CN104673787B - 斑玉蕈菌株sief2632的分子标记、检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斑玉蕈SIEF2632菌株的分子标记、检测方法与应用，所述斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记，其特征在于，该分子标记是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR扩增的专用引物是SIEF2632F/R，其中：SIEF2632F是：5'AACACTGAATCATCCTCCTC 3'；SIEF2632R是：5'AGTCGCCATGATGCTTTT 3'。本发明具有检测时间短，准确性高的优点。该方法在所收集的我国20个斑玉蕈菌种中具有菌株SIEF2632的专一性。
Description
技术领域
本发明属于斑玉蕈菌种的检测领域，特别是涉及一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记、其检测方法与应用。
背景技术
我国从20世纪80年代起对斑玉蕈开展生物学特性和栽培条件研究，目前已经在多个省、市推广栽培。斑玉蕈味道鲜美，是一种珍稀食用菌品种，在国内外都受到食用菌生产行业的重视，其在日本、韩国和国内上海等地已经实现了工厂化生产模式，且效益良好。近十年来，斑玉蕈的市场需求日益增多，中国斑玉蕈以惊人的发展速度，优良的品质和丰富的食用及药用价值为世界菇业人士瞩目。
优质菌种在斑玉蕈单产和质量中的贡献率举足轻重，因此斑玉蕈菌种在其产业中占有非常重要的地位。在我国，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对斑玉蕈菌种质量的要求越来越高。因此，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。这就需要我们进一步对菌种鉴定技术进行研究，在斑玉蕈的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
DNA分子标记技术在食用菌菌种和菌株鉴定的研究中发挥了巨大的作用，不仅极大地提升了食用菌的基础和应用研究，同时也为这一领域研究的深入和拓展展现了光明的前景。使用DNA分子标记技术对菌株进行检测，与传统的形态学检测、拮抗试验、结实性实验等相比，具有操作简便、成本低、检测时间短、准确性高等优越性。
斑玉蕈菌株SIEF2632在RAPD、SSR等遗传图谱分析显示，与其它斑玉蕈菌株亲缘关系较远。与其他常规斑玉蕈栽培菌株相比，其具有原基形成晚（其他菌株搔菌后10天左右出现原基，而SIEF2632到第16天才出现原基），畸形率高（极易形成瘤盖菇）等明显的缺点，因此，斑玉蕈SIEF2632菌株的相关农艺性状不适宜作为生产用栽培菌种。而在菌丝生长阶段与其他菌株并无明显外部形态差异，为此，需要采用一种快速、准确的方法对斑玉蕈菌株SIEF2632进行鉴定，以避免将其误当作为生产用栽培菌种而带来不必要的损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记、其检测方法与应用。
本发明通过采用PCR技术，经过筛选试验，获得斑玉蕈菌株SIEF2632的特异DNA片段，以此片段的DNA序列为基础，设计特异性PCR扩增引物，通过对斑玉蕈菌种SIEF2632的特异片段的检测从而对斑玉蕈菌株SIEF2632进行鉴定和检测。
本发明的一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记，是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR扩增的专用引物是SIEF2632F/R，其中：
SIEF2632F是：5' AACACTGAATCATCCTCCTC 3'；
SIEF2632R是：5' AGTCGCCATGATGCTTTT 3'；
PCR产物大小为397bp。
扩增出的SCAR片段序列如下：
AACACTGAATCATCCTCCTCATGAAAACGTGTAGCTGAAAATGGTAAAGGCTCACACAATAAGGTTGCCATGGTAGTCTCATTGGCAAAACCCAAGTTGTTCTGACTGCAGAGTGGAATGTGGAATGGATCCATCGCAAGTGCTTGTTTCCTCTCCCTGCCAGCGGAGTTCAAAAATACCGACCTCTCGACAAGGACCACGCGTCGGGAAGTAGACTAGATAAGACCCACTACTAAAGTAGCGGGAATTTCTCAAATCGAAACCTGCGTTATGTCGTACCTGTCGCGTGCAAACCTGAAGGAAAGGGAAGCTATGTTTTCTGAGGGACCAGAGCTATACACGGGAGATATCCAAGCCGCTCTGTCCAGCGAATTTAGAAAAAAGCATCATGGCGACT
所述斑玉蕈菌株SIEF2632，为申请人培育的新品种，分类命名为真姬菇（Hypsizygus msrmoreus)；
其菌株在中国微生物保藏菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC8360，保藏日期为2013年10月23日。
本发明所述的斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记的检测方法，包括下列步骤：
（1）菌丝的培养或子实体的采集：
将斑玉蕈菌种转接到PDA平板上，25℃避光培养，15d~20d后收集菌丝，或直接采集斑玉蕈子实体，于-20℃保存；
（2）基因组DNA的提取
使用如下的CTAB法提取菌丝的基因组DNA：
1）将-20℃冷冻干燥的斑玉蕈菌丝或子实体研磨成粉末，加入 65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀；
2）12000rpm,4℃离心20min，取上清液；
3）加入等体积的酚：氯仿（1：1，体积比），混匀10min，12000rpm,4 ℃离心10min，取上清液移入离心管中；
4）加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1，体积比），轻轻混匀10min，12000rpm, 4℃离心 10min，取上清液移入心管中；
5）加入等体积预冷的异丙醇、1/10体积的3mol/L醋酸钠，-20℃放置20min，12000rpm，4℃离心10min，去上清；
6）沉淀用75%乙醇洗涤2～3次，每次8000rpm,室温离心5min，弃上清；
7）将沉淀真空抽干或自然晾干；加入100μL TE buffer或双蒸水，使沉淀溶解；
8）加入1μL 10mg/mL RNaseA 37℃水浴，1hr，去除RNA，获得DNA提取物，于-20℃冰箱贮藏备用；
（3）将提取的DNA进行基因SCAR的PCR扩增：
扩增体系（总体积为25uL）：10×PCR buffer 2.5uL，25mmol/LMgCL21.75uL，10mmol/LdNTPs 0.25uL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25uL，10umol/L SIEF2632F/R引物各0.5uL，25ng/μL模板DNA0.5uL，ddH2O18.75uL。
PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7 min，获得扩增产物；
（4）电泳检测
取上述PCR扩增产物3uL， 与0.6uL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，在0.5×TAE的缓冲液中、120V的电压下电泳40 min。电泳结束后，使用EB（溴化乙锭）染色，在凝胶成像仪上照相，分析结果。
本发明还涉及一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记的应用，是将斑玉蕈菌种进行基因SCAR扩增，存在SCAR标记的，即为斑玉蕈菌株SIEF2632。
本发明的有益效果：
该检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇实验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。该检测所需时间只需要1天，而常规的拮抗实验、出菇试验则需要数周乃至几个月的时间。该方法在所收集的我国20个斑玉蕈菌种中具有菌株SIEF2632的专一性。
附图说明
图1是斑玉蕈菌株SIEF2632的SCAR扩增图谱，其中M是D2000 DNA Marker。5是斑玉蕈菌株SIEF2632，箭头所指是斑玉蕈菌株SIEF2632的特异性标记。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。此实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在阅读了本发明讲授的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1） 菌丝培养
将4℃保藏的斑玉蕈菌种转接到PDA平板上，25℃避光培养，15d~20d后收集菌丝，放入-20℃冰箱备用。
（2） 基因组DNA的提取
使用改进的CTAB法提取菌丝的基因组DNA，使用Nano Drop检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA浓度一致，冷藏备用。
（3） SCAR分子标记的检测
将提取的DNA进行基因SCAR的PCR扩增，扩增体系（总体积为25uL）：10×PCRbuffer 2.5uL，25mmol/LMgCL21.75uL，10mmol/LdNTPs 0.25uL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25uL，10umol/L SIEF2632F/R引物各0.5uL，25ng/μL模板DNA0.5uL，ddH2O18.75uL。
PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7 min。
（4） 电泳检测
取上述PCR扩增产物3uL， 与0.6uL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，在0.5×TAE的缓冲液中、120V的电压下电泳40 min。电泳结束后，使用EB（溴化乙锭）染色，在凝胶成像仪上照相。
采用专用斑玉蕈菌种SIEF2632引物对斑玉蕈菌株进行PCR扩增，斑玉蕈菌种SIEF2632能扩增出分子量为397bp的特殊DNA条带，如图1中箭头标注所示。
Claims (4)
1.一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记，其特征在于，该分子标记是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR扩增的专用引物是SIEF2632F/R，其中：
SIEF2632F是：5' AACACTGAATCATCCTCCTC 3'；
SIEF2632R是：5' AGTCGCCATGATGCTTTT 3';
PCR产物大小为397bp，扩增出的SCAR片段序列如下：
AACACTGAATCATCCTCCTCATGAAAACGTGTAGCTGAAAATGGTAAAGGCTCACACAATAAGGTTGCCATGGTAGTCTCATTGGCAAAACCCAAGTTGTTCTGACTGCAGAGTGGAATGTGGAATGGATCCATCGCAAGTGCTTGTTTCCTCTCCCTGCCAGCGGAGTTCAAAAATACCGACCTCTCGACAAGGACCACGCGTCGGGAAGTAGACTAGATAAGACCCACTACTAAAGTAGCGGGAATTTCTCAAATCGAAACCTGCGTTATGTCGTACCTGTCGCGTGCAAACCTGAAGGAAAGGGAAGCTATGTTTTCTGAGGGACCAGAGCTATACACGGGAGATATCCAAGCCGCTCTGTCCAGCGAATTTAGAAAAAAGCATCATGGCGACT。
2.权利要求1所述的一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）培养斑玉蕈菌种，收集菌丝，或直接采集斑玉蕈子实体，于-20℃保存；培养斑玉蕈菌种时，将所述斑玉蕈菌种转接到PDA平板上，25℃避光培养，15d~20d ; （2）提取菌丝的基因组DNA；（3）将提取的DNA利用权利要求1中所述的SIEF2632F/R引物对进行基因SCAR的PCR扩增，获得扩增产物，将提取的DNA进行基因SCAR的PCR扩增的方法如下：扩增体系的总体积为25μL：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/LMgCL21.75μL，10mmol/LdNTPs 0.25μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10μmol/L SIEF2632F/R引物各0.5μL，25ng/μL模板DNA0.5μL，ddH2O18.75μL，PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7 min；（4）电泳检测，取上述PCR扩增产物电泳，在凝胶成像仪上照相，分析结果，电泳检测方法如下：取所述PCR扩增产物3μL，与0.6μL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，在0.5×TAE的缓冲液中、120V的电压下电泳40 min，电泳结束后，使用EB（溴化乙锭）染色，在凝胶成像仪上照相，分析结果。
3.根据权利要求2所 述的方法，其特征在于，步骤（2）中，使用如下的CTAB法提取菌丝的基因组DNA：1）将-20℃冷冻干燥的斑玉蕈菌丝或子实体研磨成粉末，加入 65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀； 2）12000rpm,4℃离心20min，取上清液；3）加入等体积的酚：氯仿，体积比为1：1，混匀10min，12000rpm,4 ℃离心10min，取上清液移入离心管中；4）加入等体积的氯仿：异戊醇，体积比为24：1，轻轻混匀10min，12000rpm,4℃离心 10min，取上清液移入心管中；5）加入等体积预冷的异丙醇、1/10体积的3mol/L醋酸钠，-20℃放置20min，12000rpm，4℃离心10min，去上清； 6）沉淀用75%乙醇洗涤2～3次，每次8000rpm,室温离心5min，弃上清；7）将沉淀真空抽干或自然晾干；加入100μL TEbuffer或双蒸水，使沉淀溶解； 8）加入1μL 10mg/mL RNaseA 37℃水浴，1hr，去除RNA，获得DNA提取物，于-20℃贮藏备用。
4.权利要求1所述的一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记在鉴定斑玉蕈菌株SIEF2632中的应用，其特征在于，是将所述斑玉蕈菌株SIEF2632采用权利要求1中的SIEF2632F/R引物对进行PCR扩增，能扩增出397bp条带的即为斑玉蕈菌株SIEF2632。
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| CN101608213A (zh) * | 2008-06-17 | 2009-12-23 | 上海市农业科学院 | 一种真姬菇交配型基因的鉴别方法 |
| CN103289996A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-09-11 | 上海丰科生物科技股份有限公司 | 纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记及其获得方法与应用 |
-
2013
- 2013-12-02 CN CN201310630944.2A patent/CN104673787B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101608213A (zh) * | 2008-06-17 | 2009-12-23 | 上海市农业科学院 | 一种真姬菇交配型基因的鉴别方法 |
| CN103289996A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-09-11 | 上海丰科生物科技股份有限公司 | 纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记及其获得方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Development of new strains and related SCAR markers for an edible mushroom,Hypsizygus marmoreus;Chang Y.Lee et al.;《FEMS Microbiol Lett》;20111130;第327卷;第54-59页 * |
| 真姬菇AFLP分子标记的建立和遗传多样性分析及酿酒酵母细胞絮凝主效基因的定位克隆;汪林;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20120615(第06期);第21页2.1真姬菇基因组DNA的提取 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN104673787A (zh) | 2015-06-03 |
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