CN101086015A - 一种香菇45菌种的分子特异标记及其获得方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种香菇45菌种的分子特异标记及其获得方法和应用。本发明的香菇45菌种的分子标记DNA片断大小为604bp,特异性PCR扩增引物对序列为5′GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3′和5′CTTCCCGTCGTACACTCG 3′。方法包括:菌丝培养和基因组DNA的提取;香菇菌株45的特异DNA片断的获得;特异PCR扩增引物的获得;SCAR-PCR扩增;电泳检测。本发明的分子特异标记应用于香菇45菌种的快速鉴定和检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种香菇45菌种的分子特异标记及其获得方法与应用。
背景技术
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨,占全球香菇总产量的70%以上,改写了世界食用菌产量的排行榜,并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距,有专家预测,由于中国香菇产业的迅猛发展,在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度,优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目,中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重,这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》,这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权,同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权,为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权,必须首先建立成熟的品种鉴定技术,为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》,对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言,香菇栽培菌种“同种异名,异种同名”的现象,不仅给菇农带来了极大的损失,影响了他们的栽培积极性,也极大地影响了中国香菇的快速发展;而且,随着大规模的工厂化栽培方式的出现,对香菇栽培菌株质量的要求越来越高,需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术,以保证每批次的用种都准确无误。
随着分子生物学技术的快速发展,特别是分子标记和基因标记技术的建立与成熟,为发展简便、快速、准确的菌株鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记,在应用上具有迅速、简便、低成本的特点,本发明建立了香菇45菌种的SCAR分子标记,能对香菇45菌种进行快速鉴定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了能对香菇45菌种进行简便、快速、准确的鉴定和检测,提供了一种香菇45菌种的分子特异标记,同时提供了这种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法。
本发明提供的一种香菇45菌种的分子特异标记为604bp大小的特异片段,其特异性PCR扩增引物对序列为:5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
本发明的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法,包括下列步骤:
(1)菌丝培养和基因组DNA的提取:
将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上,25℃培养活化。两周后接到100mL PD液体培养基中,25℃100r/min振荡培养两周,收集菌丝,用改进的CTAB法提取基因组DNA香菇。
(2)菌株45的特异DNA片断的获得:
采用PCR技术,经过大量的筛选试验,在采用随机引物(引物序列:TGCGCCCTTC获得了香菇菌株45的特异DNA片断,分子量为613bp,将该片段克隆测序。
(3)特异PCR扩增引物的获得:
以得到的DNA序列为基础,设计特异PCR扩增引物,引物对的序列5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
(4)用特异PCR扩增引物对对45菌株进行SCAR-PCR扩增。
扩增体系总体积为:25μL,10×PCR buffer 2.5μL,25mmol/L MgCL22μL,10mmol/LdNTP 0.25L,2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL,10μmol/L 45菌株检测专用引物对各1μL,模板DNA 1μL(浓度1ng~10ng/μL),ddH2O 18.6μL。PCR反应条件:94℃ 1min;94℃15second,61℃15second,72℃1min,30个循环;72℃5min。
(5)电泳检测可见604bp大小的特异片段(图1)。而其它香菇菌种均未见特异性片断。
对114(为生产用种)个收集自全国各地的香菇生产用菌种及少数野生种共164个菌株进行SCAR扩增。164个菌种中只有45菌株扩增出分子量为604bp的专一扩增条带。
根据采用这一对特殊引物进行PCR扩增,以能否产生604bpDNA片段作为对香菇45菌株进行鉴定和检测的依据。
该检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比,具有检测时间短,准确性高的优点。该检测所需时间只需要2-3天,而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间,出菇试验则需要至少3个月的时间。
附图说明
图1 SCAR-PCR扩增电泳图
17为45菌株(日本),箭头所示为香菇45菌株扩增出分子量约为604bp的特殊DNA条带,其余编号为其它香菇菌株。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
菌丝培养和基因组DNA的提取
将低温保藏的香菇45菌种转接到PDA斜面上,25℃培养活化。两周后接到100mL PD液体培养基中,25℃100r/min振荡培养两周,收集菌丝,放入-20℃冰箱冻存。用改进的CTAB法提取基因组DNA,DNA稀释至20ng/μ L,-20℃冰箱贮藏备用。
SCAR-PCR扩增
扩增体系总体积为:25μL,10×PCR buffer 2.5μL,25mmol/L MgCL2 2μL,10mmol/LdNTP 0.25L,2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL,10μmol/L 45菌株检测专用引物对(5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’)各1μL,模板DNA1μL(浓度1ng~10ng/μL),ddH2O 18.6μL。
PCR反应条件:94℃ 1min;94℃15second,61℃15second,72℃1min,30个循环;72℃5min。
为了排除其它菌种的假阴性情况,在SCAR-PCR反应体系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物对(ITS1、ITS4),验证所有模板DNA的完整性。
电泳检测
取上述PCR扩增产物8μL,与1μL加样缓冲液混匀,点样于1.5%的琼醋糖凝胶上,于0.5 X TBE缓冲液中,5V/cm电压下电泳,电泳结束后,用EB染色,然后在凝胶成像仪上照相。
Claims (10)
1.一种香菇45菌种的分子特异标记,其特征在于:特异性PCR扩增引物对序列为5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’;DNA片断大小为604bp。
2.一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)菌丝培养和基因组DNA的提取;
(2)香菇菌株45的特异DNA片断的获得;
(3)特异PCR扩增引物的获得;
(4)用特异PCR扩增引物对对45菌株进行SCAR-PCR扩增;
(5)电泳检测。
3.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于:所述步骤(2)中香菇菌株45的特异DNA片断是通过采用PCR技术,经过大量的筛选试验,在采用随机引物获得,分子量为613bp,将该片段克隆测序。
4.如权利要求3所述的一种香菇45菌种的分子标记的获得方法,其特征在于:所用随机引物序列为:TGCGCCCTTC。
5.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于:所述步骤(3)中特异PCR扩增引物通过下列方法获得:以得到的DNA序列为基础,设计特异PCR扩增引物,引物对的序列如下:5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
6.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于:所述步骤(1)中菌丝培养和基因组DNA的提取包括下列步骤:将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上,25℃培养活化,两周后接到100mL PD液体培养基中,25℃100r/min振荡培养两周,收集菌丝,放入-20℃冰箱冻存;用改进的CTAB法提取基因组DNA,DNA稀释至20ng/μL,-20℃冰箱贮藏备用。
7.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于:所述步骤(4)中的SCAR-PCR扩增:扩增体系总体积为:25μL,扩增体系:10×PCR buffer2.5μL,25mmol/L MgCL2 2μL,10mmol/L dNTP 0.25L,2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL,10μmol/L 45菌株检测专用引物对各1μL,模板DNA 1μL(浓度1ng~10ng/μL),ddH2O18.6μL,PCR反应条件:94℃ 1min;94℃ 15second,61℃ 15second,72℃ 1min,30个循环;72℃ 5min。
8.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于:所述步骤(4)中SCAR分子标记的PCR扩增反应体系中加入ITS(Internal Transcribed Spacer),通用引物对(ITS1、ITS4)。
9.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法,其特征在于:所述步骤(5)电泳检测为:取步骤(4)PCR扩增产物8μL,与1μL加样缓冲液混匀,点样于1.5%的琼醋糖凝胶上,于0.5XTBE缓冲液中,5V/cm电压下电泳,电泳结束后,用EB染色,然后在凝胶成像仪上照相。
10.一种香菇45菌种的分子特异标记在香菇45菌种的快速鉴定和检测中的应用。
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