CN104152547B - 一种金针菇青禾菌种的ssr标记指纹图谱与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金针菇青禾菌种的SSR标记指纹图谱与应用，该指纹图谱由6对基于金针菇基因组序列开发的SSR标记的特异等位片段组合而成。应用包括：对金针菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为青禾菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的我国24个主栽金针菇菌种中具有青禾菌种的专一性。
Description
技术领域
本发明属于金针菇菌种的检测领域，特别涉及一种金针菇青禾菌种的SSR标记指纹图谱与应用。
背景技术
金针菇[Flammulina velutipes(Fr.)Sing.]又名金菇、朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌，在分类上属于伞菌目白蘑科小火焰菌属。金针菇分布广泛，营养丰富，是一种经济价值很高的食用菌和药用菌，也是市场上十分走俏的天然保健食品之一。金针菇是中国主要栽培食用菌和现代工厂化生产主要食用菌之一，2013年国内工厂化日生产量达到2700吨。
优质菌种在金针菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了金针菇菌种在金针菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是金针菇的生产构成了极大的威胁。就国内而言，金针菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国金针菇产业的发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对金针菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。
面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在金针菇的研究中建立更为有效的菌种鉴定体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种金针菇青禾菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
本发明的一种金针菇青禾菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由6对SSR标记组成，是基于金针菇基因组简单重复序列片段开发SSR引物，扩增带型好，重复性高的SSR引物，标记详细信息如表1。
表1 SSR标记详细信息列表
本发明的一种金针菇青禾菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用金针菇基因组简单重复序列片段开发的6对SSR引物，通过对收集的24份国内主要金针菇栽培品种的SSR引物带型扩增，本发明确定了6对SSR引物在金针菇青禾菌种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同SSR等位片段的编号组合可有效识别青禾菌种(图2-7)。通过对照50bp DNAladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的相对分子量，存在青禾菌种特异SSR等位片段组合的菌种，即是金针菇青禾菌种，该菌种的编号组合为：2 (1+2) (2+3+4) 1 (1+3+5) 3。
表2 SSR引物扩增的等位片段信息汇总表
有益效果
本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3～4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少2个月的时间；该方法在所收集的我国24个金针菇主栽菌种中具有青禾菌种的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为金针菇青禾菌种SSR标记指纹图谱，其中M是50bp DNA ladder，数字代表的是所用的6对SSR引物，C是空白对照，箭头所指的是金针菇青禾菌种的稳定且特异的SSR等位片段组合；
图2为引物Fv_fp0001在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱；
图3为引物Fv_fp0002在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱；
图4为引物Fv_fp0003在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱；
图5为引物Fv_fp0004在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱；
图6为引物Fv_fp0005在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱；
图7为引物Fv_fp0006在所选金针菇栽培材料中的扩增图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，19℃～21℃下避光摇瓶培养，3d～4d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将液氮冷冻干燥的金针菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；
②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
⑤在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
⑥将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
⑦加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
⑧加入100μL 10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
⑨加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；
(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/LdNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，55℃30second，72℃30second，30个循环；72℃5min。
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与12μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果。
银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分后，在银染液(1.5克硝酸银和1500ml水)中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分，放入显影液(16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲醛)中，至显影后取出水洗后即可读数。
采用6对SSR引物对金针菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：2 (1+2) (2+3+4) 1 (1+3+5)3的菌种，即可确定该菌种为金针菇青禾菌种，如图1中箭头标注所示。为保证鉴定的准确性，建议进行三次重复实验。
Claims (1)
1.一种鉴定金针菇青禾菌种的方法，其具体步骤如下：
(1)菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，19℃～21℃下避光摇瓶培养，3d～4d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将液氮冷冻干燥的金针菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；
②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
⑤在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
⑥将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；
⑦加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
⑧加入100μL 10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
⑨加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；
(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/LdNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH2O 10.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，55℃30second，72℃30second，30个循环；72℃5min；
6对SSR引物如下：
Fv_fp0001的正/反向引物分别为：
AGAGCTGTCCATGTCTCGG/AGCGCTCGGTTTGATGAAC；
Fv_fp0002的正/反向引物分别为：
CTAGCCATGCAAAGGCGTC/CCAGCATGCGGTTTAGTCG；
Fv_fp0003的正/反向引物分别为：
CAGCTTTGAACAGGCGTCC/CTCCAAGCCAACACCTTGC；
Fv_fp0004的正/反向引物分别为：
GGCAGACGAGTGTGCTTTC/ATCAGCCTCGTTCTCCGTG；
Fv_fp0005的正/反向引物分别为：
TGGAAAGACAGGCTCTCGG/CGTACTTTCCTTGGTGCGG；
Fv_fp0006的正/反向引物分别为：
TGGAAAGGGATCGGTGCTG/GTGTTGCGCAGATGTGGAG；
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与12μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果；
银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分后，在银染液中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，沥干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数；
采用6对SSR引物对金针菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：2(1+2)(2+3+4)1(1+3+5)3的菌种，即可确定该菌种为金针菇青禾菌种。
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