CN112575111A - 一种香菇L26菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法 - Google Patents

一种香菇L26菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法,该指纹图谱由7对基于香菇全基因组测序后开发的InDel标记组成。本发明的香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱可用于香菇L26菌种的特异性鉴定,具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点,在收集的44个香菇菌种中具有香菇L26菌种的专一性。

Description

一种香菇L26菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
技术领域
本发明属于香菇菌种的检测领域,具体涉及一种香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法。
背景技术
香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)因具有较高的营养价值和药用价值,而备受消费者欢迎。中国是世界上最早进行香菇人工栽培的国家,栽培历史已有800多年,目前香菇是国内栽培最广、产量最高的菇种。据中国食用菌协会统计,2018年中国食用菌总产量为3842.04万吨,其中香菇总产量为1043.12万吨,占国内食用菌总产量的27.12%,占世界香菇总产量的90%以上。近年来香菇产业成为国内精准扶贫的重要抓手,据统计全国超过20%以上的国家级贫困县选择香菇作为重要产业,我国香菇栽培规模进一步扩大,但随着我国香菇产业的快速发展,香菇生产用种“同种异名,异种同名”的问题日益突出,这不仅损害了香菇育种者的知识产权更为生产者造成了极大地风险,为香菇产业进一步发展造成了隐患。为保障育种者的权益和降低生产者的风险,促进我国香菇产业健康、稳定和可持续发展,建立一种简便、快速、可靠的香菇菌种特异性鉴定技术迫在眉睫。
随着生物信息学的快速发展,DNA测序技术的不断成熟,测序的通量在不断增加而成本在降低。DNA分子标记技术能够从基因水平上检测香菇菌种的遗传特异性,香菇全基因组测序的完成为InDel标记的开发提供了便利。InDel分子标记是一种基于高通量测序技术的应用,降低了InDel标记开发的成本,适用于香菇全基因组测序分子标记的开发。且InDel标记具有数量丰富、准确性高、稳定性好、快捷简便等优点,不仅用于分子标记辅助育种,而且也可用于香菇菌株鉴定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法与应用,该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短,准确性高,重复性好的优点。
本发明的一种香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱,该指纹图谱由7对InDel标记组成,是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的InDel标记引物,扩增带型好,重复性高,标记详细信息如表1。
表1 InDel标记引物信息列表
Figure BDA0002861789370000021
本发明还提供了一种香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱的应用,是利用香菇基因组插入/缺失片段开发的7对InDel标记引物,对香菇菌种进行InDel标记扩增,将得到的带型与L26菌种的带型对照,与该带型一致即为香菇L26菌种;
其中香菇L26菌种的带型编号组合为:(1+2)(1+2)1(1+2)(1+2)1(1+2)。
通过对收集的44个香菇品种的InDel标记引物带型扩增,本发明确定了7对InDel标记引物在44个香菇品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2),通过不同InDel等位位点的编号组合可有效识别L26菌种(图2-8)。通过DNA分子量对照D2000bp DNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位位点的相对分子量,存在L26菌种特异InDel等位片段组合的菌种,即是香菇L26菌种,该菌种的编号组合为: (1+2)(1+2)1(1+2)(1+2)1(1+2)。
表2 InDel引物扩增的等位片段信息汇总表
Figure BDA0002861789370000022
Figure BDA0002861789370000031
本发明还提供了上述香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法,该方法包括如下步骤:
(1)菌丝培养:将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基PDA中,23~22℃下避光培养,10d后收集菌丝;
(2)基因组DNA的提取:用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA,紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度为20~30ng/uL;
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括:
①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中,并放入2-3颗钢珠;
②将离心管放入多样品组织研磨机中,设置频率60Hz,时间30s研磨至均匀粉末;
③加入62℃预热1h的2×CTAB抽提液,于62℃保温60min,间隔20min轻摇混匀一次;
④12000rpm、4℃离心20min,分装上清液,分装两管各800uL;
⑤在上述上清液中加入体积比为22:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入新的离心管中;
⑥在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液(记录体积)移入另一离心管中;
⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中的上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,混匀,-20℃下静置沉淀1h,之后8000rpm、4℃离心10min,弃上清;
⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70%乙醇洗涤1次,8000rpm,室温离心2min;
⑨弃乙醇,超净工作台中吹干;加入100μL 10×TE缓冲液,轻轻敲打使沉淀溶解,加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用;
InDel分子标记的检测:对上述提取的DNA进行全基因组InDel标记的PCR扩增;PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:Premix TaqTM(1.22U/22μL Taq DNA酶, 0.4mM/L dNTP,0.3mM/L PCR buffer)10μL,10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL,浓度20~30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 6μL;
PCR反应条件:94℃2min;94℃42second,22-60℃42second,72℃30second, 32个循环;72℃7min;10℃保存;
电泳检测:将上述PCR扩增得到的产物,点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上电泳,琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2%,电泳缓冲液为1×TAE,电压90v,电流300mA,功率100W,电泳2h,拍照,分析结果;
采用7对InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增,通过DNA分子量对照D2000bpDNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量,找到符合编号组合为:(1+2)(1+2)1(1+2)(1+2)1(1+2)的菌种,即可确定该菌种为香菇L26菌种。
本发明的有益效果
本发明的香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱可用于L26菌种的鉴别,与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短,准确性高,重复性好的优点。检测所需时间只需要3-4天,而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间,出菇试验则需要至少3个月的时间;该方法在所收集的我国44个香菇菌种中具有L26菌种的专一性,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为香菇L26菌种InDel标记指纹图谱,其中M是D2000bp DNA ladder,数字1-7代表的是所用的7对InDel标记引物,箭头所指的是香菇L26菌种的特异性InDel等位片段组合;
图2为引物Lefp_id001在所选44个香菇材料中的扩增图谱;
图3为引物Lefp_id002在所选44个香菇材料中的扩增图谱;
图4为引物Lefp_id003在所选44个香菇材料中的扩增图谱;
图5为引物Lefp_id004在所选44个香菇材料中的扩增图谱;
图6为引物Lefp_id002在所选44个香菇材料中的扩增图谱;
图7为引物Lefp_id006在所选44个香菇材料中的扩增图谱;
图8为引物Lefp_id007在所选44个香菇材料中的扩增图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Marker、Premix TaqTM均购自:Takala Bio宝日医生物技术有限公司
其余材料和试剂均为普通市售产品。
44个菌株来源:
1、CV108菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;2、香九菌株,来源广东省微生物研究所;3、L7402菌株,来源松阳县食药用菌研究所;4、8404菌株,来源湖北省宜昌森源食用菌有限公司;2、华香2号菌株,来源华中农业大学;6、CV442菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;7、广香菌株,来源广东省微生物研究所;8、L132 菌株,来源福建省三明真菌研究所;9、L9319菌株,来源浙江省丽水市大山菇业研究开发有限公司;10、闽丰1号菌株,来源福建省三明真菌研究所;11、森源1号菌株,来源湖北省宜昌森源食用菌有限责任公司;12、申香18号菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;13、香如菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;14、申香12 号菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;12、CV102菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;16、L241菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;17、香杂26 菌株,来源广东省微生物研究所;18、L9608菌株,河南西峡县食用菌科研中心;19、 Z3244菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;20、申香16号菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;21、华香8号菌株,来源华中农业大学;22、N7菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;23、RBL1菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;24、Z3210菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;22、沪香F2菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;26、L241-4菌株,来源浙江省庆元县食用菌科学技术研究中心;27、L26菌株,来源福建省三明真菌研究所;28、菌兴8号菌株,来源浙江省丽水市食用菌研究开发中心;29、CV201菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;30、苏香菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;31、L922菌株,来源华中农业大学;32、Z3239菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;33、Z3243菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;34、HK3161菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;32、L212菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;36、L868菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;37、TW1121菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所38、L9102菌株,来源浙江省庆元县食用菌科学技术研究中心;39、申香12号菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;40、J868菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;41、森源10号菌株,来源湖北省宜昌森源食用菌有限责任公司;42、WD4204 菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;43、WD2140菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所;44、931菌株,来源上海市农业科学院食用菌研究所。
其中7对InDel标记引物序列(2′-3′)如下:
Lefp_id001正向引物:ACGGATGGAGAGACACAGGA
反向引物:TGCCCCACTTACTCTCAACC
Lefp_id002正向引物:CCTTTCTCAAAAGCGGACTG
反向引物:GGGAGTGGGTTGTTTGGATA
Lefp_id003正向引物:CGGATGTTATGCACTGGAAG
反向引物:CGTACGGTTGGACATTTGAA
Lefp_id004正向引物:AGCCTTTCACAGTCAGCTCG
反向引物:GTCAACGGAGGGAAACAGAG
Lefp_id002正向引物:GTAGCACTCCTCATACAACC
反向引物:ACCAAATGTCACAGCACAGG
Lefp_id006正向引物:ACATTGGCGAAGGCTGTACG
反向引物:CCCTTTTGCCCTATAAGGCG
Lefp_id007正向引物:AACAGTAACCTGTGCACTGC
反向引物:CATGATCAGATCACACAGCG。
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例1
(1)菌丝培养:将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基PDA中,23~22℃下避光培养,10d后收集菌丝;
(2)基因组DNA的提取:用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA,紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度为20~30ng/uL;
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括:
①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中,并放入2-3颗钢珠;
②将离心管放入多样品组织研磨机中,设置频率60Hz,时间30s研磨至均匀粉末;
③加入62℃预热1h的2×CTAB抽提液,于62℃保温60min,间隔20min轻摇混匀一次;
④12000rpm、4℃离心20min,分装上清液,分装两管各800uL;
⑤在上述上清液中加入体积比为22:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入新的离心管中;
⑥在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液(记录体积)移入另一离心管中;
⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,混匀,-20℃下静置沉淀1h,之后8000rpm、4℃离心10min,弃上清;
⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70%乙醇洗涤1次,8000rpm,室温离心2min;
⑨弃乙醇,超净工作台中吹干。加入100μL10×TE缓冲液,轻轻敲打使沉淀溶解,加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用;
(3)InDel分子标记的检测:对上述提取的DNA进行全基因组InDel标记的PCR 扩增;
PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:Premix TaqTM(1.22U/22μL Taq DNA酶,0.4mM/L dNTP,0.3mM/L PCR buffer)10μL,10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL,浓度20~30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 6μL;
PCR反应条件:94℃2min;94℃42second,22-60℃42second,72℃30second, 32个循环;72℃7min;10℃保存;
(4)电泳检测:将上述PCR扩增得到的产物,点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上电泳,琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2%,电泳缓冲液为1×TAE,电压90v,电流300mA,功率100W,电泳2h,拍照,分析结果;
采用7对InDel标记引物分别对香菇菌株进行PCR扩增,通过DNA分子量对照 D2000bp DNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量,如图1所示,找到符合编号组合为:(1+2)(1+2)1(1+2)(1+2)1(1+2)的菌种,即可确定该菌种为香菇L26菌种,图2-8中的编号27即为L26菌种,其条带与图1的一致。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种香菇L26菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acggatggag agacacagga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgccccactt actctcaacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctttctcaa aagcggactg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggagtgggt tgtttggata 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggatgttat gcactggaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtacggttg gacatttgaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcctttcac agtcagctcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcaacggag ggaaacagag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtagcactcc tcatacaacc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accaaatgtc acagcacagg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acattggcga aggctgtacg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccttttgcc ctataaggcg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aacagtaacc tgtgcactgc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catgatcaga tcacacagcg 20

Claims (3)

1.一种香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法,包括:
(1)菌丝培养:将香菇菌丝转接到PDA平板上,22℃下避光培养,10d后收集菌丝;
(2)基因组DNA的提取:用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA,紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度为20~30ng/uL;CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括:
①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中,并放入2-3颗钢珠;
②将离心管放入多样品组织研磨机中,设置频率60Hz,时间30s研磨至均匀粉末;
③加入62℃预热1h的2×CTAB抽提液,于62℃保温60min,间隔20min轻摇混匀一次;
④12000rpm、4℃离心20min,分装上清液,分装为两管各800μL;
⑤在上述上清液中加入体积比为22:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入新的离心管中;
⑥在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;
⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,混匀,-20℃下静置沉淀1h,之后8000rpm、4℃离心10min,弃上清;
⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70%乙醇洗涤1次,8000rpm,室温离心2min;
⑨弃乙醇,超净工作台中吹干;加入100μL 10×TE缓冲液,轻轻敲打使沉淀溶解,加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用;
(3)InDel分子标记的检测:对上述提取的DNA进行开发的InDel标记的PCR扩增;
PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:Premix TaqTM(1.22U/22μL Taq DNA酶,0.4mM/LdNTP,0.3mM/L PCR buffer)10uL,10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL,浓度20~30ng/μL提取的模板DNA 2μL、ddH2O 6μL;
PCR反应条件:94℃2min;94℃42second,22-60℃42second,72℃30second,32个循环;72℃7min;10℃保存;
(4)电泳检测:将上述PCR扩增得到的产物点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳,琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2%,电泳缓冲液为1×TAE,电压90v,电流300mA,功率100W,电泳2h,拍照,分析结果;
选用7对InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增,通过对照DNA分子量对照D2000bpDNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量,找到符合编号组合为:(1+2)(1+2)1(1+2)(1+2)1(1+2)的菌种,即可确定该菌种为香菇L26菌种;
其中7对InDel标记引物序列(2′-3′)如下:
Lefp_id001正向引物:ACGGATGGAGAGACACAGGA
反向引物:TGCCCCACTTACTCTCAACC
Lefp_id002正向引物:CCTTTCTCAAAAGCGGACTG
反向引物:GGGAGTGGGTTGTTTGGATA
Lefp_id003正向引物:CGGATGTTATGCACTGGAAG
反向引物:CGTACGGTTGGACATTTGAA
Lefp_id004正向引物:AGCCTTTCACAGTCAGCTCG
反向引物:GTCAACGGAGGGAAACAGAG
Lefp_id002正向引物:GTAGCACTCCTCATACAACC
反向引物:ACCAAATGTCACAGCACAGG
Lefp_id006正向引物:ACATTGGCGAAGGCTGTACG
反向引物:CCCTTTTGCCCTATAAGGCG
Lefp_id007正向引物:AACAGTAACCTGTGCACTGC
反向引物:CATGATCAGATCACACAGCG。
2.一种香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱,其特征在于该指纹图谱由7对InDel标记组成,是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的InDel标记引物,7对InDel标记引物序列(2′-3′)如下:
Lefp_id001正向引物:ACGGATGGAGAGACACAGGA
反向引物:TGCCCCACTTACTCTCAACC
Lefp_id002正向引物:CCTTTCTCAAAAGCGGACTG
反向引物:GGGAGTGGGTTGTTTGGATA
Lefp_id003正向引物:CGGATGTTATGCACTGGAAG
反向引物:CGTACGGTTGGACATTTGAA
Lefp_id004正向引物:AGCCTTTCACAGTCAGCTCG
反向引物:GTCAACGGAGGGAAACAGAG
Lefp_id002正向引物:GTAGCACTCCTCATACAACC
反向引物:ACCAAATGTCACAGCACAGG
Lefp_id006正向引物:ACATTGGCGAAGGCTGTACG
反向引物:CCCTTTTGCCCTATAAGGCG
Lefp_id007正向引物:AACAGTAACCTGTGCACTGC
反向引物:CATGATCAGATCACACAGCG。
3.权利要求2所述香菇L26菌种的InDel标记指纹图谱的应用,是利用香菇基因组插入/缺失片段开发的7对InDel标记引物,对香菇菌种进行InDel标记扩增,将得到的带型与L26菌种的带型对照,与该带型一致即为香菇L26菌种;其中香菇L26菌种的带型编号组合为:(1+2)(1+2)1(1+2)(1+2)1(1+2)。
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沈秀芬等: "InDel 标记及其在食用菌研究中的应用与展望", 《上海农业学报》 *

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