CN102851377B - 一种香菇l9319菌种的ssr标记指纹图谱与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱与应用，该指纹图谱由7对基于香菇基因组序列开发的SSR标记的特异等位片段组合而成。应用包括：对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇L9319菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的我国25个国审的香菇主栽菌种中具有香菇L9319菌种的专一性。

Description

一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱与应用

技术领域

本发明属于香菇菌种的检测领域，特别涉及一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱与应用。

背景技术

我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70%以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。

优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。

面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。

本发明的一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由7对SSR标记组成，是基于香菇基因组简单重复序列片段开发SSR引物，扩增带型好，重复性高的SSR引物，标记详细信息如表1。

表1 SSR标记详细信息列表

本发明的一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的7对SSR引物，通过对收集的25份国审香菇栽培品种的SSR引物带型扩增，本发明确定了7对SSR引物在香菇L9319菌种中扩增出的等位片段的数量并编号（表2），通过不同SSR等位片段的编号组合可有效识别L9319菌种（图2-8）。通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的相对分子量，存在L9319菌种特异SSR等位片段组合的菌种，即是香菇L9319菌种，该菌种的编号组合为：11（1+2）11（1+2）（1+2）。

表2 SSR引物扩增的等位片段信息汇总表

有益效果

本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3~4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国25个通过国审的香菇主栽菌种中具有L9319菌种的专一性，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为香菇L9319菌种SSR标记指纹图谱，其中M是50bp DNA ladder，数字代表的是所用的7对SSR引物，NC是空白对照，箭头所指的是香菇L9319菌种的特异性SSR等位片段组合；

图2为引物Le_fp0001在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；

图3为引物Le_fp0002在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；

图4为引物Le_fp0003在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；

图5为引物Le_fp0004在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；

图6为引物Le_fp0005在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；

图7为引物Le_fp0006在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；

图8为引物Le_fp0007在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，23℃~25℃下避光摇瓶培养，3d~4d后收集菌丝；

（2）基因组DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；

CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：

①将液氮冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45~60min，间或轻摇混匀；

②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；

③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；

④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；

⑤在上述离心管中加入2/3体积（相对于步骤（4）中的上清液）的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；

⑥将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；

⑦加入预冷的95vol%乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；

⑧加入100μL 10×TE（Tris/EDTA）缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；

⑨加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

（3）SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；

PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/LdNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng~30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 10.4μL；

PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，55℃30second，72℃30second，30个循环；72℃5min

（4）电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果。

银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分后，在银染液（1.5克硝酸银和1500ml水）中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分，放入显影液（16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲醛）中，至显影后取出水洗后即可读数。

采用7对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：11（1+2）11（1+2）（1+2）的菌种，即可确定该菌种为香菇L9319菌种，如图1中箭头标注所示。为保证鉴定的准确性，建议进行三次重复实验。

Claims (1)

1.一种香菇L9319菌种的鉴定方法，其具体步骤如下：

(1)菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，23℃～25℃下避光摇瓶培养，3d～4d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；

CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：

①将液氮冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；

②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；

③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；

④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；

⑤在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；

⑥将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；

⑦加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；

⑧加入100μL10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；

⑨加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；

PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer2μL，25mmol/L MgCl₂2μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH₂O10.4μL；

PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，55℃30second，72℃30second，30个循环；72℃5min；

(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果；

银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分后，在银染液中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数；

采用7对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，即可确定该菌种为香菇L9319菌种；其中，7对SSR引物序列以及扩增的等位片段的数量和相对分子量如下：

Le_fp0001的正/反向引物分别为：

ACGCGTATCCTCCCCTAAGT/AAGCGATATGGATTTGACGC；等位片段的数量1，相对分子量600bp；

Le_fp0002的正/反向引物分别为：

GGGCGAAACAATTTCAGGTA/ATGCCATCGTAAGGAACTCG；等位片段的数量1，相对分子量290bp；

Le_fp0003的正/反向引物分别为：

ATTGTGACTCGACCACCTCC/TCATAATGCATCCCGTGAGA；等位片段的数量2，相对分子量900bp、800bp；

Le_fp0004的正/反向引物分别为：

CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；等位片段的数量1，相对分子量400bp；

Le_fp0005的正/反向引物分别为：

CATCAACCAAACCAAGATTCAA/TTCCAATTTCCTCCGAGTCA；等位片段的数量1，相对分子量720bp；

Le_fp0006的正/反向引物分别为：

CATGGGAGAGATTCGGAAAA/CGAGACCGACGACTTTGACT；等位片段的数量2，相对分子量800bp、780bp；

Le_fp0007的正/反向引物分别为：

CATTGCTCGGATCCTTCATT/TACCTCGTGCGGACTTTGAT；等位片段的数量2，相对分子量700bp、600bp。