CN101265494B - 香菇香九菌种的分子标记、其检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种香菇香九菌种的分子标记、其检测方法及应用，该分子标记是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR专用引物对序列为香九F：5’GGTCCATGTATAGTCTG3’与香九R：5’GTCCATTGGTTCAAAC 3’；检测方法：1)菌丝培养；2)基因组DNA的提取；3)SCAR分子标记的检测；4)电泳检测；应用：将香菇菌种进行基因SCAR扩增，存在SCAR标记的即是香菇香九菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点，在收集的我国30个香菇主栽菌种中具有香九菌种的专一性。
Description
技术领域
本发明属香菇菌种的检测领域，特别是涉及一种香菇香九菌种的分子标记、其检测方法与应用。
背景技术
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其闩本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。
面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种香菇香九菌种的分子标记、其检测方法与应用，通过采用PCR技术，经过筛选试验，获得了香菇菌株香九的特异DNA片断，以此片段的DNA序列为基础，设计特异性PCR扩增引物，通过对香九菌株的特异片段检测从而对香九菌种进行鉴定和检测。
本发明的一种香菇香九菌种的分子标记，是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR扩增的专用引物是香九F/R，香九F是5’GGTCCATGTATAGTCTG3’，香九R是5’GTCCATTGGTTCAAAC3’，PCR产物大小为750bp。
扩增出的SCAR片段的序列如下：
5′-GGTCCATGTATAGTCTGCAATTTATTGAACAAGATAAGAAGCAACAAATTAGGTATGCTAGGTCCATGTATAGTCTGCAATTTATTGAACAAGATAAGAAGCAACAAATTAGGTATGCTAAAAGGATTAAACAGTTGTATAAGCCCCTGCAGATTCTAGCATCTGTATCAATAACCAGTTATGTACTGCTGCTTGGGCATCCTTAATTTCAGTGGTGGAATCATAGCCTTGAGTAAGGAGATGAATCAGATGTGAGACTGGAATCCTCATGGTCCGGGTACAAGTCTTGAAGGAGCAGCAACCCGATAAGATATAGGCCCTGCATAGATCGGGGTCCGCCGTTGCTGGGAGATAACAAGGGTCACTATCTTCAACTAAAATAATCTACGCCATAGATGTGATGAGATGAGATGAGAGCCAATTTGTCAAATGCAAGATACCCACCCTGTCATGAAGTACGTAGCCCCTATCATTTTCCTTTTCTCACTGTCTCGACGCCTTTACTTGTACGATTACATCACTGTCAAACCCCATCGATTACTGATCCACCTAATCCCCATCATCGATTACTGATCCATCTGTTACCCTTCTCCTTCTACTGGCTTCCGCCACCTTCCTTGTTCCTAAACTGTACAGTACGACATCGTTGTTTCTCGCAGACCGGATTATGATATAGCCAACCCTCCACAGCCTGGTCCCTTATCTTGACCTCCCCATCTACTACATTTCAGTGCGGAAAATCCCCCTTTCGGAGGAAATTGGGGTACGTTCTTGAAGGAATTTAGCCAACGGTTTGAACCAATGGAC-3′。
本发明的一种香菇香九菌种的分子标记的检测方法，包括下列步骤：
(1)菌丝培养
将4℃保藏的香菇菌种转接到PDA平板上，23℃～25℃避光培养，10d～14d后接到100mL PDY培养基中，100rpm～150rpm，23℃～25℃摇瓶培养10d～14d后收集菌丝，放入-20℃冰箱保冻备用；
(2)基因组DNA的提取
用改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取菌丝的基因组DNA：
1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀；
2)12000rpm，4℃离心20min，取上清液；
3)加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液(混合液体积比为25∶24∶1)，轻轻混匀10min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中；
4)加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液(混合液体积比为24∶1)，轻轻混匀10min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中；
5)加入2/3体积(相对于上一步骤中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm，4℃离心10min，去上清；
6)沉淀用75％(体积百分数)乙醇、10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
7)加入预冷的95％(体积百分数)乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
8)加入100μL 10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
9)加入1μL 10mg/mL RNaseA 37℃水浴，1hr，去除RNA；
紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致，冷藏备用；
(3)SCAR分子标记的检测
扩增体系(总体积25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/LdNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L香九F/R引物各1μL，提取的模板DNA 1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL；
PCR反应条件：94℃1min；94℃15second，60℃15second，72℃ 1min，30个循环；72℃5min；
(4)电泳检测
取上述PCR扩增产物8μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液(Tris-硼酸缓冲液)中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB(溴化乙锭)染色，然后在凝胶成像仪上照相，分析结果。
本发明的一种香菇香九菌种的分子标记的应用，是利用香菇香九菌种基因SCAR的PCR扩增专用引物，进行基因SCAR扩增，存在SCAR标记的即是香菇香九菌种。
本发明的有益效果：
该检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。该检测所需时间只需要2-3天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国30个香菇主栽菌种中具有香九菌种的专一性。
附图说明
图1是香菇香九菌种的SCAR扩增图谱，其中M是100bpDNAladder，NC是空白对照，箭头所指是香菇香九菌种的特异性标记。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1、菌丝培养
将4℃保藏的香菇菌种转接到PDA平板上，25℃避光培养。14d后接到100mL PDY培养基中，150rpm，25℃摇瓶培养。待菌丝生长达到一定量时，收集菌丝，放入-20℃冰箱保冻备用。
2、基因组DNA的提取
用改进的CTAB法提取基因组DNA。紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致，冷藏备用。
3、SCAR分子标记的检测
扩增体系(总体积25μL)：10×PCRbuffer 2.5μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L香九F/R各1μL，模板DNA 1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL。
PCR反应条件：94℃ 1min；94℃ 15second，60℃ 15second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。
4、电泳检测
取上述PCR扩增产物8μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。
采用专用香九检测引物对香菇菌株进行PCR扩增，香九菌株能扩增出分子量为750bp的特殊DNA条带。如图1中箭头标注所示。
Claims (6)
1.一种香菇香九菌种的分子标记，其特征在于：该分子标记是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR扩增的专用引物是香九F/R，香九F是5’GGTCCATGTATAGTCTG 3’，香九R是5’GTCCATTGGTTCAAAC 3’，PCR产物大小为750bp；
扩增出的SCAR片段的序列如下：
5′-GGTCCATGTATAGTCTGCAATTTATTGAACAAGATAAGAAGCAACAAATTAGGTATGCTAGGTCCATGTATAGTCTGCAATTTATTGAACAAGATAAGAAGCAACAAATTAGGTATGCTAAAAGGATTAAACAGTTGTATAAGCCCCTGCAGATTCTAGCATCTGTATCAATAACCAGTTATGTACTGCTGCTTGGGCATCCTTAATTTCAGTGGTGGAATCATAGCCTTGAGTAAGGAGATGAATCAGATGTGAGACTGGAATCCTCATGGTCCGGGTACAAGTCTTGAAGGAGCAGCAACCCGATAAGATATAGGCCCTGCATAGATCGGGGTCCGCCGTTGCTGGGAGATAACAAGGGTCACTATCTTCAACTAAAATAATCTACGCCATAGATGTGATGAGATGAGATGAGAGCCAATTTGTCAAATGCAAGATACCCACCCTGTCATGAAGTACGTAGCCCCTATCATTTTCCTTTTCTCACTGTCTCGACGCCTTTACTTGTACGATTACATCACTGTCAAACCCCATCGATTACTGATCCACCTAATCCCCATCATCGATTACTGATCCATCTGTTACCCTTCTCCTTCTACTGGCTTCCGCCACCTTCCTTGTTCCTAAACTGTACAGTACGACATCGTTGTTTCTCGCAGACCGGATTATGTATATATAGCCAACCCTCCACAGCCTGGTCCCTTATCTTGACCTCCCCATCTACTACATTTCAGTGCGGAAAATCCCCCTTTCGGAGGAAATTGGGGTACGTTCTTGAAGGAATTTAGCCAACGGTTTGAACCAATGGAC-3′。
2.根据权利要求1所述的一种香菇香九菌种的分子标记的检测方法，包括下列步骤：
(1)菌丝培养
将香菇菌种转接到PDA平板上，23℃～25℃避光培养，10d～14d后接到100mLPDY培养基中，100rpm～150rpm，23℃～25℃摇瓶培养10d～14d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取
用改进的CTAB法提取菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
(3)SCAR分子标记的检测
将提取的DNA进行基因SCAR的PCR扩增；
(4)电泳检测
上述PCR扩增产物与加样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶上，电泳，用EB染色，在凝胶成像仪上照相，分析结果。
3.根据权利要求2所述的香菇香九菌种的分子标记的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的改进的CTAB法：
1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀；
2)12000rpm，4℃离心20min，取上清液；
3)加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液，其混合液的混合体积比为25∶24∶1，轻轻混匀10min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中；
4)加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，其混合液的混合体积比为24∶1，轻轻混匀10min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中；
5)加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm，4℃离心10min，去上清；
6)沉淀用体积百分数为75％的乙醇、10mmol/L醋酸钾，洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
7)加入预冷的体积百分数为95％的乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
8)加入100μL 10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
9)加入1μL 10mg/mL RNaseA 37℃水浴，1hr，去除RNA；
10)DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
4.根据权利要求2所述的香菇香九菌种的分子标记的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中的PCR扩增的总体积为25μL，包括：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL2 2μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L香九F/R引物各1μL，浓度1ng～10ng/μL提取的模板DNA 1μL，ddH2O 18.6μL；
PCR反应条件：94℃ 1min；94℃ 15second，60℃ 15second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。
5.根据权利要求2所述的香菇香九菌种的分子标记的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中的PCR扩增产物是8μL，加样缓冲液为1μL，琼脂糖凝胶为1.5％，电泳是在0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳。
6.根据权利要求1所述的一种香菇香九菌种的分子标记的应用，是利用香菇香九菌种基因SCAR的PCR扩增专用引物，进行所述分子标记的基因SCAR扩增，存在SCAR标记的即是香菇香九菌种。
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| 吴学谦等.SCAR分子标记技术在香菇菌株鉴定上的应用研究.菌物学报24 02.2005,24(02),259-266. |
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