CN112695116A - 一种香菇闽丰1号菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法，该指纹图谱由7对基于香菇全基因组测序后开发的InDel标记组成。本发明的香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱可用于香菇闽丰1号菌种的特异性鉴定，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的44个香菇菌种中具有香菇闽丰1号菌种的专一性。

Description

一种香菇闽丰1号菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法

技术领域

本发明属于香菇菌种的检测领域，具体涉及一种香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法。

背景技术

香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)因具有较高的营养价值和药用价值，而备受消 费者欢迎。中国是世界上最早进行香菇人工栽培的国家，栽培历史已有800多年，目前 香菇是国内栽培最广、产量最高的菇种。据中国食用菌协会统计，2018年中国食用菌总产量为3842.04万吨，其中香菇总产量为1043.12万吨，占国内食用菌总产量的27.15％， 占世界香菇总产量的90％以上。我国香菇栽培规模进一步扩大，但随着我国香菇产业的 快速发展，香菇生产用种“同种异名，异种同名”的问题日益突出，这不仅损害了香菇育 种者的知识产权更为生产者造成了极大地风险，为香菇产业进一步发展造成了隐患。为 保障育种者的权益和降低生产者的风险，促进我国香菇产业健康、稳定和可持续发展， 建立一种简便、快速、可靠的香菇菌种特异性鉴定技术迫在眉睫。

随着生物信息学的快速发展，DNA测序技术的不断成熟，测序的通量在不断增加而成本在降低。DNA分子标记技术能够从基因水平上检测香菇菌种的遗传特异性，香菇 全基因组测序的完成为InDel标记的开发提供了便利。InDel分子标记是一种基于高通 量测序技术的应用，降低了InDel标记开发的成本，适用于香菇全基因组测序分子标记 的开发。且InDel标记具有数量丰富、准确性高、稳定性好、快捷简便等优点，不仅用 于分子标记辅助育种，而且也可用于香菇菌株鉴定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱及 其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。

本发明的一种香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱，该指纹图谱由7对InDel标记组成，是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的InDel标记引物，扩增带型好，重复 性高，标记详细信息如表1。

表1 InDel标记引物信息列表

本发明还提供了一种香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组插入/缺失片段开发的7对InDel标记引物，对香菇菌种进行InDel标记扩增，将 得到的带型与闽丰1号菌种的带型对照，与该带型一致即为香菇闽丰1号菌种；

其中香菇闽丰1号菌种的带型编号组合为：1(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2) (1+2)。

通过对收集的44个香菇品种的InDel标记引物带型扩增，本发明确定了7对InDel标记引物在44个香菇品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同InDel 等位位点的编号组合可有效识别闽丰1号菌种(图2-8)。通过DNA分子量对照D2000bp DNAladder可确定各InDel标记引物扩增的等位位点的相对分子量，存在闽丰1号菌种 特异InDel等位片段组合的菌种，即是香菇闽丰1号菌种，该菌种的编号组合为：1(1+2) (1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)。

表2 InDel引物扩增的等位片段信息汇总表

本发明还提供了上述香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基PDA中，23～22℃下避光培养，10d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光 度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；

CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：

①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2-3颗钢珠；

②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；

③加入62℃预热1h的2×CTAB抽提液，于62℃保温60min，间隔20min轻摇混 匀一次；

④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装两管各800uL；

⑤在上述上清液中加入体积比为22：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；

⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液(记录体积)移入另一离心管中；

⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中的上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混 匀，-20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；

⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心2min；

⑨弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μL 10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行全基因组InDel标记的PCR扩增；

PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：Premix Taq^TM(1.22U/22μL Taq DNA酶，0.4mM/L dNTP，0.3mM/L PCR buffer)10μL，10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物 总体积各1μL，浓度20～30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 6μL；

PCR反应条件：94℃2min；94℃42second，22-60℃42second，72℃30second， 32个循环；72℃7min；10℃保存；

电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物，点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶 上电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2％，电泳缓冲液为1×TAE，电压90v，电 流300mA，功率100W，电泳2h，拍照，分析结果；

采用7对InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过DNA分子量对照D2000bpDNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编 号组合为：1(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)的菌种，即可确定该菌种 为香菇闽丰1号菌种。

本发明的有益效果

本发明的香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱可用于闽丰1号菌种的鉴别，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的 优点。检测所需时间只需要3-4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出 菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国44个香菇菌种中具有闽丰1 号菌种的专一性，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为香菇闽丰1号菌种InDel标记指纹图谱，其中M是D2000bp DNA ladder，数字1-7代表的是所用的7对InDel标记引物，箭头所指的是香菇闽丰1号菌种的特异性 InDel等位片段组合；

图2为引物Lefp_id001在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图3为引物Lefp_id002在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图4为引物Lefp_id003在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图5为引物Lefp_id004在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图6为引物Lefp_id002在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图7为引物Lefp_id006在所选44个香菇材料中的扩增图谱；

图8为引物Lefp_id007在所选44个香菇材料中的扩增图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定 的范围。

Marker、Premix Taq^TM均购自:Takala Bio宝日医生物技术有限公司

其余材料和试剂均为普通市售产品。

44个菌株来源：

1、CV108菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；2、香九菌株，来源广东省 微生物研究所；3、L7402菌株，来源松阳县食药用菌研究所；4、8404菌株，来源湖北 省宜昌森源食用菌有限公司；2、华香2号菌株，来源华中农业大学；6、CV442菌株， 来源上海市农业科学院食用菌研究所；7、广香菌株，来源广东省微生物研究所；8、L132 菌株，来源福建省三明真菌研究所；9、L9319菌株，来源浙江省丽水市大山菇业研究 开发有限公司；10、闽丰1号菌株，来源福建省三明真菌研究所；11、森源1号菌株， 来源湖北省宜昌森源食用菌有限责任公司；12、申香18号菌株，来源上海市农业科学 院食用菌研究所；13、香如菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；14、申香12 号菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；12、CV102菌株，来源上海市农业科学 院食用菌研究所；16、L241菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；17、香杂26 菌株，来源广东省微生物研究所；18、L9608菌株，河南西峡县食用菌科研中心；19、 Z3244菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；20、申香16号菌株，来源上海市 农业科学院食用菌研究所；21、华香8号菌株，来源华中农业大学；22、N7菌株，来 源上海市农业科学院食用菌研究所；23、RBL1菌株，来源上海市农业科学院食用菌研 究所；24、Z3210菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；22、沪香F2菌株，来 源上海市农业科学院食用菌研究所；26、L241-4菌株，来源浙江省庆元县食用菌科学技 术研究中心；27、L26菌株，来源福建省三明真菌研究所；28、菌兴8号菌株，来源浙 江省丽水市食用菌研究开发中心；29、CV201菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究 所；30、苏香菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；31、L922菌株，来源华中 农业大学；32、Z3239菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；33、Z3243菌株， 来源上海市农业科学院食用菌研究所；34、HK3161菌株，来源上海市农业科学院食用 菌研究所；32、L212菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；36、L868菌株，来 源上海市农业科学院食用菌研究所；37、TW1121菌株，来源上海市农业科学院食用菌 研究所38、L9102菌株，来源浙江省庆元县食用菌科学技术研究中心；39、申香12号 菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；40、J868菌株，来源上海市农业科学院食 用菌研究所；41、森源10号菌株，来源湖北省宜昌森源食用菌有限责任公司；42、WD4204 菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；43、WD2140菌株，来源上海市农业科学 院食用菌研究所；44、931菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所。

其中7对InDel标记引物序列(2′-3′)如下：

Lefp_id001正向引物：ACGGATGGAGAGACACAGGA

反向引物：TGCCCCACTTACTCTCAACC

Lefp_id002正向引物：CCTTTCTCAAAAGCGGACTG

反向引物：GGGAGTGGGTTGTTTGGATA

Lefp_id003正向引物：CGGATGTTATGCACTGGAAG

反向引物：CGTACGGTTGGACATTTGAA

Lefp_id004正向引物：AGCCTTTCACAGTCAGCTCG

反向引物：GTCAACGGAGGGAAACAGAG

Lefp_id002正向引物：GTAGCACTCCTCATACAACC

反向引物：ACCAAATGTCACAGCACAGG

Lefp_id006正向引物：ACATTGGCGAAGGCTGTACG

反向引物：CCCTTTTGCCCTATAAGGCG

Lefp_id007正向引物：AACAGTAACCTGTGCACTGC

反向引物：CATGATCAGATCACACAGCG。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例1

(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基PDA中，23～22℃下避光 培养，10d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光 度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；

CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：

①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2-3颗钢珠；

②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；

③加入62℃预热1h的2×CTAB抽提液，于62℃保温60min，间隔20min轻摇混 匀一次；

④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装两管各800uL；

⑤在上述上清液中加入体积比为22：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；

⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液(记录体积)移入另一离心管中；

⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀， -20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；

⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心2min；

⑨弃乙醇，超净工作台中吹干。加入100μL10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

(3)InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行全基因组InDel标记的PCR 扩增；

PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：Premix Taq^TM(1.22U/22μL Taq DNA酶，0.4mM/L dNTP，0.3mM/L PCR buffer)10μL，10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物总 体积各1μL，浓度20～30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 6μL；

PCR反应条件：94℃2min；94℃42second，22-60℃42second，72℃30second， 32个循环；72℃7min；10℃保存；

(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物，点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖 凝胶上电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2％，电泳缓冲液为1×TAE，电压90v， 电流300mA，功率100W，电泳2h，拍照，分析结果；

采用7对InDel标记引物分别对香菇菌株进行PCR扩增，通过DNA分子量对照D2000bp DNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，如 图1所示，找到符合编号组合为：1(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)的 菌种，即可确定该菌种为香菇闽丰1号菌种，图2-8中的编号10即为闽丰1号菌种， 其条带与图1的一致。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acggatggag agacacagga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgccccactt actctcaacc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctttctcaa aagcggactg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggagtgggt tgtttggata 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggatgttat gcactggaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtacggttg gacatttgaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcctttcac agtcagctcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcaacggag ggaaacagag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtagcactcc tcatacaacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accaaatgtc acagcacagg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acattggcga aggctgtacg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccttttgcc ctataaggcg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacagtaacc tgtgcactgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catgatcaga tcacacagcg 20

Claims (3)

1.一种香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法，包括：

(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到PDA平板上，22℃下避光培养，10d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：

①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2-3颗钢珠；

②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；

③加入62℃预热1h的2×CTAB抽提液，于62℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；

④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装为两管各800μL；

⑤在上述上清液中加入体积比为22：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；

⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；

⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；

⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心2min；

⑨弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μL 10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

(3)InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行开发的InDel标记的PCR扩增；

PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：Premix Taq^TM(1.22U/22μL Taq DNA酶，0.4mM/LdNTP，0.3mM/L PCR buffer)10uL，10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL，浓度20～30ng/μL提取的模板DNA 2μL、ddH₂O 6μL；

PCR反应条件：94℃2min；94℃42second，22-60℃42second，72℃30second，32个循环；72℃7min；10℃保存；

(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2％，电泳缓冲液为1×TAE，电压90v，电流300mA，功率100W，电泳2h，拍照，分析结果；

选用7对InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照DNA分子量对照D2000 bpDNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：1(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇闽丰1号菌种；

其中7对InDel标记引物序列(2′-3′)如下：

Lefp_id001正向引物：ACGGATGGAGAGACACAGGA

反向引物：TGCCCCACTTACTCTCAACC

Lefp_id002正向引物：CCTTTCTCAAAAGCGGACTG

反向引物：GGGAGTGGGTTGTTTGGATA

Lefp_id003正向引物：CGGATGTTATGCACTGGAAG

反向引物：CGTACGGTTGGACATTTGAA

Lefp_id004正向引物：AGCCTTTCACAGTCAGCTCG

反向引物：GTCAACGGAGGGAAACAGAG

Lefp_id002正向引物：GTAGCACTCCTCATACAACC

反向引物：ACCAAATGTCACAGCACAGG

Lefp_id006正向引物：ACATTGGCGAAGGCTGTACG

反向引物：CCCTTTTGCCCTATAAGGCG

Lefp_id007正向引物：AACAGTAACCTGTGCACTGC

反向引物：CATGATCAGATCACACAGCG。

2.一种香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱，其特征在于该指纹图谱由7对InDel标记组成，是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的InDel标记引物，7对InDel标记引物序列(2′-3′)如下：

Lefp_id001正向引物：ACGGATGGAGAGACACAGGA

反向引物：TGCCCCACTTACTCTCAACC

Lefp_id002正向引物：CCTTTCTCAAAAGCGGACTG

反向引物：GGGAGTGGGTTGTTTGGATA

Lefp_id003正向引物：CGGATGTTATGCACTGGAAG

反向引物：CGTACGGTTGGACATTTGAA

Lefp_id004正向引物：AGCCTTTCACAGTCAGCTCG

反向引物：GTCAACGGAGGGAAACAGAG

Lefp_id002正向引物：GTAGCACTCCTCATACAACC

反向引物：ACCAAATGTCACAGCACAGG

Lefp_id006正向引物：ACATTGGCGAAGGCTGTACG

反向引物：CCCTTTTGCCCTATAAGGCG

Lefp_id007正向引物：AACAGTAACCTGTGCACTGC

反向引物：CATGATCAGATCACACAGCG。

3.权利要求2所述香菇闽丰1号菌种的InDel标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组插入/缺失片段开发的7对InDel标记引物，对香菇菌种进行InDel标记扩增，将得到的带型与闽丰1号菌种的带型对照，与该带型一致即为香菇闽丰1号菌种；其中香菇闽丰1号菌种的带型编号组合为：1(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)(1+2)。

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