CN103503778B - 纯白色真姬菇菌株 - Google Patents

Abstract

一种纯白色真姬菇菌株Finc-W-227，其保藏编号是CCTCC NO：M2012377。本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-227具有瘤盖菇出现概率低，且单产高，适合大面积推广种植。

Description

纯白色真姬菇菌株

【技术领域】

本发明涉及了食用菌技术领域，更确切的说，涉及一种纯白色真姬菇菌株。

【背景技术】

真姬菇(拉丁文名称Hypsizygus marmoreus)，隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、玉蕈属，因它具有独特的蟹鲜味，故又称它为蟹味菇。最初的人工栽培于1978年前后开始于日本，其味道鲜美、食感脆嫩、营养丰富，其味比平菇鲜，其肉比滑菇厚，其质比香菇韧，口感甚佳，其干品还香味浓溢。真姬菇含有丰富维生素和17种氨基酸，子实体中提取的β-1，3-D葡聚糖具有很高的抗肿瘤活性，是一种低热量、低脂肪的保健食品。

真姬菇从栽培伊始，基本上就是走的工厂化生产的路线。由于工厂化栽培具有周年连续生产、规模化生产的特点，大多实现半机械化、机械化及智能化，生长环境容易控制，产量品质更有保障。在工厂化生产的过程中我们会发现，如果单株之间以及单株内单根子实体之间的外观差异较大，将制约采收和包装的机械化和自动化的使用，这不但增加了劳动力成本、还会因过多的人为搬动、挑选及搭配而增加了子实体的破损度，从而导致外观品质降低，市场接受度差，削弱了产品的市场竞争力。

众所周知，菌种对食用菌的工厂化栽培起着至关重要的作用。目前真姬菇有茶褐色和纯白色两个主栽品系，纯白色品系又称“白玉菇”、“玉龙菇”，深受市场欢迎，主栽品种只有日本北斗公司的北斗白玉菇1号(以下简称“H-W”)。H-W是2002年选育推出的纯白色真姬菇品系，它通体雪白、无苦味，但是它存在以下缺陷：(1)培养周期长，生产成本高；(2)单株之间以及单株内单根子实体之间外观均一度差；(3)保鲜期短，(4)单产较低。

【发明内容】

本发明解决的技术问题是解决现有技术存在的缺陷，提供一种纯白色真姬菇菌株Finc-W-90，该菌株具有培养周期短，外观均匀度高，保鲜期长和单产高的特点。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90是通过亲本TNN-11和H-W杂交，经系统选育获得。该菌株已经于2012年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:M 2012376，其生物学分类命名为Hypsizygusmarmoreus Finc-W-90。

本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90的特征在于：

1、形态特征

Finc-W-90的菌丝：洁白浓密，气生菌丝发达；菌盖：直径1.5±0.30cm，断面圆山型，通体雪白，肉厚、肉质脆，斑纹清晰、中央分布，无龟裂；菌褶：雪白、正常排列；孢子印呈白色；菌柄：长度为6.6±0.83cm，中粗、雪白、无毛，与菌盖中心生，肉质脆。

2、生物学特性

营养成分来源为：玉米芯、杂木屑、米糠、麸皮和玉米粉等，其中，含水量60％～62％。

培养及栽培条件：菌丝体培养温度20～25℃，湿度75％，CO2浓度2500ppm～4000ppm，培养周期70d～90d。适宜出菇温度为13℃～15℃，湿度93％～100％，CO2浓度1000ppm～2000ppm，前1d～7d光照强度50Lux～100Lux，后8d～20d光照强度200Lux～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期22d～26d。

3、遗传学特征

Finc-W-62菌株的DNA经特异性引物对引物对5'-CCGTTCATGATGTCTTTGATTTAG-3'和5'-TTGTACTGAGACTGAGACCCAGAAC-3'的PCR扩增，获得约为758bp大小的SCAR分子标记片段，其电泳图谱见图7。

与现有技术相比，本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90有效地缩短了培养周期，降低了生产成本；有效提高了单株之间以及单株内单根子实体之间外观均一度，且具有较高的单产和较长的保鲜期，适宜大面积推广种植。

【附图说明】

图1是Finc-W-90和H-W的单产、栽培周期随菌龄变化曲线图。

图2是Finc-W-90和H-W的菌丝生长速度随温度变化曲线图。

图3是引物ITS1和ITS4对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为菌H-W，2为Finc-W-90，3为G-W，4为GC-W，M为10kbp DNA ladder。

图4是Finc-W-90系统发育树。

图5是引物S6对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为菌H-W，2为Finc-W-90，3为G-W，4为GC-W，M为10kbp DNA ladder。

图6是引物S37对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为菌H-W，2为Finc-W-90，3为G-W，4为GC-W，M为10kbp DNA ladder。

图7是Finc-W-90的特异引物对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为菌H-W，2为Finc-W-90，3为G-W，4为GC-W，M为10kbp DNA ladder。

【具体实施方式】

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例中的所述“G-W”菌株是从市场上购买的一种真姬菇菌株，它的原基为灰色，随着子实体的生长和发育逐渐变白，采收期菌柄为灰白色，菌盖为纯白色；所述“GC-W”菌株为日本葛城新育成的白玉菇菌株。

实施例1 杂交获得Finc-W-90

本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90的育种过程包括如下步骤：

1)选择亲本菌株：选取TNN-11和H-W为亲本，这两个亲本的子实体能在市场上购买到，在上海市农业科学院菌种保藏中心也有保藏。

2)配制培养基

PDA培养基：每1L培养基用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。

原种培养基：木屑65％(重量百分比，下同)、米糠18％、麸皮7％、玉米粉10％，含水量为60％～62％。

栽培种培养基：玉米芯40％、大豆皮24％、米糠14％、麸皮17％，玉米粉5％，含水量为64％～66％。

3)常规的方法获得杂合子800个。

4)栽培筛选：把获得的杂合子根据常规的方法进行栽培试验和筛选。

5)获得目标菌株：通过系统筛选，从800个杂合子中，获得一个纯白色菌株，它培养周期短、子实体均匀度高、保鲜期长和单产高，达到了选育目标。该菌株被命名为“Finc-W-90”。

本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90已于2012年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012376，菌株经检测存活，分类地位为玉蕈属真姬菇。

实施例2 菌龄试验

本实施例通过对本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90与现有纯白色真姬菇中种植最广泛的H-W进行培养周期(即菌龄，下同)、栽培周期以及单产的对比，来说明本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90的优势和特点。

本实施例采用的栽培种培养基为：木屑65％、米糠18％、麸皮7％、玉米粉10％，补充水分，使培养基中的含水量达到60％～62％。

以H-W为对照，从70d(即天，下同)到110d设置9个菌龄，每增加5d为一菌龄，每菌龄80瓶。培养及栽培采用常规的真姬菇培养和栽培参数，栽培瓶的容积为850cc，瓶口直径58mm。

本实施例结果请一并参阅图1和表1，综合菌龄、栽培周期和单产，H-W的最高单产为145g/bottle(即克/瓶，下同)，相应的最佳菌龄为100d，栽培周期22d，而Finc-W-90的最高单产达到163g/bottle，其对应的最佳菌龄为85d，栽培周期为24d；由此可知，与H-W相比，Finc-W-90在培养周期与栽培周期之和有明显优势，可以缩短11d，而最高单产也提高了18g/bottle。

表1 菌龄试验

实施例3 栽培对比试验

本实施例对Finc-W-90和H-W两个菌株的瓶单产、菌盖、菌柄长度和子实体单菇鲜重的均匀度进行研究。以实施例2中第85d菌龄的Finc-W-90和H-W为研究对象，不同菌株随机抽取40栽培瓶为样本，进行统计分析，其结果见表2～表5。

其中，变异系数(％)＝标准偏差/平均值×100％(下同)

根据表2可知，Finc-W-90单产的变异系数为7.4％，H-W单产的变异系数为15.5％，可见Finc-W-90单产的相对变异度较小，说明Finc-W-90菇朵间单产更均匀。

表2 不同真姬菇菌株单产均匀度

由表3可知，Finc-W-90和H-W菌盖直径平均都是1.5cm，Finc-W-90菌盖直径的变异系数为20.0％，H-W菌盖直径的变异系数为44.7％，可见Finc-W-90菌盖直径的相对变异度较小，说明Finc-W-90的菌盖直径更均匀。

表3 不同真姬菇菌株子实体菌盖大小均匀度

表4显示，Finc-W-90菌柄长平均为6.6cm，H-W菌柄长平均为5.5cm，Finc-W-90菌柄长度的变异系数为12.6％，H-W菌柄长度的变异系数为20.0％，由此说明Finc-W-90菌柄长度的相对变异度较小，其菌柄长度更均匀。

表4 不同真姬菇菌株子实体菌柄长均匀度

由表5可知，Finc-W-90子实体单菇鲜重平均达到3.1g，而H-W平均为2.4g；Finc-W-90子实体单菇鲜重的变异系数为44.5％，而H-W子实体单菇鲜重的变异系数达到了60.7％，可见Finc-W-90子实体单菇鲜重的相对变异度较小，说明Finc-W-90子实体单菇鲜重更均匀。

表5 不同真姬菇菌株子实体单菇鲜重均匀度

通过上述对比可知，与H-W相比，本发明Finc-W-90的菇朵间、菌盖直径间、菌柄长度间和子实体单菇鲜重间的均匀度更高，因此Finc-W-90提高了可机械化和自动化程度，此外，本发明Finc-W-90平均菌盖直径大、平均菌柄长、平均单根菇重，并且它们的变异系数小，这说明Finc-W-90大都处于易食用状态，即Finc-W-90的有效茎数比例比H-W高。

实施例4 保鲜试验

以H-W为对照，Finc-W-90和H-W采收后，按每包155～165g包装，各20包，于冷库(3℃)保藏13d，然后取出放置在22℃室温条件下，记录子实体品质变化情况。其中，正常：表示子实体完全新鲜；开始变质：表示有一根以上子实体开始霉腐，但整体仍有商品价值；完全变质：两根及以上已霉腐，无商品价值。

试验结果请参见表6，冷库(3℃～8℃)保藏11d后，Finc-W-90在23℃环境继续保藏15d依然完好；H-W在23℃环境继续保藏的第10d开始由雪白变黄，失去了新鲜感，与之形成鲜明对比的是Finc-W-90在相同的环境下第19d部分开始变黄；H-W在冷库保藏11d后，23℃继续保藏的第18d全部失去商业价值，而Finc-W-90在23℃继续保藏第27d后才全部失去商业价值。以上说明Finc-W-90的保鲜期比H-W具有明显优势。

表6Finc-W-90与H-W子实体保鲜试验

实施例5 菌丝生长温度梯度试验

本实施例按培养的温度梯度设计4组实验，每组包括Finc-W-90和H-W，各10次重复。

从Finc-W-90和H-W培养平板上分别切取直径为5.0mm的接种块接种到PDA培养基上，分别于20℃、25℃、30℃和35℃培养11d，试验结果见表7和图2。当温度为25℃时，Finc-W-90和H-W的菌丝生长速度都达到最大，其中Finc-W-90为4.9mm/d，大于H-W的3.6mm/d，二者均比20℃时的生长速度快。并且，在温度升高到35℃时，Finc-W-90和H-W都不能生长。试验结果表明：Finc-W-90的菌丝在20℃～25℃生长速度较快，其适宜培养温度为20～25℃，且比H-W的菌丝生长快。

表7 真姬菇Finc-W-90与H-W温度梯度试验

实施例6 形态特征和生物学特性

Finc-W-90的形态特征：

菌丝：洁白浓密，气生菌丝发达；

菌盖：直径1.5±0.30cm，断面圆山型，通体雪白，肉厚、肉质脆，斑纹清晰、中央分布，无龟裂；

菌褶：雪白、正常排列；孢子印颜色呈白色；

菌柄：长度为6.6±0.83cm，中粗、雪白、无毛，与菌盖中心生，肉质脆。

Finc-W-90与H-W的具体形态特征的差异请参阅表8。

表8 Finc-W-90与H-W形态特征对比

生物学特性：

营养成分来源为：玉米芯、杂木屑、米糠、麸皮和玉米粉等，其中，含水量60％～62％。菌丝体培养温度20℃～25℃，湿度75％，CO2浓度2500ppm～4000ppm，培养周期70d～90d。适宜出菇温度为13℃～15℃，湿度93％～100％，CO2浓度1000ppm～2000ppm，前1d～7d光照强度50Lux～100Lux，后8d～20d的光照强度200Lux～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期22d～26d。

实施例7 拮抗试验

本实施例以本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90和H-W、G-W、GC-W为试验材料，所用培养基为PDA培养基。

Finc-W-90和H-W、G-W、GC-W在平板培养基上分别对峙接种和培养，接种点相距2cm，24℃恒温培养26d。

拮抗试验结果参照表8，在对峙培养正面、背面的菌落交界处，Finc-W-90与H-W、Finc-W-90与G-W和Finc-W-90与GC-W拮抗现象明显。说明Finc-W-90与H-W、G-W、GC-W之间都有拮抗现象，Finc-W-90是一个真姬菇新菌株。

表9 拮抗试验

实施例8 ITS测序鉴定

在本实施例中，ITS测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称“生工”)进行，包括以下过程：

基因组的提取：按照生工SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。将所得到的DNA溶液置于-20℃备用。

PCR扩增及体系建立(25μL)：基因组模板1μL，真菌rDNA通用引物ITS15'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(10μM)0.5μL，ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(10μM)0.5μL，dNTP mix(10mM each)0.5μL，10×Taq反应缓冲液2.5μL，Taq(5u/μL)0.2μL，加水至25μL。PCR程序：预变性94℃5mim；94℃30s，55℃35s，72℃1min，35个循环，72℃延伸8min。扩增所得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，其电泳结果见图3。DNA琼脂糖凝胶回收胶纯化和测序采用常规方法。

本试验菌株Finc-W-90的ITS序列测序结果见序列表，其序列为665bp的DNA片段。从GenBank中查得，Finc-W-90菌株ITS序列与玉蕈属真姬菇的ITS序列相似性最高。并从GenBank中查得与玉蕈属真姬菇相近种的ITS序列，应用DNAStar MegALign软件构建出供试菌株的系统发育树，请参阅图4。

实施例9 RAPD分析

本实施例以本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90和H-W、G-W、GC-W为分析对象，利用RAPD分析技术，进一步鉴定本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90的遗传特性。本实施例中DNA提取实施例7相同，在此不再赘述。

RAPD分析中，从13个随机引物中筛选出2个引物能清晰的区分出Finc-W-90和H-W、G-W、GC-W真姬菇菌种，这2个随机引物分别是S6、S37。所用13个随机引物序列请参阅表10。

表10 随机引物

RAPD分析的结果如下：

1)引物S6对应PCR扩增图谱为图5，其中a框所在的位置为本发明Finc-W-90独有DNA条带，H-W、G-W、GC-W均无该条带，所以引物S6能区别本发明Finc-W-90和H-W、G-W、GC-W。

2)引物S37对应PCR扩增图谱为图6，其中b框所在的位置唯有本发明Finc-W-90没有DNA条带，H-W、G-W、GC-W均有该条带所以引物S37能区别本发明Finc-W-90和H-W、G-W、GC-W。

以上分析结果显示，本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90与H-W、G-W、GC-W存在明显的遗传差异，随机引物S6和S37均能反映出本发明纯白色真姬菇菌株Finc-W-90与H-W、G-W、GC-W的遗传差异，该结果进一步说明本发明Finc-W-90是一种全新的纯白色真姬菇菌株。

实施例10 SCAR分子标记

SCAR(Sequence-characterized Amplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，该技术是通过对RAPD扩增产物测序的基础上，设计一对新的引物特异地扩增原引物可扩增的DNA片段，能够简便、快速、稳定的进行菌种鉴定。本实施例建立了纯白真姬菇Finc-W-90菌种的SCAR分子标记，能够对Finc-W-90菌种进行快速鉴定。

切割图5中a框所在位置Finc-W-90特有的DNA条带，回收DNA。回收方法按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明。回收的DNA采用常规测序，结果见序列表，其为769bp的DNA片段。

根据上述769bp的DNA片段两端碱基序列，用Primer premier 5.0软件分别进行特异引物设计，所述DNA片段两端各舍弃数个碱基，设计的扩增引物对序列为5'-CTCTGCCCTACATCTAATCTGC-3'和5'-CCCAAGCTACATTGACAATGATAG-3'。

用上述特异PCR扩增引物对Finc-W-90和H-W、G-W和GC-W进行SCAR-PCR扩增。扩增体系：总体积25μL，模板(20-30ng/μL)1μL，真姬菇Finc-W-90菌株检测特异引物对(0.5pmol/μL)各0.5μL，dNTP mix(10mMeach)0.5μL，10×Taq Buffer2.5μL，MgCl₂(25mM)2.0μL，Taq酶(5U/μL)0.25μL，加水至25μL。PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃1min35个循环；72℃延伸5min。

取上述PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，进行琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像仪上照相，其结果请参阅图7电泳图谱。

从图7可知，只有本发明真姬菇Finc-W-90有专一扩增条带，而其他三种真姬菇H-W、G-W和GC-W均无扩增条带，由此说明5'-CTCTGCCCTACATCTAATCTGC-3'和5'-CCCAAGCTACATTGACAATGATAG-3'是Finc-W-90的SCAR分子标记引物。用该引物对所扩增出的DNA片段分子量为758bp，该758bp的特异DNA片段为本发明真姬菇Finc-W-90菌株的SCAR分子标记。

以上描述仅为本发明的实施例，谅能理解，在不偏离本发明构思的前提下，对本发明的简单修改和替换皆应包含在本发明的技术构思之内。

Claims (1)

1.一种纯白色真姬菇菌株Finc-W-227，其保藏编号是CCTCCNO:M 2012377。