CN102851364B - 香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用,该指纹图谱由7对SSR标记组成。构建方法包括:(1)菌丝培养;(2)基因组DNA的提取;(3)SSR分子标记的检测;(4)电泳检测。应用包括:对香菇菌种进行SSR标记扩增,将得到的带型与指纹图谱对照,与该指纹图谱一致即为香菇Cr02菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点,在收集的我国25个国审的香菇主栽菌种中具有香菇Cr02菌种的专一性。
Description
技术领域
本发明属于香菇菌种的检测领域,特别涉及一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。
背景技术
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨,占全球香菇总产量的70%以上,改写了世界食用菌产量的排行榜,并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距,有专家预测,由于中国香菇产业的迅猛发展,在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度,优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目,中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重,这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》,这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权,同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权,为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权,必须首先建立成熟的品种鉴定技术,为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》,对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言,香菇栽培菌种“同种异名,异种同名”的现象,不仅给菇农带来了极大的损失,影响了他们的栽培积极性,也极大地影响了中国香菇的快速发展;而且,随着大规模的工厂化栽培方式的出现,对香菇栽培菌株质量的要求越来越高,需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术,以保证每批次的用种都准确无误。
面对这种局势,就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究,在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用,该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短,准确性高,重复性好的优点。
本发明的一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱,该指纹图谱由7对SSR标记组成,是基于香菇基因组简单重复序列片段开发SSR引物,扩增带型好,重复性高的SSR引物,标记详细信息如表1。
表1SSR标记详细信息列表
本发明的一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,包括:
(1)菌丝培养:将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基PDL中,23℃~25℃下避光摇瓶培养,3d~4d后收集菌丝;
(2)基因组DNA的提取:用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA,紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度一致;
(3)SSR分子标记的检测:对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增;
(4)电泳检测:将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀,变性,点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,银染,显色,拍照,分析结果。
所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括:
(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,于65℃保温45~60min,轻摇混匀;
(2)12000rpm、4℃离心20min,取上清液;
(3)在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入离心管中;
(4)在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液,混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;
(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇,摇动5min,8000rpm、4℃离心10min,去上清;
(6)将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2~3次,每次8000rpm,室温离心5min;
(7)加入预冷的95vol%乙醇,上下颠倒,8000rpm室温离心10min,弃乙醇,真空抽干或自然晾干;
(8)加入100μL 10×TE(Tris/EDTA)缓冲液,使沉淀溶解;
(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。
所述步骤(3)中的PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/LMgCl2 2μL,10mmol/L dNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL,浓度20ng~30ng/μL提取的模板DNA2μL,ddH2O 10.4μL;
PCR反应条件:94℃5min;94℃30second,55℃30second,72℃30second,30个循环;72℃5min。
所述步骤(4)中的加样缓冲液Loading buffer为2μL;PCR扩增产物点样量为3μL。
所述步骤(4)中的变性的具体工艺为于95℃变性5min,结束后置于冰水混合物中冷却3min。
所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为:变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%,电泳缓冲液为1×TBE,电压1000v,电流200mA,功率200W,电泳45min。
所述步骤(4)中的银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板,胶板卸下后,用去离子水水洗5-8秒,沥干水分后,在银染液中避光银染8分钟,银染后,用去离子水水洗5-8秒,沥干水分,放入显影液中,至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化,在高通量试验中较为高效实用。
所述银染液的组成为1.5克硝酸银和1500ml水;显影液的组成为16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲醛。
本发明的一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱的应用,是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的7对SSR引物,通过对收集的25份国审香菇栽培品种的SSR引物带型扩增,本发明确定了7对SSR引物在国审香菇栽培品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2),通过不同SSR等位位点的编号组合可有效识别Cr02菌种(图2-8)。通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位位点的相对分子量,存在Cr02菌种特异SSR等位片段组合的菌种,即是香菇Cr02菌种,该菌种的编号组合为:1(1+2)(1+2)21(1+2)1。
表2SSR引物扩增的等位片段信息汇总表
有益效果
本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短,准确性高,重复性好的优点。检测所需时间只需要3~4天,而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间,出菇试验则需要至少3个月的时间;该方法在所收集的我国25个通过国审的香菇主栽菌种中具有Cr02菌种的专一性,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为香菇Cr02菌种SSR标记指纹图谱,其中M是50bp DNA ladder,数字代表的是所用的7对SSR引物,NC是空白对照,箭头所指的是香菇Cr02菌种的特异性SSR等位位点组合;
图2为引物Le_fp0001在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱;
图3为引物Le_fp0002在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱;
图4为引物Le_fp0003在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱;
图5为引物Le_fp0004在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱;
图6为引物Le_fp0005在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱;
图7为引物Le_fp0006在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱;
图8为引物Le_fp0007在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)菌丝培养:将香菇菌种转接到装有100ml马铃薯葡萄糖培养基PDL的三角瓶中,23℃~25℃下避光摇瓶培养,3d~4d后收集菌丝;
(2)基因组DNA的提取:用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA,紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度一致;
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括:
①将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,于65℃保温45~60min,间或轻摇混匀;
②12000rpm、4℃离心20min,取上清液;
③在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入离心管中;
④在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;
⑤在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇动5min,8000rpm、4℃离心10min,去上清;
⑥将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2~3次,每次8000rpm,室温离心5min;
⑦加入预冷的95vol%乙醇,轻轻上下颠倒,8000rpm室温离心10min,弃乙醇,真空抽干或自然晾干;
⑧加入100μL 10×TE(Tris/EDTA)缓冲液,轻轻敲打使沉淀溶解;
⑨加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用;
(3)SSR分子标记的检测:对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增;
PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/L MgCl22μL,10mmol/LdNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL,浓度20ng~30ng/μL提取的模板DNA2μL,ddH2O 10.4μL;
PCR反应条件:94℃5min;94℃30second,55℃30second,72℃30second,30个循环;72℃5min
(4)电泳检测:将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀,于95℃变性5min,结束后置于冰水混合物中冷却3min,点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%,电泳缓冲液为1×TBE,电压1000v,电流200mA,功率200W,电泳45min,银染,显色,拍照,分析结果。
银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板,胶板卸下后,用去离子水水洗5-8秒,沥干水分后,在银染液(1.5克硝酸银和1500ml水)中避光银染8分钟,银染后,用去离子水水洗5-8秒,沥干水分,放入显影液(16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲醛)中,至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化,在高通量试验中较为高效实用。
采用7对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增,通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量,找到符合编号组合为:1(1+2)(1+2)21(1+2)1的菌种,即可确定该菌种为香菇Cr02菌种,如图1中箭头标注所示。为保证鉴定的准确性,建议进行三次重复实验。
Claims (1)
1.一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,包括:
(1)菌丝培养:将香菇菌种转接到装有100ml马铃薯葡萄糖培养基PDL的三角瓶中,23℃~25℃下避光摇瓶培养,3d~4d后收集菌丝;
(2)基因组DNA的提取:用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA,紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度一致;
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括:
①将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,于65℃保温45~60min,间或轻摇混匀;
②12000rpm、4℃离心20min,取上清液;
③在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入离心管中;
④在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;
⑤在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇动5min,8000rpm、4℃离心10min,去上清;
⑥将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2~3次,每次8000rpm,室温离心5min;
⑦加入预冷的95vol%乙醇,轻轻上下颠倒,8000rpm室温离心10min,弃乙醇,真空抽干或自然晾干;
⑧加入100μL 10×TE缓冲液,轻轻敲打使沉淀溶解;
⑨加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用;
(3)SSR分子标记的检测:对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增;
PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/L MgCl22μL,10mmol/LdNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL,浓度20ng~30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 10.4μL;
PCR反应条件:94℃5min;94℃30second,55℃30second,72℃30second,30个循环;72℃5min;其中,SSR标记组成,具体序列如下:
Le_fp0001正向引物:ACGCGTATCCTCCCCTAAGT;
反向引物:AAGCGATATGGATTTGACGC;
Le_fp0002正向引物:GGGCGAAACAATTTCAGGTA;
反向引物:ATGCCATCGTAAGGAACTCG;
Le_fp0003正向引物:ATTGTGACTCGACCACCTCC;
反向引物:TCATAATGCATCCCGTGAGA;
Le_fp0004正向引物:CCCAAAAAGGATTTCAGCAA;
反向引物:AACCGGAGTGGTGTAAGTGC;
Le_fp0005正向引物:CATCAACCAAACCAAGATTCAA;
反向引物:TTCCAATTTCCTCCGAGTCA;
Le_fp0006正向引物:CATGGGAGAGATTCGGAAAA;
反向引物:CGAGACCGACGACTTTGACT;
Le_fp0007正向引物:CATTGCTCGGATCCTTCATT;
反向引物:TACCTCGTGCGGACTTTGAT;
(4)电泳检测:将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀,于95℃变性5min,结束后置于冰水混合物中冷却3min,点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%,电泳缓冲液为1×TBE,电压1000v,电流200mA,功率200W,电泳45min,银染,显色,拍照,分析结果;
银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板,胶板卸下后,用去离子水水洗5-8秒,沥干水分后,在银染液中避光银染8分钟,银染后,用去离子水水洗5-8秒,沥干水分,放入显影液中,至显影后取出水洗后即可读数,银染液、显影液均可用3-4次;
采用7对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增,通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量,找到符合编号组合为:1(1+2)(1+2)21(1+2)1的菌种,即可确定该菌种为香菇Cr02菌种。
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