CN103477993A - 纯白色真姬菇新菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62，其保藏编号是CCTCC NO:M 2012375。Finc-W-62的培养及栽培周期短，降低生产成本，菌盖不易开伞，瘤盖菇比例低，提升了外观品质，且子实体保鲜期长。
Description
【技术领域】
本发明涉及食用菌技术领域，更确切的说，涉及一种纯白色真姬菇新菌株。
【背景技术】
真姬菇（拉丁文名称Hypsizygus marmoreus），隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、玉蕈属，因它具有独特的蟹鲜味，故又称它为蟹味菇。最初的人工栽培于1978年前后开始于日本，其味道鲜美、食感脆嫩、营养丰富，其味比平菇鲜，其肉比滑菇厚，其质比香菇韧，口感甚佳，其干品还香味浓溢。真姬菇含有丰富的维生素和17种氨基酸，子实体中提取的β-葡聚糖具有很高的抗肿瘤活性，是一种低热量、低脂肪的保健食品。
众所周知，菌种对食用菌的工厂化栽培起着至关重要的作用。目前真姬菇有棕色和纯白色两类，纯白色真姬菇又称“白玉菇”或“玉龙菇”，深受市场欢迎。现在市场上的主要栽培品种是日本北斗株式会社公司的白玉菇1号(以下简称“H-W”)，H-W的子实体通体雪白、无苦味，增加了菜肴的美感。但是它仍然存在以下缺陷：（1）培养及栽培周期长，生产成本较高；（2）容易出现瘤盖菇，良品率低；（3）易开伞，外观品质差；（4）保鲜期短。
【发明内容】
本发明解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供一种培养及栽培周期短，瘤盖菇出现率低，菌盖不易开伞，且保鲜期长的纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62是通过亲本TNN-11和H-W杂交，经系统选育获得。该菌株已经于2012年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2012375，其生物学分类命名为Hypsizygus marmoreus Finc-W-62。
本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62的特征在于：
1、形态特征
Finc-W-62的菌丝：气生菌丝较为发达，密度一般；菌盖：断面呈圆山 型，通体雪白，肉厚、肉质脆，斑纹清晰、中央分布，不易开伞，无龟裂；菌褶：雪白，呈波纹状弯曲，密度稀疏；菌柄：中粗、雪白、无毛，与菌盖连接略偏生，肉质脆。
2、生物学特性
营养成分来源：玉米芯、杂木屑、米糠、麸皮和玉米粉等，其中，含水量64～66%。
培养及栽培条件：菌丝体培养温度20～25℃，湿度75%，CO2浓度2500～4000ppm，培养周期70～90d。适宜出菇温度为13～15℃，湿度93～100%，CO2浓度1000～2000ppm，前1～7d光照强度50～100Lux，后8～20d光照强度200～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期21～24d。
3、遗传学特性
纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62的DNA经特异性引物对①5'-CCGTTCATGATGTCTTTGATTTAG-3'和5'-TTGTACTGAGACTGAGACCCAGAAC-3'的PCR扩增，获得约为935bp大小的分子标记片段，其电泳图谱见图10。经特异性引物对②5'-ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC-3'和5'-TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC-3'的PCR扩增，获得约为1082bp大小的分子标记片段，其电泳图谱见图11。
与现有技术相比，本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62具有较短的培养及栽培周期，降低了工厂化栽培的生产成本；同时，新菌株Finc-W-62的菌盖不易开伞，且瘤盖菇的出现率低，这在提升产品良率的同时，也有效的改善了产子实体的外观品质；另外，新菌株Finc-W-62的子实体具有较长的保鲜期，使得该产品在市场上的具有较强的抗风险能力。
【附图说明】
图1是Finc-W-62和H-W的单产与栽培周期随菌龄变化曲线图。
图2-A是Finc-W-62和H-W分别在最佳栽培周期之前3天采收后的照片，左为Finc-W-62，右为H-W。
图2-B是Finc-W-62和H-W分别在最佳栽培周期时采收后的照片，左为Finc-W-62，右为H-W。
图2-C是Finc-W-62和H-W分别在最佳栽培周期之后3天采收后的照片，左为Finc-W-62，右为H-W。
图3是Finc-W-62和H-W菌丝生长速度随温度梯度变化图。
图4是通用引物ITS1和ITS4对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-62，3为G-W，4为GC-W，M为marker。
图5是Finc-W-62的系统发育树。
图6是随机引物S31对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-62，3为G-W，4为GC-W，M为marker。
图7是随机引物S121对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-62，3为G-W，4为GC-W，M为marker。
图8是随机引物S265对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-62，3为G-W，4为GC-W，M为marker。
图9是随机引物S1327对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-62，3为G-W，4为GC-W，M为marker。
图10是特异引物对①对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-62，3为G-W，4为GC-W，M为marker。
图11是特异引物对②对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-62，3为G-W，4为GC-W，M为marker。
【具体实施方式】
以下实施例中“G-W”菌株是可以从市场上购买得来的一种真姬菇菌株，它的原基为灰色，随着子实体的生长和发育逐渐变白，采收期菌柄为灰白色，菌盖为纯白色；“GC-W”菌株为日本葛城新育成的白玉菇菌株。
实施例1 杂交获得Finc-W-62
本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62的育种过程包括如下步骤：
1)选择亲本菌株：选取TNN-11和H-W为亲本，这两个亲本的子实体能从市场上购买得到，在上海市农业科学院菌种保藏中心也有保藏。
2)配制培养基
PDA培养基：每1L培养基用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。
原种培养基：木屑65%（重量百分比，下同）、米糠18%、麸皮7%、玉米粉10%，含水量为60%～62%。
栽培种培养基：玉米芯40%、大豆皮24%、米糠14%、麸皮17%，玉米粉5%，含水量为64%～66%。
3)采用常规杂交方法获得杂合子800个。
4)栽培并筛选：把获得的杂合子根据常规的方法进行栽培试验和筛选。
5)获得目标菌株：通过系统筛选，从800个杂合子中，获得一个纯白菌株，它具有培养及栽培周期短、不易开伞、瘤盖菇出现率低、保鲜期长等特点，达到了选育目的。该菌株被命名为“Finc-W-62”。
本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62已于2012年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012375，菌株经检测存活，分类地位为玉蕈属真姬菇。
实施例2 菌龄试验
本实施例通过对本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62与现有纯白色真姬菇中品质优良、种植最广泛的H-W进行培养周期（即菌龄，下同）和栽培周期对比，来说明本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62的优势和特点。
本实施例采用的栽培种培养基为：玉米芯25%、杂木屑23%、大豆皮20%、米糠12%、麸皮15%，玉米粉5%，其中含水量64%～66%。
表1 菌龄试验
以H-W为对照，培养周期从70d（即天，下同）到100d设置7个菌龄，每增加5d为一菌龄，每菌龄80瓶。培养及栽培采用常规的真姬菇培养和栽培参数，栽培瓶的容积为850cc，瓶口直径58mm。
本试验结果请一并参阅图1和表1，当培养周期从70d到100d，H-W的产量呈增长后下降趋势，其最高单产为156g/bottle（也即克/瓶，下同），对应最佳菌龄为95d，栽培周期为23d，而Finc-W-62的单产由124g/bottle逐渐上升到最高单产163g/bottle，最佳菌龄为85d，相应栽培周期为21d。相比H-W，Finc-W-62的最佳菌龄缩短了10d，栽培周期缩短了2d，由此可以看出，Finc-W-62在培养周期、栽培周期方面有明显优势。
实施例3 开伞试验
以实施例2中第85d菌龄的Finc-W-62和H-W各10瓶为试验对象，每天记录开伞情况。结果请一并参阅图2-A、图2-B、图2-C和表1～2，从表1可知，Finc-W-62的最佳栽培周期为21d，H-W的最佳栽培周期为23d，当分别在所述最佳栽培周期时，Finc-W-62和H-W的菌盖直径一般在1～2cm。Finc-W-62在最佳采收期后继续栽培5d依然不开伞，而H-W在最佳采收期后继续栽培1d或2d后开伞。当采收由Finc-W-62和H-W两菌株的最佳栽培期提前3d，二者均不开伞，即如图2-A所示两个菌盖的左为Finc-W-62栽培第18d，右为H-W栽培第20d；在最佳栽培期采收时，二者同样都未开伞，如图2-B所示，即分别为Finc-W-62栽培21d和H-W栽培23d；当采收由最佳栽培期延迟3d，即Finc-W-62和H-W分别栽培24d和26d，由图2-B可知，Finc-W-62仍旧未开伞，而H-W已开伞。上述结果表明，Finc-W-62的菌盖不易开伞或不开伞，因而在搬动、挑选、搭配、装载、卸载的各个环节中菌盖不易受损，有利于保持外观品质，从而有利于延长货架期，提高经济效益。
表2 Finc-W-62与H-W开伞试验
实施例4 保鲜试验
Finc-W-62和H-W采收后，以每包155g～165g进行包装，各24包，先于冷库（3℃～8℃）保藏11d，然后取出放置在23℃环境，记录子实体品质变化情况。其中，正常：表示子实体完全新鲜；开始变质：表示有一根以上子实体开始霉腐，但整体仍有商品价值；完全变质：两根及以上已霉腐，无商品价值。试验结果请参见表3，冷库（3℃～8℃）保藏11d后，Finc-W-62在23℃环境继续保藏16d依然完好；H-W在23℃环境继续保藏的第10d开始由雪白变黄，失去了新鲜感，与之形成鲜明对比的是Finc-W-62在相同的环境下第20d部分开始变黄；H-W在冷库保藏11d后，23℃继续保藏的第18d全部失去商业价值，而Finc-W-62在第28d后才全部失去商业价值。以上说明Finc-W-62的保鲜期比H-W具有明显优势。
表3 Finc-W-62与H-W保鲜试验
实施例5 菌丝生长的温度梯度试验
本实施例按培养的温度梯度设计4组实验，每组包括Finc-W-62和H-W，各10次重复。从Finc-W-62和H-W培养平板上分别切取直径为5.0mm的接种块接种到PDA培养基上，分别于20℃、25℃、30℃和35℃培养11d，试验结果见表4和图4。当温度为25℃时，Finc-W-62和H-W的菌丝生长速度都达到最大，其中Finc-W-62为4.1，H-W为3.6，二者均比20℃时的生长速度快。并且，在温度升高到35℃时，Finc-W-62和H-W都不能生长。试验结果表明：Finc-W-62的菌丝在20℃～25℃生长速度较快，其适宜培养温度为20℃～25℃。
表4 Finc-W-62与H-W温度梯度试验
实施例6 形态特征和生物学特性
Finc-W-62的形态特征请一并参阅表5。
Finc-W-62的菌丝：气生菌丝较为发达，密度一般；菌盖：断面呈圆山型，通体雪白，肉厚、肉质脆，斑纹清晰、中央分布，不易开伞，无龟裂； 菌褶：雪白，呈波纹状弯曲，密度稀疏；菌柄：中粗、雪白、无毛，与菌盖连接略偏生，肉质脆。
表5 Finc-W-62与H-W形态特征对比
Finc-W-62的生物学特性：营养成分来源：玉米芯、杂木屑、米糠、麸皮和玉米粉等，其中，含水量64%～66%。
培养及栽培条件：菌丝体培养温度20℃～25℃，湿度75%，CO2浓度2500～4000ppm，培养周期70d～90d。适宜出菇温度为13℃～15℃，湿度93%～100%，CO2浓度1000～2000ppm，前1d～7d光照强度50Lux～100Lux，后8d～20d光照强度200Lux～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期21d～24d。
实施例7 拮抗试验
本实施例以本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62和H-W、G-W、GC-W为试验材料，所用培养基为PDA培养基。Finc-W-62和H-W、G-W、GC-W在平板培养基上分别对峙接种和培养，接种点相距2cm，24℃恒温培养26d。拮抗试验结果参照表6，在对峙培养菌落交界处的正面和背面，Finc-W-62与H-W、Finc-W-62与G-W和Finc-W-62与GC-W拮抗线明显，说明Finc-W-62是与H-W、G-W和GC-W不同的真姬菇新菌株。
表6 Finc-W-62与不同菌株的拮抗试验
实施例8 ITS测序鉴定
在本实施例中，ITS测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司(以下简称“生工”)进行，包括以下过程：
基因组的提取：按照生工SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。将所得到的DNA溶液置于-20℃，冷藏备用。
PCR扩增及体系建立（25μL）：基因组模板1μL，真菌rDNA通用引物ITS1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(10μM)0.5μL，ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(10μM)0.5μL，dNTP mix(10mM each)0.5μL，10×Taq反应缓冲液，2.5μL，Taq(5u/μL)0.2μL，加水至25μL。PCR程序：预变性94℃5mim；94℃30s，55℃35s，72℃1min，35个循环，72℃延伸8min。扩增得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，其电泳结果见图4。
DNA琼脂糖凝胶回收胶纯化和测序采用常规方法。
本试验菌株Finc-W-62的ITS序列测序结果见序列表，其序列为667bp的DNA片段。从GenBank中查得，Finc-W-62菌株ITS序列与玉蕈属真姬菇的ITS序列相似性最高。并从GenBank中查得与玉蕈属真姬菇相近种的ITS序列，应用DNAStar MegAlign软件构建出供试菌株的系统发育树，请参阅图5。
实施例9 RAPD分析
本实施例以本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62和H-W、G-W、GC-W为分析对象，利用RAPD分析技术，进一步鉴定本发明纯白色真姬菇新菌株 的遗传特性。本实施例中DNA提取、PCR体系、琼脂糖凝胶电泳体系与实施例8相同，在此不再赘述。
在RAPD分析中，从15个随机引物中筛选出4个引物能清晰的将Finc-W-62与其他三种真姬菇菌株H-W、G-W和GC-W区分，该随机引物分别是S31、S121、S265和S1327。所用15个随机引物序列请参阅表7。
表7 随机引物
RAPD分析的结果如下：
引物S31对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图6，其中a框所在的位置为本发明Finc-W-62特有DNA条带，H-W、G-W和GC-W均无该条带，所以引物S67能区别本发明Finc-W-62和H-W、G-W和GC-W。
引物S121对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图7，b框所在的位置，Finc-W-62无DNA条带，G-W和GC-W都有DNA条带，说明Finc-W-62与G-W和GC-W是不同的菌株。c框所在的位置，Finc-W-62有DNA条带，H-W无DNA条带，说明Finc-W-62与H-W是不同的菌株。上述结果说明：引物S121能区别Finc-W-62与H-W、G-W和GC-W菌株，Finc-W-62是真姬菇新菌株。
引物S265对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图8，其中d框所在的位置为本发明Finc-W-62特有DNA条带，H-W、G-W和GC-W均无该条带，所以引物S265能区别本发明Finc-W-62和H-W、G-W和GC-W。
引物S1327对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图9，e框所在的位置，Finc-W-62无DNA条带，H-W和GC-W都有DNA条带，说明Finc-W-62与H-W和GC-W是不同的菌株。f框所在的位置，Finc-W-62有DNA条带，G-W无DNA条带，说明Finc-W-62与G-W是不同的菌株。以上说明引物S1327能区别Finc-W-62与H-W、G-W和GC-W菌株，Finc-W-62是新菌株。
综上,引物S31、S121、S265和S1327均能区别Finc-W-62与H-W、G-W和GC-W菌株，Finc-W-62是纯白色真姬菇新菌株。
实施例10 SCAR分子特异标记
SCAR（Sequence-characterized Amplified Region）标记是一种十分稳定的分子标记，该技术是通过对RAPD扩增产物测序的基础上，设计一对新的引物特异地扩增原引物可扩增的DNA片段，能够简便、快速、稳定的进行菌种鉴定。本实施例建立了纯白真姬菇Finc-W-62菌种的SCAR分子标记，能够对Finc-W-62菌种进行快速鉴定。
分别切割图6中a框和图8中d框所在位置Finc-W-62特有的DNA条带，回收DNA。在本实施例中，回收方法按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明。回收的DNA采用常规测序，结果参见序列表，它们分别为950bp和1093bp的DNA片段。
根据上述950bp和1093bp的DNA片段两端碱基序列，用Primer premier 5.0软件分别进行特异引物设计，所述DNA片段两端各舍弃数个碱基，最终设计的扩增引物对分别为序列对①5'CCGTTCATGATGTCTTTGATTTAG 3'和5'TTGTACTGAGACTGAGACCCAGAAC3'和序列对②5'ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC3'和5'TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC3'。
分别用上述两个引物对Finc-W-62和H-W、G-W和GC-W的DNA进行SCAR-PCR扩增。其扩增体系为：总体积25μL，模板(20-30ng/μL)1μL，真姬菇Finc-W-62菌株特异引物对(0.5pmol/μL)各0.5μL，dNTP mix(10mM each)0.5μL，10×Taq Buffer2.5μL，MgCl2（25mM）2.0μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，加水至25μL。PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃1min35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，分别取上述特异PCR扩增引物对①和②的扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相，其结果请参阅电泳图谱图10和图11。从图10和图11可知，它们都是只有Finc-W-62显示出扩增条带，而H-W、G-W和GC-W均无扩增条带，说明引物对①5'CCGTTCATGATGTCTTTGATTTAG 3'和5'TTGTACTGAGACTGAGACCCAGAAC3'与引物对②5'ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC 3'和5'TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC3'都是Finc-W-62的SCAR分子标记引物。用引物对①和②所扩增出的DNA片段分 子量分别为935bp和1082bp，所述两个935bp和1082bp的特异DNA片段均是Finc-W-62的SCAR分子标记。
以上描述仅为本发明的实施例，谅能理解，在不偏离本发明构思的前提下，对本发明的简单修改和替换皆应包含在本发明的技术构思之内。
Claims (1)
1.一种纯白色真姬菇新菌株Finc-W-62，其保藏编号是CCTCC NO: M 2012375。
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