CN103289996A - 纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记及其获得方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的分子标记，其特异性PCR扩增引物对序列为5'-CTCTGCCCTACATCTAATCTGC-3'和5'-CCCAAGCTACATTGACAATGATAG-3'；DNA片段大小为758bp。本发明还公开了一种纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记的获得方法与应用。
Description
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记及其获得方法与应用。
【背景技术】
真姬菇（拉丁文名称Hypsizygus marmoreus），隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶菌族、玉蕈属，因它具有独特的蟹鲜味，故又称它为蟹味菇。最初的人工栽培于1978年前后开始于日本，其味道鲜美、食感脆嫩、营养丰富，其味比平菇鲜，其肉比滑菇厚，其质比香菇韧，口感甚佳，其干品还香味浓溢。真姬菇含有丰富的维生素和17种氨基酸，子实体中提取的β-葡聚糖具有很高的抗肿瘤活性，是一种低热量、低脂肪的保健食品。
传统食用菌菌种鉴别，尤其对于真姬菇，其主要依据是子实体的外观形态、拮抗试验、出菇对比等。外观形态易受栽培环境（温度、湿度、CO2浓度、光照强度及通风等）和配方的影响，造成外观形态鉴定的困难。亲缘关系较近的菌株之间（比如有些亲本和子代之间），拮抗现象不明显，通过拮抗试验鉴别菌种也存在困难。出菇对比试验耗时至少4个月，不利于菌种的鉴定和检测。随着分子生物学的发展，分子标记法越来越广泛地用于菌种的鉴别。SCAR（Sequence-characterized Amplified Region）标记是一种十分稳定的分子标记，能够简便、快速、稳定的进行菌种鉴定，但目前尚未有对纯白色真姬菇Finc-W-90的SCAR分子标记，以便快速鉴定纯白色真姬菇Finc-W-90。
【发明内容】
本发明解决的技术问题是解决现有技术存在的缺陷，提供一种纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记及其获得方法与应用。
本发明采用PCR技术进行了大量的筛选试验，其中，采用随机引物（序列为：TGCTCTGCCC）获得了真姬菇菌株Finc-W-90的特异DNA片段，分子量为769bp，将该片段克隆测序，以此片段的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，其特异引物对序列为：5'CTCTGCCCTACATCTAATCTGC3'和5'CCCAAGCTACATTGACAATGATAG3'。该引物对对真姬菇Finc-W-90菌株进行PCR扩增，可以获得分子量大小为758bp的特异片段，即为真姬菇菌株Finc-W-90的分子标记。
本发明还公开一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的分子标记的获得方法，其特征在于包括如下步骤：
1）获得菌丝或者子实体；
2）基因组DNA提取；
3）RAPD法分析并获得特异DNA片段：采用RAPD法分析并获得真姬菇菌株Finc-W-90的特异DNA片段所用随机引物序列为：TGCTCTGCCC。
4）特异引物设计：以上述获得的特异DNA片段序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对序列 是5'-CTCTGCCCTACATCTAATCTGC-3'和5'-CCCAAGCTACATTGACAATGATAG-3'；
5）SCAR分子标记的PCR扩增：用特异PCR扩增引物对真姬菇Finc-W-90菌株的基因组进行SCAR-PCR扩增，得到758bp的特异分子标记。
6）电泳检测。
所述步骤3）中RAPD法的PCR扩增反应体系为：总体积25μL：基因组模板20-30ng/μL 1.0μL，随机引物0.5pmol/μL 1.0μL，10mM dNTP mix0.5μL，10×Taq缓冲液2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，Taq酶5U/μL 0.25μL，加水至25μL；PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃45s，36℃60s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min；纯白色真姬菇Finc-W-90菌株特异DNA片段大小为758bp。
所述步骤5）中SCAR分子标记的PCR扩增，其体系为：总体积25μL，模板20～30ng/μL 1μL，真姬菇Finc-W-90特异引物对0.5pmol/μL各0.5μL，10mM dNTP mix0.5μL，10×Taq Buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，Taq酶5U/μL 0.25μL，加水至25μL；PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。
本发明又公开一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的分子标记应用于纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的快速鉴定和检测。具体为采用真姬菇Finc-W-90菌株特异检测引物对真姬菇菌株进行PCR扩增，根据能否产生758bp大小的DNA片段，作为对真姬菇Finc-W-90菌株进行鉴定和检测的依据。
本发明的检测方法与常规的形态学检测、拮抗试验和栽培出菇对比等鉴定方法相比，具有检测时间短、准确性高的优点。它既能克服形态学检测、拮抗试验精确度差，又能克服栽培出菇对比耗时长的缺点。本方法在应用于已有的白色真姬菇菌株检测中发现，其具有Finc-W-90菌株的专一性。
【附图说明】
图1是随机引物S6对4个真姬菇菌株的PCR扩增产物的电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-90，3为G-W，4为GC-W，M为10kbp DNA ladder。
图2是特异引物对对4个真姬菇菌株的PCR扩增产物的电泳图谱，编号同图1。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
以下实施例中的所述“H-W”是2002年日本北斗株式会社选育推出的纯白色真姬菇品种，它通体雪白、无苦味；所述“G-W”菌株是从市场上购买的一种真姬菇菌株，它的原基为灰色，随着子实体的生长和发育逐渐变白，采收期菌柄为灰白色，菌盖为纯白色；所述“GC-W”菌株为日本葛城新育成的白玉菇菌株。
一种纯白色真姬菇Finc-W-247的分子标记的获得方法，包括如下步骤：
1）菌株培养和气生菌丝获得
把低温保藏的Finc-W-90和H-W、G-W和GC-W接种到PDA培养基上，在温度22℃、湿度75%的条 件下培养20天，刮取气生菌丝，-20℃冻存。
2）菌株基因组DNA提取
按照生工SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取，将所得到的DNA溶液置于-20℃备用。
3）RAPD法分析
请参见表1，选用13条随机引物进行RAPD分析。PCR扩增及体系建立（25μL）：基因组模板(20-30ng/μL)1.0μL，随机引物(0.5pmol/μL)1.0μL，dNTP mix(10mM each)0.5μL，10×Taq缓冲液2.5μL，MgCl2（25mM）2.0μL，Taq酶(5U/μL)0.25μL，加水至25μL。PCR反应条件：预变性95℃3mim；94℃45s，36℃60s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。
表1 随机引物
经过筛选，随机引物S6能扩增得到Finc-W-90菌株所特有的DNA条带，请参阅图1。从图1可知，a框所在位置的条带为Finc-W-90所特有，而H-W、G-W和GC-W所在泳道对应位置上均无该条带出现。
切割图1中a框所在位置Finc-W-90特有的DNA条带，回收DNA。回收方法按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明。回收的DNA采用常规测序，结果见序列表，其为769bp的DNA片段。
4）特异引物的获得
用primer premier5.0软件进行特异引物设计，设计的扩增引物对序列为5'CTCTGCCCTACATCTAATCTGC3'和5'CCCAAGCTACATTGACAATGATAG3'。
5）SCAR分子标记的PCR扩增
用特异PCR扩增引物对Finc-W-90和H-W、G-W和GC-W进行SCAR-PCR扩增。扩增体系：总体积25μL，模板(20-30ng/μL)1μL，真姬菇Finc-W-90菌株检测特异引物对(0.5pmol/μL)各0.5μL，dNTPmix(10mM each)0.5μL，10×Taq Buffer2.5μL，MgCl2（25mM）2.0μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，加水至25μL。PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃1min35个循环；72℃延伸5min。
6）电泳检测
取上述PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，进行琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像仪上照相，其结果请参阅图2电泳图谱。
从图2可知，只有Finc-W-90有专一扩增条带，而H-W、G-W和GC-W均无扩增条带，说明 5′CTCTGCCCTACATCTAATCTGC3′和5′CCCAAGCTACATTGACAATGATAG3′是Finc-W-90的SCAR分子标记引物。用该引物对所扩增出的DNA片段分子量为758bp，该758bp的特异DNA片段为Finc-W-90的SCAR分子标记。
在本实施例中，采用菌丝进行基因组DNA的提取，显然，采用子实体也同样可以进行基因组DNA的提取。提取的方法已为现有技术所公开，在此不在赘述。
以上描述仅为本发明的实施例，谅能理解，在不偏离本发明构思的前提下，对本发明的简单修改和替换皆应包含在本发明的技术构思之内。
Claims (4)
1.一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的分子标记，其特征在于：特异性PCR扩增引物对序列为5'-CTCTGCCCTACATCTAATCTGC-3'和 5'-CCCAAGCTACATTGACAATGATAG-3'；DNA片段大小为758bp。
2.一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的分子标记的获得方法，其特征在于包括如下步骤：
1）获得菌丝或者子实体；
2）基因组DNA提取；
3）RAPD法分析并获得特异DNA片段：采用RAPD法分析并获得真姬菇菌株Finc-W-90的特异DNA片段所用随机引物序列为：TGCTCTGCCC；
4）特异引物设计：以上述获得的特异DNA片段序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对序列是5'-CTCTGCCCTACATCTAATCTGC-3'和 5'-CCCAAGCTACATTGACAATGATAG-3'；
5）SCAR分子标记的PCR扩增：用特异PCR扩增引物对真姬菇Finc-W-90菌株的基因组进行SCAR-PCR扩增，得到758bp的特异分子标记；
6）电泳检测
根据权利要求2所述的一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌株的分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤3）中RAPD法的PCR扩增反应体系为：总体积25μL：基因组模板20-30ng/μL 1.0μL，随机引物0.5pmol/μL 1.0μL，10mM dNTP mix 0.5μL，10×Taq 缓冲液2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，Taq 酶5U/μL 0.25 μL，加水至25μL；PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃45s，36℃60s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min；纯白色真姬菇Finc-W-90菌株特异DNA片段大小为758bp。
3.根据权利要求2或3所述的一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌株的分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤5）中SCAR分子标记的PCR扩增，其体系为：总体积25μL，模板20～30ng/μL 1μL，真姬菇Finc-W-90特异引物对 0.5pmol/μL 各0.5μL，10mM dNTP mix 0.5μL，10×Taq Buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，Taq 酶5U/μL 0.25μL，加水至25μL；PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。
4.根据权利要求1所述一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的分子标记应用于纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的快速鉴定和检测。
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