CN105506124A - 金针菇f101菌种的ssr标记引物及其指纹图谱应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金针菇F101菌种的SSR标记引物及其指纹图谱应用，所述标记引物由引物名称为Fvm1，Fvm2、Fvm3、Fvm4、Fvm5、Fvm6中的6对SSR引物中至少一对构成，其步骤如下：（1）菌丝固体培养、（2）基因组DNA的提取、（3）SSR分子标记的检测、（4）电泳检测、（5）菌种鉴定。本发明提供的SSR标记与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及菌种检测鉴定领域，具体为一种金针菇F101菌种的SSR标记引物及其应用。
背景技术
金针菇（Flammulinavelutipes(Fr.)Sing.）隶属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，伞菌目，口蘑科，小火焰菌属，因形似金针菜而得名。金针菇又称构菌、、金菇、摄茸、毛柄金钱菌和冬菇。金针菇的自然分布很广泛。金针菇作为一种食用菌，是当今市场上十分走俏的天然保健食品之一。白金针菇蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，具有抗癌功能，经常食用具有预防高血压、治疗肝病和胃溃疡等功效。金针菇特别以富含赖氨酸而著称，可以活化神经细胞，促进智力发育，素有“增智菇”之美称。金针菇也是中国主要栽培食用菌和现代工厂化生产主要食用菌之一，2013年国内工厂化日生产量达到2700吨。
优质菌种在金针菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了金针菇菌种在金针菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是金针菇的生产构成了极大的威胁。就国内而言，金针菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国金针菇产业的发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对金针菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在金针菇的研究中建立更为有效的菌种鉴定体系。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种金针菇F101菌种的SSR标记及指纹图谱应用。该标记与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确
性高，重复性好的优点。
本发明第一目的在于提供一种金针菇F101菌种的SSR标记引物，所述标记引物由名称为Fvm1，Fvm2、Fvm3、Fvm4、Fvm5、Fvm6的6对SSR引物中至少一对构成；所述6对引物的正反核苷酸序列如下：
Fvm1：GAGGCGTCACCAAGGGATG，CTCAAAGGAATGCGCTGCA；
Fvm2：TTTCGCGCAGGTTTGG，TTGTGAGGGGACGGGTATG；
Fvm3：GTGAAGAAGAATAAGAGGGAGC，TGAGACTAGTGATGACGATGAAG；
Fvm4：TCATCTGTCCATTCATCATCA，GTTCAACACATTCACGCAA；
Fvm5：CAGCCCATTTTTCCACCC，CGAAGATTCCATTGACGATTTC；
Fvm6：CATTGTTCCTTCAGTCCGAGA，TTCCATCCGAATCCGTAGC。
F101是浙江省农科院育成的黄色工厂化金针菇品种，该品种，杆直较整齐，周期短（比白色品种工厂化快4天）、首潮产量稍低，但其仍有潜力，一般工厂化品种仅可收一茬，该菌株可以采收两茬，回潮快，二潮产量可接近第一潮，品质接近。
本发明的第二目的在于提供一种金针菇F101菌种的SSR标记引物通过指纹图谱在菌种检测鉴定中的应用。
本发明的第三目的在于提供该应用的具体步骤，步骤如下：
（1）菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，18℃~20℃下避光摇瓶培养，5d-7d后收集菌丝；
（2）基因组DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
（3）SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng~30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，以引物的退火温度30second，72℃30second，30个循环；72℃5min；
（4）电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与5μL加样缓冲液混匀，点样3.5μL于非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为10%，电泳缓冲液为1×TBE，电压150v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果。
（5）菌种鉴定：采用6对SSR引物对金针菇菌株进行PCR扩增，通过对照markerI可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：（1+2+3）（1+2+3）（1+2）（1+2）1（1+2）的菌种，即可确定该菌种为金针菇菌种。
进一步地，步骤（2）中CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将液氮冷冻干燥的金针菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45~60min，间或轻摇混匀；
②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
⑤在上述离心管中加入2/3体积（相对于步骤（4）中的上清液）的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
⑥将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
⑦加入预冷的95vol%乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
⑧加入100μL10×TE（Tris/EDTA）缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
⑨加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；
进一步地，重复实施步骤1-4三次，验证准确率。
进一步地，步骤（4）中银染的具体工艺为银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分后，在银染液（1.5克硝酸银和1500ml水）中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分，放入显影液（16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲醛）中，至显影后取出水洗后即可读数。
有益效果
本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3~4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国25个通过国审的金针菇主栽菌种中，具有F101菌种的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为金针菇F101菌种SSR标记指纹图谱（其中M是天根MarkerI，数字代表的是所用的6对SSR引物，C是空白对照，箭头所指的是金针菇F101菌种的特异性SSR等位片段组合）。
图2为引物Fvm1在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱。
图3为引物Fvm2在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱。
图4为引物Fvm3在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱。
图5为引物Fvm4在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱。
图6为引物Fvm5在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱。
图7为引物Fvm6在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式做进一步的说明。
实施例1
在本实施例中，结合附图1-7，对本发明的进行详细描述。
具体实验步骤如下：
（1）菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，18℃~20℃下避光摇瓶培养，5d-7d后收集菌丝；
（2）基因组DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
其中，CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将液氮冷冻干燥的金针菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45~60min，间或轻摇混匀；
②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
⑤在上述离心管中加入2/3体积（相对于步骤（4）中的上清液）的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
⑥将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
⑦加入预冷的95vol%乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
⑧加入100μL10×TE（Tris/EDTA）缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
⑨加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；
（3）SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng~30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，以引物的退火温度30second，72℃30second，30个循环；72℃5min
（4）电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与5μL加样缓冲液混匀，点样3.5μL于非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为10%，电泳缓冲液为1×TBE，电压150v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果。
银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分后，在银染液（1.5克硝酸银和1500ml水）中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分，放入显影液（16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲醛）中，至显影后取出水洗后即可读数。
（5）菌种鉴定：采用6对SSR引物对金针菇菌株进行PCR扩增，通过对照markerI可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：（1+2+3）（1+2+3）（1+2）（1+2）1（1+2）的菌种，即可确定该菌种为金针菇菌种，如图1中箭头标注所示。为保证鉴定的准确性，建议进行三次重复实验。
本发明的一种金针菇F101菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由6对SSR标记组成，是基于金针菇基因组简单重复序列片段开发SSR引物，扩增带型好，重复性高的SSR引物，标记引物详细信息如表1。
表1SSR标记详细信息列表
本发明的一种金针菇F101菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的6对SSR引物，通过对收集的25份金针菇栽培品种的SSR引物带型扩增，本发明确定了6对SSR引物在金针菇F101菌种中扩增出的等位片段的数量并编号（表2），通过不同SSR等位片段的编号组合可有效识别F101菌种（图2-7）。通过对照天根MarkerI可确定各SSR引物扩增的等位片段的相对分子量，存在F101菌种特异SSR等位片段组合的菌种，即是金针菇F101菌种，该菌种的编号组合为：（1+2+3）（1+2+3）（1+2）（1+2）1（1+2）。
表2SSR引物扩增的等位片段信息汇总表。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做出可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。
Claims (6)
1.金针菇F101菌种的SSR标记引物，其特征在于，所述标记引物由名称为Fvm1，Fvm2、Fvm3、Fvm4、Fvm5、Fvm6的6对SSR引物中至少一对构成；所述6对引物的正反核苷酸序列如下：
Fvm1：GAGGCGTCACCAAGGGATG，CTCAAAGGAATGCGCTGCA；
Fvm2：TTTCGCGCAGGTTTGG，TTGTGAGGGGACGGGTATG；
Fvm3：GTGAAGAAGAATAAGAGGGAGC，TGAGACTAGTGATGACGATGAAG；
Fvm4：TCATCTGTCCATTCATCATCA，GTTCAACACATTCACGCAA；
Fvm5：CAGCCCATTTTTCCACCC，CGAAGATTCCATTGACGATTTC；
Fvm6：CATTGTTCCTTCAGTCCGAGA，TTCCATCCGAATCCGTAGC。
2.如权利要求1所述的金针菇F101菌种的SSR标记引物通过指纹图谱在菌种检测鉴定中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：
（1）菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，18℃~20℃下避光摇瓶培养，5d-7d后收集菌丝；
（2）基因组DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
（3）SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng~30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，以引物的退火温度30second，72℃30second，30个循环；72℃5min；
（4）电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与5μL加样缓冲液混匀，点样3.5μL于非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为10%，电泳缓冲液为1×TBE，电压150v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果；
（5）菌种鉴定：采用6对SSR引物对金针菇菌株进行PCR扩增，通过对照markerI可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：（1+2+3）（1+2+3）（1+2）（1+2）1（1+2）的菌种，即可确定该菌种为金针菇菌种。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）中CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将液氮冷冻干燥的金针菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45~60min，间或轻摇混匀；
②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
⑤在上述离心管中加入2/3体积（相对于步骤（4）中的上清液）的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
⑥将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
⑦加入预冷的95vol%乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
⑧加入100μL10×TE（Tris/EDTA）缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
⑨加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，重复实施步骤1-4三次，验证准确率。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（4）中银染的具体工艺为银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分后，在银染液（1.5克硝酸银和1500ml水）中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分，放入显影液（16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲醛）中，至显影后取出水洗后即可读数。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106591286A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-04-26 | 南京农业大学 | 一种提高币斑病菌基因组dna提取质量的方法 |
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