CN106884045A - 一种香菇l135菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 - Google Patents

一种香菇l135菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用,该指纹图谱由8对SSR标记组成。构建方法包括:(1)菌丝培养;(2)基因组DNA的提取;(3)SSR分子标记的检测;(4)电泳检测。应用包括:对香菇菌种进行SSR标记扩增,将得到的带型与指纹图谱对照,与该指纹图谱一致即为香菇L135菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点,利用本发明构建的L135菌种SSR指纹图谱,在收集的40个历年来我国香菇主要栽培品种中具有专一性。

Description

一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于香菇菌种的检测领域,特别涉及一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。
背景技术
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2015年的766万吨,占全球香菇总产量的70%以上,改写了世界食用菌产量的排行榜,并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距,有专家预测,由于中国香菇产业的迅猛发展,在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度,优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目,中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重,这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》,这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权,同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权,为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权,必须首先建立成熟的品种鉴定技术,为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》,对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言,香菇栽培菌种“同种异名,异种同名”的现象,不仅给菇农带来了极大的损失,影响了他们的栽培积极性,也极大地影响了中国香菇的快速发展;而且,随着大规模的工厂化栽培方式的出现,对香菇栽培菌株质量的要求越来越高,需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术,以保证每批次的用种都准确无误。
面对这种局势,就需要进一步加快菌种鉴定技术的研究,在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用,该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短,准确性高,重复性好的优点。
本发明的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱,该指纹图谱由8对SSR标记组成。SSR标记是基于香菇全基因组测序后开发的简单重复序列片段(SSR)的扩增引物,经过对不同香菇品种进行PCR扩增后获得的多态性标记。SSR标记具有扩增带型好,重复性高的特点。本发明对大量的SSR引物进行了筛选,获得了8对多态性高的引物,用这8对引物组合获得的图谱带型,检测目前我国主要栽培的40个香菇品种大多都具有专一性。这8对SSR标记的详细信息如表1。
表1 SSR标记详细信息列表
本发明的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,包括:
(1)菌丝培养:将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基PDB中,23-25℃下避光摇瓶培养,3-4d后收集菌丝;
(2)基因组DNA的提取:用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA,紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度一致;
(3)SSR分子标记的检测:对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增;
(4)电泳检测:将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀,变性,点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,银染,显色,拍照,分析结果。
所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括:
(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,于65℃保温45-60min,轻摇混匀;
(2)12000rpm、4℃离心20min,取上清液;
(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入离心管中;
(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液,混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;
(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇,摇动5min,8000rpm、4℃离心10min,去上清;
(6)将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次,每次8000rpm,室温离心5min;
(7)加入预冷的95vol%乙醇,上下颠倒,8000rpm室温离心10min,弃乙醇,真空抽干或自然晾干;
(8)加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)缓冲液,使沉淀溶解;
(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。
所述步骤(3)中的PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/L MgCl2 2μL,10mmol/L dNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL,浓度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 10.4μL;
PCR反应条件:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,30个循环;72℃5min。
所述步骤(4)中的加样缓冲液用量为2μL;PCR扩增得到的产物点样量为3μL。
所述步骤(4)中的变性的具体工艺为:于95℃变性5min,结束后置于冰水混合物中冷却3min。
所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为:变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%,电泳缓冲液为1×TBE,电压1000v,电流200mA,功率200W,电泳45min。
所述步骤(4)中的银染的具体工艺为:电泳完成后卸下并拆开玻璃板,胶板卸下后,用去离子水水洗5-8s,沥干水分后,在银染液中避光银染8min,银染后,用去离子水水洗5-8s,沥干水分,放入显影液中,至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化,在高通量试验中较为高效实用。
所述银染液的组成为1.5g AgNO3和1500ml H2O;显影液的组成为16g NaOH、1000mlH2O和8ml甲醛。
本发明的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的应用,是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的8对SSR引物,对扩增L135菌株的总DNA进行PCR扩增,L135菌种的扩增条带在收集的40份我国香菇主要栽培品种中具有专一性。表2为本发明使用的8对SSR引物在40份香菇品种中扩增出的所有等位片段的数量及编号(按照扩增片段从大到小编号,通过对照50bp ladder DNA marker确定各SSR引物扩增的各等位片段的相对分子量)。菌种L135使用这8对SSR引物的扩增片段在总等位片段中的编号组合为:(1)(2+4)(3)(1+4)(2+3+4)(1+4)(1)(2),表3为菌种L135扩增片段组合的位置与大小。符合上述等位片段组合的菌种,即是香菇L135菌种。
表2 SSR引物扩增的所有等位片段信息汇总表
表3菌种L135扩增的等位片段编号表
有益效果
本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短,准确性高,重复性好的优点。检测所需时间只需要3-4d,而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间,出菇试验则需要至少3个月的时间;该方法在所收集的我国40个香菇主栽菌种中具有L135菌种的专一性,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱,其中M是50bp DNA ladder,数字代表的是所用的8对SSR引物,箭头所指的是香菇L135菌种的稳定且特异的SSR等位片段组合。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)菌丝培养:将香菇菌种转接到装有100ml马铃薯葡萄糖培养基PDB的三角瓶中,23-25℃下避光摇瓶培养,3-5d后收集菌丝;
(2)基因组DNA的提取:用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA,紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度一致;
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括:
a将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,于65℃保温45-60min,间或轻摇混匀;
b12000rpm、4℃离心20min,取上清液;
c在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入离心管中;
d在上述离心管中加入体积比为2∶1的氯仿和异戊醇混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;
e在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇动5min,8000rpm、4℃离心10min,去上清;
f将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次,每次8000rpm,室温离心5min;
g加入预冷的95vol%乙醇,轻轻上下颠倒,8000rpm室温离心10min,弃乙醇,真空抽干或自然晾干;
h加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)缓冲液,轻轻敲打使沉淀溶解;
i加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
j将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用;
(3)SSR分子标记的检测:对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增;
PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/L MgCl2 2μL,10mmol/L dNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL,浓度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 10.4μL;
PCR反应条件:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,30个循环;72℃5min。
(4)电泳检测:将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀,于95℃变性5min,结束后置于冰水混合物中冷却3min,点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%,电泳缓冲液为1×TBE,电压1000v,电流200mA,功率200W,电泳45min,银染,显色,拍照,分析结果。
银染的具体工艺为:电泳完成后卸下并拆开玻璃板,胶板卸下后,用去离子水水洗5-8s,沥干水分后,在银染液(1.5g AgNO3和1500ml H2O)中避光银染8min,银染后,用去离子水水洗5-8s,沥干水分,放入显影液(16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛)中,至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化,在高通量试验中较为高效实用。
采用8对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增,通过对照50bp ladder DNA marker可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量,找到带型符合编号组合为:(1)(2+4)(3)(1+4)(2+3+4)(1+4)(1)(2)的菌种,即可确定该菌种为香菇L135菌种,如图1中箭头标注所示。为保证鉴定的准确性,需进行三次重复实验。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用
<130> 1
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccaaaaagg atttcagcaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaccggagtg gtgtaagtgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagcaggtca gagcaggttc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
accgagagca gagtcgagag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctctttgcac cctcaacctc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagcagtctc ctcttggctc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ataggatgat tgaacgagca g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
accgtaaggt gggaagaaa 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgccgttcc aaagatac 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tctgtaacgc ttgtggacta 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cattgctcgg atccttcatt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cattgctcgg atccttcatt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggcgaaaca atttcaggta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgccatcgt aaggaactcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acgcgtatcc tcccctaagt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aagcgatatg gatttgacgc 20

Claims (10)

1.一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱,其特征在于:该指纹图谱由8对SSR标记组成,具体序列如下:
1140正向引物:CCCAAAAAGGATTTCAGCAA;
反向引物:AACCGGAGTGGTGTAAGTGC;
76正向引物:AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC;
反向引物:ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG;
43正向引物:CTCTTTGCACCCTCAACCTC;
反向引物:CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC;
16正向引物:ATAGGATGATTGAACGAGCAG;
反向引物:ACCGTAAGGTGGGAAGAAA;
19正向引物:ATGCCGTTCCAAAGATAC;
反向引物:TCTGTAACGCTTGTGGACTA;
148-1正向引物:CATTGCTCGGATCCTTCATT;
反向引物:CATTGCTCGGATCCTTCATT;
002正向引物:GGGCGAAACAATTTCAGGTA;
反向引物:ATGCCATCGTAAGGAACTCG;
192-1正向引物:ACGCGTATCCTCCCCTAAGT;
反向引物:AAGCGATATGGATTTGACGC;
所述菌种的带型编号组合为:(1) (2+4) (3) (1+4) (2+3+4) (1+4) (1) (2)。
2.一种如权利要求1所述的香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,包括:
(1)将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中,23-25℃下避光摇瓶培养,3-4d后收集菌丝;
(2)用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA,检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度一致;
(3)对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增;
(4)将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀,变性,点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,银染,显色,拍照,分析结果。
3.根据权利要求2所述的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括:
(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,于65℃保温45-60min,轻摇混匀;
(2)12000rpm、4℃离心20min,取上清液;
(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入离心管中;
(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液,混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;
(5)在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,摇动5min,8000rpm、4℃离心10min,去上清;
(6)将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次,每次8000rpm,室温离心5min;
(7)加入预冷的95vol%乙醇,上下颠倒,8000rpm室温离心10min,弃乙醇,真空抽干或自然晾干;
(8)加入100μL 1×TE缓冲液,使沉淀溶解;
(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。
4.根据权利要求2所述的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(3)中的PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/LMgCl22μL,10mmol/L dNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL,浓度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 10.4μL;
PCR反应条件:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,30个循环;72℃5min。
5.根据权利要求2所述的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(4)中的加样缓冲液用量为2μL;PCR扩增得到的产物点样量为3μL。
6.根据权利要求2所述的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(4)中的变性的具体工艺为于95℃变性5min,结束后置于冰水混合物中冷却3min。
7.根据权利要求2所述的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为:变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%,电泳缓冲液为1×TBE,电压1000v,电流200mA,功率200W,电泳45min。
8.根据权利要求2所述的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(4)中的银染的具体工艺为:电泳完成后卸下并拆开玻璃板,胶板卸下后,用去离子水水洗5-8s,沥干水分后,在银染液中避光银染8min,银染后,用去离子水水洗5-8s,沥干水分,放入显影液中,至显影后取出水洗后即可读数。
9.根据权利要求8所述的一种香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述银染液的组成为1.5g AgNO3和1500ml H2O;显影液的组成为16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛。
10.一种如权利要求1所述的香菇L135菌种的SSR标记指纹图谱的应用,其特征在于:应用于鉴定香菇L135菌种相对于其他香菇栽培品种的特异性。
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