建议分类命名为：杏鲍菇(Pleurotus eryngii)。
本发明的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：
(1)提取杏鲍菇NX2-0菌株的基因组DNA；
(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：
NXHF-F7：GTGCCGCCGTGGAGACTTA；
NXHF-R7：TACGCTGGCTAGGGAGTGC；(引物序列基于杏鲍菇NX2-0菌株的pyrF基因的突变位点而设计)
(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；
(4)对切胶纯化产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测。
所述步骤(1)中的杏鲍菇NX2-0菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将杏鲍菇NX2-0 菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。
所述改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法具体为：将液氮冷冻干燥的杏鲍菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；12000rpm、4℃离心10min，取上清液；在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4) 中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；加入100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；加入1μL10mg/mL 的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。
所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃75s；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
所述步骤(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1275bp左右的条带进行回收。
所述步骤(4)中对切胶纯化产物进行酶切的体系为30μL，包含：10×NE Buffer 5μL， DNA 1μg，CutSmartBslΙ1μL，加入双蒸水到50μL。
所述步骤(4)中对切胶纯化产物进行酶切的条件为：55℃孵育15min。
所述步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取切胶纯化产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
本发明的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的应用，用于鉴别杏鲍菇NX2-0菌株。
本发明原理：根据杏鲍菇NX2-0菌株的pyrF基因突变，分析突变序列的特异性和稳定性，建立以突变基因为分子标记的快速鉴别杏鲍菇NX2-0菌株的分子生物学方法。采用特异性引物对杏鲍菇菌株进行PCR扩增，对PCR产物回收并酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，杏鲍菇NX2-0酶切出的DNA片段为216bp和221bp，其序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5 所示。其它杏鲍菇菌株酶切出的DNA片段长度为437bp。
有益效果
(1)本发明方法简单，成本低，对杏鲍菇菌株pyrF基因进行PCR扩增后回收，并进行酶切和琼脂糖凝胶电泳检测，将得到的带型与NX2-0菌株的条带进行对照，与该条带一致即为NX2-0菌株；
(2)本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点；常规拮抗试验需要2周左右，出菇试验至少3个月的时间；本发明仅需 5天，并且在收集的杏鲍菇菌株中具有NX2-0菌株的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为杏鲍菇不同菌株pyrF基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测；其中，M：DL2000marker；1：杏韩；2：DX25；3：NX2-0；
图2为杏鲍菇不同菌株pyrF基因的PCR产物酶切电泳检测；其中，M：DL2000marker；1：杏韩；2：DX25；3：NX2-0；4：杏韩酶切；5：DX25酶切；6：NX2-0酶切。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.材料：试验所使用杏鲍菇杏韩菌株由中国农业微生物保藏中心食用菌分中心保藏，DX25 菌株为杏鲍菇杏韩菌株原生质体分离得到的单核菌株。
2.PCR引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
表1扩增pyrF基因的PCR引物
3.培养基：马铃薯葡萄糖培养基(PD培养基)：马铃薯20g、葡萄糖20g，加水至1L，灭菌后使用。
4.菌丝培养：将杏鲍菇菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25℃下避光摇瓶培养，4d后收集菌丝。
5.用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取杏鲍菇菌株基因组DNA：
(1)将液氮冷冻干燥的杏鲍菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于 65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；
(2)12000rpm、4℃离心10min，取上清液；
(3)在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀 10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
(4)在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min， 12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；
(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清液；
(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
(7)加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
(8)加入100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
(9)加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
(10)将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
6.PCR克隆相关基因：
PCR扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq(5U/μL)0.5μL，10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)4μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，引物各1μL(见表1)，双蒸水(ddH2O)37.5μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35 个循环；72℃10min；4℃保藏。
提取杏鲍菇菌株基因组DNA后对pyrF基因进行PCR扩增，PCR结果显示所有的杏鲍菇菌株都在1275bp左右出现条带。如图1箭头标注所示。杏鲍菇NX2-0菌株的pyrF基因经扩增后的序列如SEQ ID NO.1所示。
7.对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化：
取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1275bp 左右的条带进行回收。
8.对切胶纯化产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测：
对切胶纯化产物进行酶切的体系为30μL，包含：10×NE Buffer5μL，DNA1μg，CutSmart BslΙ1μL，加入双蒸水到50μL；酶切的条件为：55℃孵育15min；琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取上述步骤中的切胶纯化产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的条带DNA，经过酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示杏鲍菇NX2-0菌株酶切出的DNA片段为216bp和221bp，其序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。其它杏鲍菇菌株酶切出的DNA片段长度为437bp。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggctctgcga cgaatgccta aatgggtttg atgtagattc gaaggattgg gcgcttatct 60
tatcgctcct ctcctttcac ttttcagatc aaagcgagaa ctcatttgcc agttttctcg 120
aaatggcttc gacatcgctg gaacaatatc aaacacagct cattgagcag tctatggccg 180
tagacgccct caaatttggc acattcacac cgaaatctgg tcggtagggt ccacaatttc 240
ggcatgccgt gatctcgcat taatgcctaa gcatcgcaaa ccaggttatc gccatatttc 300
ataaatgcgg gcttgctaag cacaggaccg attctatcga cggtatccgc ggcgtacgca 360
gcgacgatcg catctgcctt gcaggacccc gatgcgccat tccccgaatt tgacgtcctc 420
ttcgggcctg cctacaaggg gattccattc gctgcatgta cggccgtcca gctgtatact 480
gctcatggct tgtctgtcgg ctttgcctac gaccgcaaag aagcgaagga tcacggagag 540
ggaggaaaca tggtcggcgt tccggtgcaa ggcaagaaag tggtcattct cgacgatgtg 600
atgacttcgg ggaaggctgt ccgaggtgct atcgatatcg tatctaaagc aggtggtgag 660
gtcgtcggcg ttgtccagct gctagataga gaggaagtag ggcaagacgg gcaaagcagt 720
accgtcaggg agctcgagtc ggaactgggt gttggacgcg tgaggtcgat tttgaagctt 780
gcggatttga tgaaatggtt ggagtctaaa ggcttgcgaa aagagctaca acgcatgcag 840
gaatatcgcg atcgctacgg tgtgaagaag taaaggtata atgcgtccat cttcgaagac 900
attgttggtc actaacacga ttgttggtat ctagcttcaa ggggtgtagc gaccgtagcg 960
ggggatgcaa atatatcatg aggagcacga aatgactaca gataagctgg cattcgtatc 1020
gtggatcatc gcgatgcgcc gctctttatg taaaagcttg tttcccccct tgctaagcat 1080
atccaggagg taactgagat acacctaggg caaaggaagc ttaaacttct caatgtcagc 1140
catgcctaag gactatatca atcagctctt ggggaactta atacagtaca gattacttag 1200
tgtgcctgag tcgtcgataa tcggacaatt ttgatcaccc cttcttccga acccgtcctc 1260
agagcctcgc ctcca 1275
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgccgccgt ggagactta 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacgctggct agggagtgc 19
<210> 4
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggctctgcga cgaatgccta aatgggtttg atgtagattc gaaggattgg gcgcttatct 60
tatcgctcct ctcctttcac ttttcagatc aaagcgagaa ctcatttgcc agttttctcg 120
aaatggcttc gacatcgctg gaacaatatc aaacacagct cattgagcag tctatggccg 180
tagacgccct caaatttggc acattcacac cgaaat 216
<210> 5
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctggtcggta gggtccacaa tttcggcatg ccgtgatctc gcattaatgc ctaagcatcg 60
caaaccaggt tatcgccata tttcataaat gcgggcttgc taagcacagg accgattcta 120
tcgacggtat ccgcggcgta cgcagcgacg atcgcatctg ccttgcagga ccccgatgcg 180
ccattccccg aatttgacgt cctcttcggg cctgcctaca a 221
Claims (10)
1.一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。
2.一种如权利要求1所述的杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：
(1)提取杏鲍菇NX2-0菌株的基因组DNA；
(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：
NXHF-F7：GTGCCGCCGTGGAGACTTA；
NXHF-R7：TACGCTGGCTAGGGAGTGC；
(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；
(4)对切胶纯化产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测。
3.根据权利要求2所述的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(1)中的杏鲍菇NX2-0菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将杏鲍菇NX2-0菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。
4.根据权利要求2所述的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA 1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。
5.根据权利要求2所述的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃75s；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
6.根据权利要求2所述的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1275bp左右的条带进行回收。
7.根据权利要求2所述的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中对切胶纯化产物进行酶切的体系为30μL，包含：10×NE Buffer 5μL，DNA 1μg，CutSmartBsl Ι 1μL，加入双蒸水到50μL。
8.根据权利要求2所述的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中对切胶纯化产物进行酶切的条件为：55℃孵育15min。
9.根据权利要求2所述的一种杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取切胶纯化产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
10.一种如权利要求1所述的杏鲍菇NX2-0菌株的特异性分子标记的应用，其特征在于：用于鉴别杏鲍菇NX2-0菌株。
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Publications (1)
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728568A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-11-02 | 上海市农业科学院 | 一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用 |
| CN108950041A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-07 | 上海市农业科学院 | 一种杏鲍菇遗传转化筛选标记 |
-
2017
- 2017-09-19 CN CN201710843959.5A patent/CN107557360A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728568A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-11-02 | 上海市农业科学院 | 一种灵芝80-108菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用 |
| CN108950041A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-07 | 上海市农业科学院 | 一种杏鲍菇遗传转化筛选标记 |
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180109 |