CN108624707A - 一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用 - Google Patents

一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种灵芝80‑3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，采用特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，回收PCR产物作为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩增，无DNA片段产生。获得方法括：(1)提取基因组DNA；(2)进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；(4)以切胶纯化产物为模板再次进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的灵芝菌株中具有80‑3菌株的专一性。

Description

一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用
技术领域
本发明属于菌株分子标记技术领域，特别涉及一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其 获得方法与应用。
背景技术
灵芝[Ganoderma Lucidum(Fr.)Karst]隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，担子菌纲 (Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyporaceae)，灵芝属(Ganoderma)，是一种为人熟知的药用真菌。 又被称为“灵芝草”、“仙草”、“瑞草”，也叫长生草、灵草、还魂草，在我国有悠久的 药用历史。全世界已知的灵芝有100多种，在我国的南北山区均有分布。我国灵芝的人工栽 培已经有60多年的历史，野生灵芝的资源十分有限，近年来灵芝的开发越来越受到人们的重 视，人工栽培规模越来越大，同时出现了栽培技术和栽培原料的多样化。
灵芝的栽培和生产的发展在很大程度上必须依赖菌种，它是灵芝生产的前提和关键。而 菌种的选育只有依靠长期的积累才能有所收获，但是由于灵芝可以无性繁殖，其菌种生产工 艺具有可复制性，使得容易被仿冒，导致国内菌种同物异名、同名异物的现象普遍存在。这 给菇农和生产企业带来极大的损失，影响他们栽培和生产的积极性，对整个灵芝产业的发展 产生伤害。要想真正保护品种产权就必须先建立成熟的品种鉴定技术。另外，随着人工栽培 的推广，对栽培菌种的要求越来越高，需要更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证 生产。
针对目前对于灵芝菌种存在的问题，急需加强菌株鉴定技术的研究，建立方便快捷有效 的菌株鉴定体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与 应用，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、 可重复性好的优点，在收集的灵芝菌株中具有80-3菌株的专一性。
本发明的一种灵芝80-3菌株(保藏编号：CGMCC NO.12879)的特异性分子标记，采用 特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，回收PCR产物作为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩增，无DNA片段产生。
本发明所采用的灵芝80-3菌株(Ganoderma lucidum)，保藏单位名称：CGMCC中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.12879，保藏日期为2016年9月19日。建议 分类命名为：灵芝(Ganoderma lucidum)。
本发明的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：
(1)提取灵芝80-3菌株的基因组DNA；
(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：
L2F4：CCTAGCCCAACTGCACAAGA；
L2R4：CGTGAGTTTAGCCACCGGAT；(引物序列基于沪农灵芝1号菌株的pyrF基因前后DNA碱基序列而设计)
(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；
(4)以切胶纯化产物再次进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，引物序列 为：
3F4：CGACTTCGCGTATGACCG；
3R4：GGGTCAGAACCATGCGAGTT；(引物序列基于灵芝80-3菌株的pyrF基因的突变位点 而设计)。
所述步骤(1)中的灵芝80-3菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将灵芝80-3菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中， -70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。
所述改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法具体为：将液氮冷冻干燥的灵芝菌丝研 磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；12000rpm、 4℃离心10min，取上清液；在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混 合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；在上述离心管 中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min， 取上清液移入新的离心管中；在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液) 的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；将得到的沉淀用 75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；加入预冷的95vol％ 乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；加入 100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；加入1μL10mg/mL的RNaseA于 37℃水浴1h，去除RNA；将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。
所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
所述步骤(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化具体为：取PCR扩增产 物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电 压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1414bp左右的条带进行回收。
所述步骤(4)以切胶纯化产物再次进行的PCR扩增反应的体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA1μL，引物各1μL，双蒸 水37.5μL。
所述步骤(4)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
所述步骤(4)对琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后， 用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
本发明的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的应用，用于鉴别灵芝80-3菌株。
本发明原理：根据灵芝80-3菌株的pyrF基因突变，分析突变序列的特异性和稳定性， 建立以突变基因为分子标记的快速鉴别灵芝80-3菌株的分子生物学方法。采用特异性引物对 灵芝菌株进行PCR扩增，对PCR产物回收后以其为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩 增，进行琼脂糖凝胶电泳检测，灵芝80-3再次进行PCR扩增后无DNA片段产生，其它灵芝 菌株再次PCR扩增出的DNA片段长度为606bp。
有益效果
(1)本发明方法简单，成本低，对灵芝菌株pyrF基因进行PCR扩增后回收，并再次进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，无条带生成即为80-3菌株；
(2)本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、 可重复性好的优点；常规拮抗试验需要2周左右，出菇试验至少3个月的时间；本发明仅需 4天，并且在收集的灵芝菌株中具有80-3菌株的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为灵芝不同菌株pyrF基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测；其中，M：DL2000marker；1：沪农灵芝1号；2：80；3：80-3；
图2为灵芝不同菌株pyrF基因的PCR产物酶切电泳检测；其中，M：DL2000marker；1：沪农灵芝1号；2：80；3：80-3；4：沪农灵芝1号再次PCR；5：80再次PCR；6：80-3再 次PCR。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.材料：试验所使用的灵芝菌株80-3(CGMCC NO.12879)由中国普通微生物菌株保藏管理 中心保藏。沪农灵芝1号菌株由中国农业微生物保藏中心食用菌分中心保藏，80菌株为沪农 灵芝1号原生质体分离得到的单核菌株。
2.PCR引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
表1两次PCR扩增的引物
3.培养基：马铃薯葡萄糖培养基(PD培养基)：马铃薯20g、葡萄糖20g，加水至1L，灭菌 后使用。
4.菌丝培养：将灵芝菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25℃下避光摇瓶培养，4d后收集菌 丝。
5.用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取灵芝菌株基因组DNA：
(1)将液氮冷冻干燥的灵芝菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃ 保温45～60min，间或轻摇混匀；
(2)12000rpm、4℃离心10min，取上清液；
(3)在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀 10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
(4)在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min， 12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；
(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙 醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温 离心5min；
(7)加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空 抽干或自然晾干；
(8)加入100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
(9)加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
(10)将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
6.PCR克隆相关基因：
PCR扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq(5U/μL)0.5μL，10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)4μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，引物各1μL (见表1)，双蒸水(ddH2O)37.5μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃ 2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
提取灵芝菌株基因组DNA后对pyrF基因进行PCR扩增，PCR结果显示所有的灵芝菌株 都在1414bp左右出现条带。如图1箭头标注所示。
7.对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化：
取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1400bp 左右的条带进行回收。
8.对切胶纯化产物再次进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测：
对切胶纯化产物再次进行PCR扩增的体系为50μL，包含：aKaRa ExTaq(5U/μL)0.5μL， 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)4μL，模板DNA(100ng/μL)1μL， 引物各1μL(见表1)，双蒸水(ddH2O)37.5μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取再次PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样 于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的条带DNA，经过再次PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检 测，电泳结果显示灵芝80-3菌株再次进行PCR扩增后无DNA片段产生，其它灵芝菌株再次PCR扩增出的DNA片段长度为606bp。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用
<130> 20180428
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctagcccaa ctgcacaaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtgagttta gccaccggat 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgacttcgcg tatgaccg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggtcagaac catgcgagtt 20
<210> 5
<211> 1414
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctagcccaa ctgcacaaga ctaagtggag acccaacagg ggacatgtca catccagtgt 60
ccaccgtcca cctcccctcc tgcaccggct cggcccgacg gtgcggtact aattaaatta 120
tgtaaaaagc aaagtcccgc tacttatcta cataatatta atctctagta gttttcaatc 180
gaatcgagct catcgtcgac tccgtcgtcc tcgccaggct caccttgtcc ctccttgtcc 240
tcagccaaaa tgtctctgga acagtaccaa acagaactca tcgagcacgc catggccgtc 300
ggcgccctca agttcggcac cttcaccctc aagtcaggcc ggtccgtccc ctcccccgcg 360
cccatctcct gaacccacct ctgaatcctc cgtcctccct tcgtcgcgtc cagcacttcc 420
ccctacttct tcaacgctgg cctcctcgcc tcggggcccg tccttgacac tctctgctcc 480
gcatacgcca cggccatcgc ccgcgcgctc cagtccacgc ccggccttcc cgcctttgat 540
gtcctcttcg gccccgcgta caagggcatc cccttcgccg ccggcaccgc gctccttctc 600
caccgcgacc accagatcgc ggtcgacttc gcgtatgacc gcaaggaggc caaggaccac 660
ggcgagggcg gcgtcaccgt cggcgccccc atcaagggca agcgcgtcct cgtcctcgac 720
gacgtcgcca ccgccggcac tgccatccgc ggcgcgatta acaccgtcac gcgcgagggc 780
ggtgaggtca tcggcgctgt gctcatgctc gaccggcagg aggtcggcaa ggactcgggg 840
cgcagcatgg tcgcggaggt cgaggggctg cttgggggcg agggccgcgt gtcgacgatc 900
ctcaagatgc atgatctcat ggcgtggttg cgggcgcatg ggcgcacgga ggagcttgag 960
aagatgcagg cgtattggga ccagtacggc gcgaaggatg ccgctgcatg agcagcgttt 1020
gcagatgggg cgagcgcctg aggacgagaa aggcgaacgg aaggtcttca agaacttaga 1080
agccgtttcg tttcgtcgct tctgcgtacc aagcacactt ttgtaataca gcggagcacg 1140
cacatgcgac tgtttgctgg gccccccgct tttggcggtg tagatcacgc ccgacggtgg 1200
agcgaggtta actcgcatgg ttctgacccc cgtagccaga ctcgacctcc ggggagcgca 1260
tcaagctaac cggacgcggt taggaataat acggacctac aagcacagct atatagaaca 1320
gggccctggc tggccctgga tgaacacaac accgaaatct ctctcggcca aataaccgct 1380
ctccgcctcc ggacatccgg tggctaaact cacg 1414
<210> 6
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgacttcgcg tatgaccgca aggaggccaa ggaccacggc gagggcggcg tcaccgtcgg 60
cgcccccatc aagggcaagc gcgtcctcgt cctcgacgac gtcgccaccg ccggcactgc 120
catccgcggc gcgattaaca ccgtcacgcg cgagggcggt gaggtcatcg gcgctgtgct 180
catgctcgac cggcaggagg tcggcaagga ctcggggcgc agcatggtcg cggaggtcga 240
ggggctgctt gggggcgagg gccgcgtgtc gacgatcctc aagatgcatg atctcatggc 300
gtggttgcgg gcgcatgggc gcacggagga gcttgagaag atgcaggcgt attgggacca 360
gtacggcgcg aaggatgccg ctgcatgagc agcgtttgca gatggggcga gcgcctgagg 420
acgagaaagg cgaacggaag gtcttcaaga acttagaagc cgtttcgttt cgtcgcttct 480
gcgtaccaag cacacttttg taatacagcg gagcacgcac atgcgactgt ttgctgggcc 540
ccccgctttt ggcggtgtag atcacgcccg acggtggagc gaggttaact cgcatggttc 600
tgaccc 606

Claims (10)

1.一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记，其特征在于：采用特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，回收PCR产物作为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩增，无DNA片段产生。
2.一种如权利要求1所述的灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：
(1)提取灵芝80-3菌株的基因组DNA；
(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：
L2F4：CCTAGCCCAACTGCACAAGA；
L2R4：CGTGAGTTTAGCCACCGGAT；
(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；
(4)以切胶纯化产物为模板再次进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，引物序列为：
3F4：CGACTTCGCGTATGACCG；
3R4：GGGTCAGAACCATGCGAGTT。
3.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(1)中的灵芝80-3菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将灵芝80-3菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。
4.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。
5.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
6.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1400bp左右的条带进行回收。
7.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中对切胶纯化产物再次进行PCR扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA 1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。
8.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。
9.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
10.一种如权利要求1所述的灵芝80-3菌株的特异性分子标记的应用，其特征在于：用于鉴别灵芝80-3菌株。
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