CN102851376B - 一种香菇广香菌种的ssr标记指纹图谱与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种香菇广香菌种的SSR标记指纹图谱与应用，该指纹图谱由7对基于香菇基因组序列开发的SSR标记的特异等位片段组合而成。应用包括：对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇广香菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的我国25个国审的香菇主栽菌种中具有香菇广香菌种的专一性。

Description

一种香菇广香菌种的SSR标记指纹图谱与应用
技术领域
本发明属于香菇菌种的检测领域，特别涉及一种香菇广香菌种的SSR标记指纹图谱与应用。
背景技术
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70%以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。
面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇广香菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
本发明的一种香菇广香菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由7对SSR标记组成，是基于香菇基因组简单重复序列片段开发SSR引物，扩增带型好，重复性高的SSR引物，标记详细信息如表1。
表1 SSR标记详细信息列表
Figure BDA00002121995900021
本发明的一种香菇广香菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的7对SSR引物，通过对收集的25份国审香菇栽培品种的SSR引物带型扩增，本发明确定了7对SSR引物在香菇广香菌种中扩增出的等位片段的数量并编号（表2），通过不同SSR等位片段的编号组合可有效识别广香菌种（图2-8）。通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的相对分子量，存在广香菌种特异SSR等位片段组合的菌种，即是香菇广香菌种，该菌种的编号组合为：（1+2）（1+3）10（1+3）2（1+2）。
表2 SSR引物扩增的等位片段信息汇总表
Figure BDA00002121995900022
有益效果
本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3~4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国25个通过国审的香菇主栽菌种中具有广香菌种的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为香菇广香菌种SSR标记指纹图谱，其中M是50bp DNA ladder，数字代表的是所用的7对SSR引物，NC是空白对照，箭头所指的是香菇广香菌种的特异性SSR等位片段组合；
图2为引物Le_fp0001在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；
图3为引物Le_fp0002在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；
图4为引物Le_fp0003在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；
图5为引物Le_fp0004在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；
图6为引物Le_fp0005在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；
图7为引物Le_fp0006在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；
图8为引物Le_fp0007在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1）菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，23℃~25℃下避光摇瓶培养，3d~4d后收集菌丝；
（2）基因组DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将液氮冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45~60min，间或轻摇混匀；
②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
⑤在上述离心管中加入2/3体积（相对于步骤（4）中的上清液）的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
⑥将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
⑦加入预冷的95vol%乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
⑧加入100μL 10×TE（Tris/EDTA）缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
⑨加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；
（3）SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/LdNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng~30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH2O 10.4μL；
PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 second，55℃ 30 second，72℃ 30 second，30个循环；72℃5min
（4）电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果。
银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分后，在银染液（1.5克硝酸银和1500ml水）中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分，放入显影液（16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲醛）中，至显影后取出水洗后即可读数。
采用7对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：（1+2）（1+3）10（1+3）2（1+2）的菌种，即可确定该菌种为香菇广香菌种，如图1中箭头标注所示。为保证鉴定的准确性，建议进行三次重复实验。
Figure IDA00002121996800011
Figure IDA00002121996800021
Figure IDA00002121996800031
Figure IDA00002121996800041

Claims (2)

1.一种香菇广香菌种的SSR标记指纹图谱的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括7对SSR引物；其中，
Le_fp0001的正/反向引物分别为：
ACGCGTATCCTCCCCTAAGT/AAGCGATATGGATTTGACGC；
Le_fp0002的正/反向引物分别为：
GGGCGAAACAATTTCAGGTA/ATGCCATCGTAAGGAACTCG；
Le_fp0003的正/反向引物分别为：
ATTGTGACTCGACCACCTCC/TCATAATGCATCCCGTGAGA；
Le_fp0004的正/反向引物分别为：
CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；
Le_fp0005的正/反向引物分别为：
CATCAACCAAACCAAGATTCAA/TTCCAATTTCCTCCGAGTCA；
Le_fp0006的正/反向引物分别为：
CATGGGAGAGATTCGGAAAA/CGAGACCGACGACTTTGACT；
Le_fp0007的正/反向引物分别为：
CATTGCTCGGATCCTTCATT/TACCTCGTGCGGACTTTGAT。
2.一种如权利要求1所述的香菇广香菌种的SSR标记指纹图谱的试剂盒的应用，其特征在于：应用于鉴定香菇广香菌种的特异等位变异组合以及鉴定香菇广香菌种相对于其他国审香菇品种的特异性。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755509A (zh) * 2017-02-07 2017-05-31 上海市农业科学院 一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112626253B (zh) * 2020-12-25 2023-02-03 上海市农业科学院 一种香菇广香菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
CN112899388B (zh) * 2020-12-25 2023-02-03 上海市农业科学院 一种香菇香如菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684487A (zh) * 2008-09-24 2010-03-31 上海市农业科学院 一种真姬菇工厂化栽培菌株的ssr分子标记鉴别方法
CN101712984A (zh) * 2009-11-30 2010-05-26 浙江省林业科学研究院 鉴别香菇菌种241和241-4的分子特异性标记引物及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684487A (zh) * 2008-09-24 2010-03-31 上海市农业科学院 一种真姬菇工厂化栽培菌株的ssr分子标记鉴别方法
CN101712984A (zh) * 2009-11-30 2010-05-26 浙江省林业科学研究院 鉴别香菇菌种241和241-4的分子特异性标记引物及检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ruiying Zhang et al..Strain-typing of Lentinula edodes in China with inter simple sequence repeat markers.《APPLIED GENETICS AND MOLECULAR BIOTECHNOLOGY》.2006,140–145.
Strain-typing of Lentinula edodes in China with inter simple sequence repeat markers;Ruiying Zhang et al.;《APPLIED GENETICS AND MOLECULAR BIOTECHNOLOGY》;20061222;140-145 *
肖扬 等.香菇SSR-PCR 技术体系的优化及其在遗传多样性分析中的初步应用.《中国农学通报》.2009,第25卷(第2期),20-24.
香菇SSR-PCR 技术体系的优化及其在遗传多样性分析中的初步应用;肖扬 等;《中国农学通报》;20091231;第25卷(第2期);20-24 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755509A (zh) * 2017-02-07 2017-05-31 上海市农业科学院 一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用

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