JP2000217581A - アブラヤシ土壌病害ガノデルマ属菌を検出するためのオリゴヌクレオチド及び方法 - Google Patents
アブラヤシ土壌病害ガノデルマ属菌を検出するためのオリゴヌクレオチド及び方法Info
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- JP2000217581A JP2000217581A JP11024566A JP2456699A JP2000217581A JP 2000217581 A JP2000217581 A JP 2000217581A JP 11024566 A JP11024566 A JP 11024566A JP 2456699 A JP2456699 A JP 2456699A JP 2000217581 A JP2000217581 A JP 2000217581A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アブラヤシの土壌病害菌であるガノデルマ属
菌を他のガノデルマ属菌から選択的に識別、検出するた
めのオリゴヌクレオチド及び方法を提供すること。 【解決手段】 アブラヤシの土壌病害菌であるガノデル
マ属菌を他のガノデルマ属菌から選択的に識別するため
の、配列番号１に示す塩基配列中少なくとも10塩基、好
ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは15〜25塩基
からなる配列、あるいは該配列において1若しくは数個
の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された該選択的識別
を可能とする配列、を含むオリゴヌクレオチド、並び
に、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用す
るポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子増幅が検出された
微生物をアブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌として識
別する、アブラヤシ土壌病害ガノデルマ属菌の検出方
法。
菌を他のガノデルマ属菌から選択的に識別、検出するた
めのオリゴヌクレオチド及び方法を提供すること。 【解決手段】 アブラヤシの土壌病害菌であるガノデル
マ属菌を他のガノデルマ属菌から選択的に識別するため
の、配列番号１に示す塩基配列中少なくとも10塩基、好
ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは15〜25塩基
からなる配列、あるいは該配列において1若しくは数個
の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された該選択的識別
を可能とする配列、を含むオリゴヌクレオチド、並び
に、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用す
るポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子増幅が検出された
微生物をアブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌として識
別する、アブラヤシ土壌病害ガノデルマ属菌の検出方
法。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、アブラヤシ（Elae
is guineensis）土壌病害菌であるガノデルマ（Ganoder
ma）属菌を検出するためのオリゴヌクレオチド又は方法
に関する。
is guineensis）土壌病害菌であるガノデルマ（Ganoder
ma）属菌を検出するためのオリゴヌクレオチド又は方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】アブラヤシはマレイシア、インドネシア
などの熱帯諸国の主要な油糧植物資源である。アブラヤ
シの植物油脂生産性は４〜７トン/ha/年と高く、世界総
生産量も1997年で大豆油の2010万トンに次いで1740万ト
ンにも達する。そのうちの910万トンをマレイシアが、5
00万トンをインドネシアが生産する。
などの熱帯諸国の主要な油糧植物資源である。アブラヤ
シの植物油脂生産性は４〜７トン/ha/年と高く、世界総
生産量も1997年で大豆油の2010万トンに次いで1740万ト
ンにも達する。そのうちの910万トンをマレイシアが、5
00万トンをインドネシアが生産する。
【０００３】ところでこれらの諸国では近年、Basal St
em Rotというアブラヤシの土壌病害が問題となってい
る。Basal Stem Rotは土壌微生物による根部の感染に始
まり、やがて患部が根から茎に広がり、葉も枯れる病気
である。病害感染の有効な検出方法がなく、感染が認識
されたときには薬剤投与や外科的治療も役にたたないの
で有効な処置方法もない。このため、一旦感染すると病
気の進行とともに油脂の生産性が低下し、ついには木が
枯れるために経済的な損失が大きい。
em Rotというアブラヤシの土壌病害が問題となってい
る。Basal Stem Rotは土壌微生物による根部の感染に始
まり、やがて患部が根から茎に広がり、葉も枯れる病気
である。病害感染の有効な検出方法がなく、感染が認識
されたときには薬剤投与や外科的治療も役にたたないの
で有効な処置方法もない。このため、一旦感染すると病
気の進行とともに油脂の生産性が低下し、ついには木が
枯れるために経済的な損失が大きい。
【０００４】このBasal Stem Rotを引き起こす病害菌の
１つはガノデルマ・ボニネンス（Ganoderma boninens
e）と同定されている。ガノデルマ・ボニネンスは土壌
中に他のガノデルマ属菌と同様に存在することが推定さ
れ、アブラヤシの根部と接触した後に感染することが知
られている。
１つはガノデルマ・ボニネンス（Ganoderma boninens
e）と同定されている。ガノデルマ・ボニネンスは土壌
中に他のガノデルマ属菌と同様に存在することが推定さ
れ、アブラヤシの根部と接触した後に感染することが知
られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記の状況下にあって
アブラヤシの土壌病害感染を早期に検出することは、感
染の進行を食い止めるうえで極めて有益である。したが
って本発明は、アブラヤシ土壌病害ガノデルマ属菌を他
のガノデルマ属菌と識別し検出するための、高感度で選
択的な方法を提供することを目的とする。本発明はさら
に、前記方法で使用するためのオリゴヌクレオチドを提
供することを目的とする。
アブラヤシの土壌病害感染を早期に検出することは、感
染の進行を食い止めるうえで極めて有益である。したが
って本発明は、アブラヤシ土壌病害ガノデルマ属菌を他
のガノデルマ属菌と識別し検出するための、高感度で選
択的な方法を提供することを目的とする。本発明はさら
に、前記方法で使用するためのオリゴヌクレオチドを提
供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、アブラヤシの
土壌病害菌であるガノデルマ属菌を他のガノデルマ属菌
から選択的に識別し得る、配列表（後記）記載の配列番
号１に示す塩基配列:5'-TATAGATCGTGTGGAGCGAGCTCGTTCG
TTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'中少なくとも10塩
基、好ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは15〜
25塩基からなる配列、あるいはそれらの配列において１
若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された
該選択的識別を可能とする配列を含むオリゴヌクレオチ
ドを提供する。
土壌病害菌であるガノデルマ属菌を他のガノデルマ属菌
から選択的に識別し得る、配列表（後記）記載の配列番
号１に示す塩基配列:5'-TATAGATCGTGTGGAGCGAGCTCGTTCG
TTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'中少なくとも10塩
基、好ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは15〜
25塩基からなる配列、あるいはそれらの配列において１
若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された
該選択的識別を可能とする配列を含むオリゴヌクレオチ
ドを提供する。
【０００７】本発明の実施態様において、オリゴヌクレ
オチドは 5'-CGTTCGTTTGACGAGTTTGC-3' （配列番号２）、 5'-TCGTTTGACGAGTTTGCGAA-3' （配列番号３）及び 5'-GAGTTTGCGAACGCGTCT-3' （配列番号４） からなる配列を有するものであるが、これらに限定され
ない。また本発明の別の実施態様において、アブラヤシ
の土壌病害菌であるガノデルマ属菌はガノデルマ・ボニ
ネンス株又はそれと同等若しくは実質的に同等の性質を
もつガノデルマ属の菌株である。
オチドは 5'-CGTTCGTTTGACGAGTTTGC-3' （配列番号２）、 5'-TCGTTTGACGAGTTTGCGAA-3' （配列番号３）及び 5'-GAGTTTGCGAACGCGTCT-3' （配列番号４） からなる配列を有するものであるが、これらに限定され
ない。また本発明の別の実施態様において、アブラヤシ
の土壌病害菌であるガノデルマ属菌はガノデルマ・ボニ
ネンス株又はそれと同等若しくは実質的に同等の性質を
もつガノデルマ属の菌株である。
【０００８】本発明はまた、ガノデルマ属菌から抽出し
た遺伝子を、上記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして使用するポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）に掛けて、遺伝子増幅が検出された微生物を
アブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌として識別する、
アブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌の検出方法にも関
する。
た遺伝子を、上記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして使用するポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）に掛けて、遺伝子増幅が検出された微生物を
アブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌として識別する、
アブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌の検出方法にも関
する。
【０００９】本発明の方法においては、 5'-GGTTGGTTTCTTTTCCT-3'（配列番号５）、 5'-TACTACCACCAAGATCT-3'（配列番号６）又は 5'-ACTTCAAGCGTTTCCCTTT-3'（配列番号７） に示す配列を逆方向プライマーとしてさらに使用するこ
とができる。たとえば、配列番号２と５、配列番号３と
６、又は配列番号４と７に示すいずれかの組の塩基配列
を順方向及び逆方向プライマーとして使用することがで
きるが、配列番号２と配列番号６又は７のように組合わ
せを変えてもよい。本発明の別の実施態様において、検
出されるガノデルマ属菌がガノデルマ・ボニネンス株又
はそれと同等若しくは実質的に同等の性質をもつガノデ
ルマ属の菌株である。
とができる。たとえば、配列番号２と５、配列番号３と
６、又は配列番号４と７に示すいずれかの組の塩基配列
を順方向及び逆方向プライマーとして使用することがで
きるが、配列番号２と配列番号６又は７のように組合わ
せを変えてもよい。本発明の別の実施態様において、検
出されるガノデルマ属菌がガノデルマ・ボニネンス株又
はそれと同等若しくは実質的に同等の性質をもつガノデ
ルマ属の菌株である。
【００１０】
【発明の実施の態様】本発明のオリゴヌクレオチドは、
アブラヤシの土壌病害菌であるガノデルマ属菌を他のガ
ノデルマ属菌から選択的に識別することが可能であると
いう特徴を有し、たとえば以下のようにして決定され
る。ガノデルマ・ボニネンス株、具体的にはマレイシア
で分離されたガノデルマ・ボニネンス９株及び東京都小
笠原で分離されたガノデルマ・ボニネンスＭＡＦＦ−30
5601株、を液体培養（Boysen, M. et al. (1996) "Iden
tification at strain level of Rhizoctonia solani A
G4 isolates by direct sequence of asymmetric PCR p
roducts of the ITS regions" Curr. Genet. 29:174-18
1）し、それらの菌糸から定法により遺伝子を抽出し、
次に、抽出遺伝子にリボソームＤＮＡのスペーサー領域
であるＩＴＳ１及びＩＴＳ２増幅用プライマー： 順方向： 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（配列番号８；ITS1） 逆方向： 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' （配列番号９；ITS4） を加えてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅（Whit
e, T.J. et al. (1990)"Amplification and direct seq
uencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogen
etics. In: PCR protocols: A Guide to Methods and A
pplications" pp.315-322, Academic Press, San Dieg
o, CA）した後、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２領域の全塩基配
列を決定し、これらの塩基配列と、マレイシアで分離さ
れた他のガノデルマ属菌（GanodermaＭ1株及びGanoderm
aＭ2株）、菌株保存機関から取り寄せたガノデルマ属菌
（GanodermaＩＦＯ−6498及びGanodermaＩＦＯ−834
6）、及びデータバンクに登録された他のガノデルマ属
菌株（EMBL受託番号(ITS1/ITS2)、種名、菌株名の順
に、X78743/X78764,Ganoderma lucidum, RSH RZ; X7874
4/X78765,G. lucidum, ATCC 32471; Z37059/X37084,G.
oerstedii, ATCC 52411; Z37047/Z37098,G. ahmadii, F
WP 14329; Z37055/Z37080, G. tsugae, ATCC 46754;Z37
061/Z37101,G. oregonense, ATCC 46750; X78737/X7875
8,G. resinaceum, CBS 194.76; X78738/X78759,G. pfei
fferi, CBS 747.84）のリボソームＤＮＡのＩＴＳ１及
びＩＴＳ２領域の全塩基配列並びに文献記載の塩基配列
（Moncalvo, J.M. et al. (1995) "Phylogenetic relat
ionships in Ganoderma inferred fromthe internal tr
anscribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences"
Mycologia 87:223-238）と整列比較し、ガノデルマ・
ボニネンスに特異的な実質的に保存された配列を見出
し、この塩基配列に基いて下記のオリゴヌクレオチドを
アブラヤシ土壌病害ガノデルマ属菌に選択的なプライマ
ーとして設計する。
アブラヤシの土壌病害菌であるガノデルマ属菌を他のガ
ノデルマ属菌から選択的に識別することが可能であると
いう特徴を有し、たとえば以下のようにして決定され
る。ガノデルマ・ボニネンス株、具体的にはマレイシア
で分離されたガノデルマ・ボニネンス９株及び東京都小
笠原で分離されたガノデルマ・ボニネンスＭＡＦＦ−30
5601株、を液体培養（Boysen, M. et al. (1996) "Iden
tification at strain level of Rhizoctonia solani A
G4 isolates by direct sequence of asymmetric PCR p
roducts of the ITS regions" Curr. Genet. 29:174-18
1）し、それらの菌糸から定法により遺伝子を抽出し、
次に、抽出遺伝子にリボソームＤＮＡのスペーサー領域
であるＩＴＳ１及びＩＴＳ２増幅用プライマー： 順方向： 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（配列番号８；ITS1） 逆方向： 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' （配列番号９；ITS4） を加えてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅（Whit
e, T.J. et al. (1990)"Amplification and direct seq
uencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogen
etics. In: PCR protocols: A Guide to Methods and A
pplications" pp.315-322, Academic Press, San Dieg
o, CA）した後、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２領域の全塩基配
列を決定し、これらの塩基配列と、マレイシアで分離さ
れた他のガノデルマ属菌（GanodermaＭ1株及びGanoderm
aＭ2株）、菌株保存機関から取り寄せたガノデルマ属菌
（GanodermaＩＦＯ−6498及びGanodermaＩＦＯ−834
6）、及びデータバンクに登録された他のガノデルマ属
菌株（EMBL受託番号(ITS1/ITS2)、種名、菌株名の順
に、X78743/X78764,Ganoderma lucidum, RSH RZ; X7874
4/X78765,G. lucidum, ATCC 32471; Z37059/X37084,G.
oerstedii, ATCC 52411; Z37047/Z37098,G. ahmadii, F
WP 14329; Z37055/Z37080, G. tsugae, ATCC 46754;Z37
061/Z37101,G. oregonense, ATCC 46750; X78737/X7875
8,G. resinaceum, CBS 194.76; X78738/X78759,G. pfei
fferi, CBS 747.84）のリボソームＤＮＡのＩＴＳ１及
びＩＴＳ２領域の全塩基配列並びに文献記載の塩基配列
（Moncalvo, J.M. et al. (1995) "Phylogenetic relat
ionships in Ganoderma inferred fromthe internal tr
anscribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences"
Mycologia 87:223-238）と整列比較し、ガノデルマ・
ボニネンスに特異的な実質的に保存された配列を見出
し、この塩基配列に基いて下記のオリゴヌクレオチドを
アブラヤシ土壌病害ガノデルマ属菌に選択的なプライマ
ーとして設計する。
【００１１】このときガノデルマ・ボニネンスの培養は
次のようにして行うことができる。すなわちPSB（potat
o sucrose broth）又はCM(完全培地：yeast extract, m
altextract, sucrose各５ｇ/L)液体培地（Boysen et a
l., 1996,上掲）で菌そうがペトリ皿の全面を覆う程度
に伸長するまで25℃、暗黒条件で約１週間静置培養し、
ブフナーロート等を用いて菌体を回収し、蒸留水で数回
洗浄後、余分な水分を吸引等で除いて乾燥する。次に設
計されたプライマーを用いて、ガノデルマ属菌からの抽
出遺伝子のリボソームＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アブラ
ヤシの土壌病害菌であるガノデルマ属菌（たとえばガノ
デルマ・ボニネンス株）由来の遺伝子のみを増幅し検出
することができるプライマーを選択する。
次のようにして行うことができる。すなわちPSB（potat
o sucrose broth）又はCM(完全培地：yeast extract, m
altextract, sucrose各５ｇ/L)液体培地（Boysen et a
l., 1996,上掲）で菌そうがペトリ皿の全面を覆う程度
に伸長するまで25℃、暗黒条件で約１週間静置培養し、
ブフナーロート等を用いて菌体を回収し、蒸留水で数回
洗浄後、余分な水分を吸引等で除いて乾燥する。次に設
計されたプライマーを用いて、ガノデルマ属菌からの抽
出遺伝子のリボソームＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アブラ
ヤシの土壌病害菌であるガノデルマ属菌（たとえばガノ
デルマ・ボニネンス株）由来の遺伝子のみを増幅し検出
することができるプライマーを選択する。
【００１２】上記方法によって、アブラヤシ土壌病害ガ
ノデルマ属菌の識別に有効な配列として、該菌のリボソ
ームＤＮＡの18Ｓと5.8Ｓの間のスペーサー領域に基く
配列番号１に示す下記の配列：5'-TATAGATCGTGTGGAGCGA
GCTCGTTCGTTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'を見出し
た。この配列中少なくとも10塩基、好ましくは少なくと
も15塩基、より好ましくは15〜25塩基からなる配列をも
つプライマーを作製し、それを用いるＰＣＲによってア
ブラヤシの土壌病害菌であるガノデルマ・ボニネンス株
を他のガノデルマ属菌から選択的に識別することが可能
である。たとえば以下のプライマー配列を挙げることが
できる。
ノデルマ属菌の識別に有効な配列として、該菌のリボソ
ームＤＮＡの18Ｓと5.8Ｓの間のスペーサー領域に基く
配列番号１に示す下記の配列：5'-TATAGATCGTGTGGAGCGA
GCTCGTTCGTTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'を見出し
た。この配列中少なくとも10塩基、好ましくは少なくと
も15塩基、より好ましくは15〜25塩基からなる配列をも
つプライマーを作製し、それを用いるＰＣＲによってア
ブラヤシの土壌病害菌であるガノデルマ・ボニネンス株
を他のガノデルマ属菌から選択的に識別することが可能
である。たとえば以下のプライマー配列を挙げることが
できる。
【００１３】 PRIMER PER44123: 5'-CGTTCGTTTGACGAGTTTGC-3'（配列番号２） PRIMER PER44126: 5'-TCGTTTGACGAGTTTGCGAA-3'（配列番号３） PRIMER PER44135: 5'-GAGTTTGCGAACGCGTCT-3' (配列番号４) 後述の実施例で証明されるように、上記プライマーは、
ガノデルマ・ボニネンス株であるPahang118、Selangor8
3、PP28、M3、Johor 200及びPerak 44（以上、マレイシ
ア・パーム油研究所で保有）並びにMAFF-305601（農林
水産省生物資源研究所で保有）のリボソームＤＮＡを選
択的に遺伝子増幅することができる。
ガノデルマ・ボニネンス株であるPahang118、Selangor8
3、PP28、M3、Johor 200及びPerak 44（以上、マレイシ
ア・パーム油研究所で保有）並びにMAFF-305601（農林
水産省生物資源研究所で保有）のリボソームＤＮＡを選
択的に遺伝子増幅することができる。
【００１４】本発明のオリゴヌクレオチドはホスフォロ
アミダイト法（Tanaka, T. and Letsinger, R.L. (198
2) Nucl. Acids Res., 10:3249-3260; Sinha, N.D. et
al. (1984) Nucl. Acids Res., 12:4539-4557）を利用
する化学合成法、特にこの方法を利用した自動ＤＮＡ合
成機（たとえばパーキンエルマー製のModel 394;ベック
マン製のOligo 1000Mなど）によって合成可能である。
合成は基本的には、固相上のヌクレオチドの5'-水酸基
の脱保護、付加するホスフォロアミダイト体の活性化、
固相上のヌクレオチドと活性化ホスフォロアミダイト体
との縮合、未反応の固相上のヌクレオチドのキャッピン
グ、縮合後のヌクレオチドの酸化の５ステップからな
る。得られたオリゴヌクレオチドの精製はアガロース又
はアクリルアミド電気泳動法、高速液体クロマトグラフ
ィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相分配クロ
マトグラフィー等によって行うことができる。オリゴヌ
クレオチドの量は、通常１ｍｌ溶液中のオリゴヌクレオ
チドの260nmの吸光度からOD260units/mlで求めることが
できる。１OD260 unitあたり約33μｇである。
アミダイト法（Tanaka, T. and Letsinger, R.L. (198
2) Nucl. Acids Res., 10:3249-3260; Sinha, N.D. et
al. (1984) Nucl. Acids Res., 12:4539-4557）を利用
する化学合成法、特にこの方法を利用した自動ＤＮＡ合
成機（たとえばパーキンエルマー製のModel 394;ベック
マン製のOligo 1000Mなど）によって合成可能である。
合成は基本的には、固相上のヌクレオチドの5'-水酸基
の脱保護、付加するホスフォロアミダイト体の活性化、
固相上のヌクレオチドと活性化ホスフォロアミダイト体
との縮合、未反応の固相上のヌクレオチドのキャッピン
グ、縮合後のヌクレオチドの酸化の５ステップからな
る。得られたオリゴヌクレオチドの精製はアガロース又
はアクリルアミド電気泳動法、高速液体クロマトグラフ
ィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相分配クロ
マトグラフィー等によって行うことができる。オリゴヌ
クレオチドの量は、通常１ｍｌ溶液中のオリゴヌクレオ
チドの260nmの吸光度からOD260units/mlで求めることが
できる。１OD260 unitあたり約33μｇである。
【００１５】本発明にはさらに、上記の選択的な識別を
可能とする限り配列番号１中少なくとも10塩基、好まし
くは少なくとも15塩基、より好ましくは15〜25塩基から
なる配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、
挿入又は付加された配列を有するオリゴヌクレオチドも
包含される。このような改変配列を含むプライマーは上
記のＤＮＡ合成技術又は部位特異的突然変異法（PROTOC
OLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Third Ed.) A Compendium
of Methods from Current Protocols in Molecular Bio
logy, Ausbel, F.M. et al., John Wiley & Sons, In
c.）を用いて作製することができる。
可能とする限り配列番号１中少なくとも10塩基、好まし
くは少なくとも15塩基、より好ましくは15〜25塩基から
なる配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、
挿入又は付加された配列を有するオリゴヌクレオチドも
包含される。このような改変配列を含むプライマーは上
記のＤＮＡ合成技術又は部位特異的突然変異法（PROTOC
OLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Third Ed.) A Compendium
of Methods from Current Protocols in Molecular Bio
logy, Ausbel, F.M. et al., John Wiley & Sons, In
c.）を用いて作製することができる。
【００１６】本発明により、上記のオリゴヌクレオチド
をプライマーとして使用して、ガノデルマ属菌から抽出
した遺伝子をＰＣＲに掛け、遺伝子増幅が検出された微
生物をアブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌として識別
することができる。ガノデルマ菌からのＤＮＡの抽出は
たとえば、病害感染が疑われるアブラヤシの茎地際部及
び根部からガノデルマ属菌を分離し、該菌を培養（上記
参照）し、菌糸を物理的（たとえばボールミル、ホモジ
ナイザー使用、液体窒素中での摩砕）又は化学的（たと
えばセルラーゼ、DNA抽出バッファー（150mM NaCl, 10m
M Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA, 0.1% SDS）使用）処
理によって破壊した後、フェノール/クロロホルム処
理、エタノール沈殿を含む一般的方法により行うことが
できる。あるいは、アブラヤシの茎地際部及び根部の植
物組織を液体窒素中で粉砕し緩衝液（100 mM NaCl, 30
mM Tris-HCl, 10 mMβ-メルカプトエタノール, pH 8.0,
0.5% (v/v) Nonidet P-40TM添加）で抽出する方法によ
ってもガノデルマ菌由来のDNAを得ることができる。
をプライマーとして使用して、ガノデルマ属菌から抽出
した遺伝子をＰＣＲに掛け、遺伝子増幅が検出された微
生物をアブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌として識別
することができる。ガノデルマ菌からのＤＮＡの抽出は
たとえば、病害感染が疑われるアブラヤシの茎地際部及
び根部からガノデルマ属菌を分離し、該菌を培養（上記
参照）し、菌糸を物理的（たとえばボールミル、ホモジ
ナイザー使用、液体窒素中での摩砕）又は化学的（たと
えばセルラーゼ、DNA抽出バッファー（150mM NaCl, 10m
M Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA, 0.1% SDS）使用）処
理によって破壊した後、フェノール/クロロホルム処
理、エタノール沈殿を含む一般的方法により行うことが
できる。あるいは、アブラヤシの茎地際部及び根部の植
物組織を液体窒素中で粉砕し緩衝液（100 mM NaCl, 30
mM Tris-HCl, 10 mMβ-メルカプトエタノール, pH 8.0,
0.5% (v/v) Nonidet P-40TM添加）で抽出する方法によ
ってもガノデルマ菌由来のDNAを得ることができる。
【００１７】ＰＣＲは、抽出されたガノデルマ属菌ＤＮ
Ａを耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（たとえばTakara TaqTM
（宝酒造）、Ampli TaqTM（パーキンエルマー）等のTaq
DNAポリメラーゼ；Bst DNAポリメラーゼ（バイオラッ
ド）；Tth DNAポリメラーゼ（東洋紡）など）の存在
下、本発明のプライマーを用いてたとえば実施例（後
述）に記載のような条件、すなわち95℃で１分保持した
後、95℃で15〜30秒（変性）、42〜56℃で30秒〜１分
（アニーリング）、72℃で30秒〜１分（伸長）を１サイ
クルとして通常２０サイクル以上、好ましくは25〜35サ
イクル、反応を繰り返して行うことができる。具体的な
ＰＣＲは、ＤＮＡ0.1μｇにプライマーを各５pmole加
え、製造元の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに付属の緩衝液
中、最終マグネシウム濃度２ｍＭ、耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ約0.5〜１Ｕ（宝酒造社製のEx Taq DNAポリメラ
ーゼ使用の場合約0.6Ｕ）、dNTPs（NはＡ，Ｇ，Ｔ，Ｃ
である）の存在下で行うことができる。しかし、ＰＣＲ
条件は上記のものに限定されるものではない。ＰＣＲ条
件については、たとえばWhite, T.J. et al. (1990) "A
mplification and direct sequencing of fungal ribos
omal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocol
s: A Guide to Methods and Applications" pp.315-32
2,Academic Press, San Diego, CA、及び蛋白質核酸酵
素臨時増刊号「ＰＣＲ法最前線、基礎技術から応用ま
で」41巻5号1996年に記載される適する条件を適宜選択
して使用することもできる。
Ａを耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（たとえばTakara TaqTM
（宝酒造）、Ampli TaqTM（パーキンエルマー）等のTaq
DNAポリメラーゼ；Bst DNAポリメラーゼ（バイオラッ
ド）；Tth DNAポリメラーゼ（東洋紡）など）の存在
下、本発明のプライマーを用いてたとえば実施例（後
述）に記載のような条件、すなわち95℃で１分保持した
後、95℃で15〜30秒（変性）、42〜56℃で30秒〜１分
（アニーリング）、72℃で30秒〜１分（伸長）を１サイ
クルとして通常２０サイクル以上、好ましくは25〜35サ
イクル、反応を繰り返して行うことができる。具体的な
ＰＣＲは、ＤＮＡ0.1μｇにプライマーを各５pmole加
え、製造元の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに付属の緩衝液
中、最終マグネシウム濃度２ｍＭ、耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ約0.5〜１Ｕ（宝酒造社製のEx Taq DNAポリメラ
ーゼ使用の場合約0.6Ｕ）、dNTPs（NはＡ，Ｇ，Ｔ，Ｃ
である）の存在下で行うことができる。しかし、ＰＣＲ
条件は上記のものに限定されるものではない。ＰＣＲ条
件については、たとえばWhite, T.J. et al. (1990) "A
mplification and direct sequencing of fungal ribos
omal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocol
s: A Guide to Methods and Applications" pp.315-32
2,Academic Press, San Diego, CA、及び蛋白質核酸酵
素臨時増刊号「ＰＣＲ法最前線、基礎技術から応用ま
で」41巻5号1996年に記載される適する条件を適宜選択
して使用することもできる。
【００１８】ＰＣＲに際しては、配列番号２と５、配列
番号３と６、又は配列番号４と７に示されるいずれかの
組の塩基配列をそれぞれ順方向及び逆方向プライマーと
して使用することができる。しかし、配列番号２、３若
しくは４又はそれらの改変配列と組合わせて使用する逆
方向プライマー配列は配列番号５、６又は７のものに限
定されない。逆方向プライマー配列は、該技術分野で公
知のリボソームＤＮＡのスペーサー領域を増幅するのに
好都合な配列であり、たとえばVilgalys, R. and Heste
r, M. (1990) "Rapid genetic identification and map
ping of enzymatically amplified ribosomal DNA from
several Cryptococcus species" J. Bacteriol. 172:4
238-4246に記載される配列から選択することができる。
番号３と６、又は配列番号４と７に示されるいずれかの
組の塩基配列をそれぞれ順方向及び逆方向プライマーと
して使用することができる。しかし、配列番号２、３若
しくは４又はそれらの改変配列と組合わせて使用する逆
方向プライマー配列は配列番号５、６又は７のものに限
定されない。逆方向プライマー配列は、該技術分野で公
知のリボソームＤＮＡのスペーサー領域を増幅するのに
好都合な配列であり、たとえばVilgalys, R. and Heste
r, M. (1990) "Rapid genetic identification and map
ping of enzymatically amplified ribosomal DNA from
several Cryptococcus species" J. Bacteriol. 172:4
238-4246に記載される配列から選択することができる。
【００１９】ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動法、
アクリルアミドゲル電気泳動法などの公知の方法によっ
て検出することができる。すなわち、本発明のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって増幅され
る陽性の遺伝子はアブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌
であると判定される。一方、陰性の非増幅遺伝子は土壌
病害ガノデルマ属菌以外の真核微生物（非病害性ガノデ
ルマ属菌を含む）と判定され、土壌病害ガノデルマ属菌
とその他のガノデルマ属菌は区別される。本発明によっ
て検出されるガノデルマ属菌は、ガノデルマ・ボニネン
ス株、該株を親株としてそれから誘導される菌株、該株
と同等若しくは実質的に同等のアブラヤシ病害作用をも
つガノデルマ属菌などである。
アクリルアミドゲル電気泳動法などの公知の方法によっ
て検出することができる。すなわち、本発明のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって増幅され
る陽性の遺伝子はアブラヤシの土壌病害ガノデルマ属菌
であると判定される。一方、陰性の非増幅遺伝子は土壌
病害ガノデルマ属菌以外の真核微生物（非病害性ガノデ
ルマ属菌を含む）と判定され、土壌病害ガノデルマ属菌
とその他のガノデルマ属菌は区別される。本発明によっ
て検出されるガノデルマ属菌は、ガノデルマ・ボニネン
ス株、該株を親株としてそれから誘導される菌株、該株
と同等若しくは実質的に同等のアブラヤシ病害作用をも
つガノデルマ属菌などである。
【００２０】
【実施例】本発明を以下の実施例によってさらに詳細に
説明するが、本発明はそれらの実施例によって制限され
ないものとする。 ＜実施例１＞PRIMER PER44 123（配列番号２）及びプラ
イマーＬＲ1（5'-GGTTGGTTTCTTTTCCT-3';配列番号５）
各５pmoleを、各菌株から抽出したＤＮＡ（0.1μｇ）及
びＤＮＡポリメラーゼ溶液（Takara Ex TaqTM）(0.625
Ｕ)に加え、全容を25μｌとした。これを95℃で１分保
持した後に、95℃で30秒保持、50℃で30秒保持、72℃で
１分保持の３段階からなる反応サイクルを25回繰り返
し、72℃で３分保持の後４℃に冷却した。ここで得られ
たＰＣＲ産物10μｌをとりアガロースゲル電気泳動を行
って増幅断片を確認した。泳動緩衝液には１×TBE（最
終濃度：89mMトリス−ホウ酸、２ｍM EDTA（pH8.0））
を使用した。ゲルは１×TBEに1.5％アガロースを用い、
ミューピッド泳動槽（コスモバイオ（株））にて100V、
25分間電気泳動を行った。エチジウムブロミド染色して
増幅された遺伝子を確認した。その結果、表１に示す通
り試験した全てのガノデルマ・ボニネンス株のみが選択
的に増幅され検出された。
説明するが、本発明はそれらの実施例によって制限され
ないものとする。 ＜実施例１＞PRIMER PER44 123（配列番号２）及びプラ
イマーＬＲ1（5'-GGTTGGTTTCTTTTCCT-3';配列番号５）
各５pmoleを、各菌株から抽出したＤＮＡ（0.1μｇ）及
びＤＮＡポリメラーゼ溶液（Takara Ex TaqTM）(0.625
Ｕ)に加え、全容を25μｌとした。これを95℃で１分保
持した後に、95℃で30秒保持、50℃で30秒保持、72℃で
１分保持の３段階からなる反応サイクルを25回繰り返
し、72℃で３分保持の後４℃に冷却した。ここで得られ
たＰＣＲ産物10μｌをとりアガロースゲル電気泳動を行
って増幅断片を確認した。泳動緩衝液には１×TBE（最
終濃度：89mMトリス−ホウ酸、２ｍM EDTA（pH8.0））
を使用した。ゲルは１×TBEに1.5％アガロースを用い、
ミューピッド泳動槽（コスモバイオ（株））にて100V、
25分間電気泳動を行った。エチジウムブロミド染色して
増幅された遺伝子を確認した。その結果、表１に示す通
り試験した全てのガノデルマ・ボニネンス株のみが選択
的に増幅され検出された。
【００２１】
【表１】
【００２２】＜実施例２＞PRIMER PER44 126（配列番号
３）及びプライマーＬＲ７（5'- TACTACCACCAAGATCT -
3';配列番号６）各５pmoleを、各菌株から抽出したＤＮ
Ａ（0.1μｇ）及びＤＮＡポリメラーゼ溶液（Takara Ex
Taq）(0.625Ｕ)に加え、全容を25μｌとした。これを9
5℃で１分保持した後に、95℃で30秒保持、42℃で30秒
保持、72℃で30秒保持の３段階からなる反応サイクルを
25回繰り返し、72℃で１分保持の後４℃に冷却した。こ
こで得られたＰＣＲ産物について実施例１と同様にアガ
ロース電気泳動を行い染色して増幅された遺伝子を確認
した。その結果、表２に示す通り試験した全てのガノデ
ルマ・ボニネンス株のみが選択的に増幅され検出され
た。
３）及びプライマーＬＲ７（5'- TACTACCACCAAGATCT -
3';配列番号６）各５pmoleを、各菌株から抽出したＤＮ
Ａ（0.1μｇ）及びＤＮＡポリメラーゼ溶液（Takara Ex
Taq）(0.625Ｕ)に加え、全容を25μｌとした。これを9
5℃で１分保持した後に、95℃で30秒保持、42℃で30秒
保持、72℃で30秒保持の３段階からなる反応サイクルを
25回繰り返し、72℃で１分保持の後４℃に冷却した。こ
こで得られたＰＣＲ産物について実施例１と同様にアガ
ロース電気泳動を行い染色して増幅された遺伝子を確認
した。その結果、表２に示す通り試験した全てのガノデ
ルマ・ボニネンス株のみが選択的に増幅され検出され
た。
【００２３】
【表２】
【００２４】＜実施例３＞PRIMER PER44 135（配列番号
４）及びプライマーＬＲ21（5'- ACTTCAAGCGTTTCCCTTT-
3';配列番号７）各５pmoleを、各菌株から抽出したＤＮ
Ａ（0.1μｇ）及びＤＮＡポリメラーゼ溶液（Takara Ex
Taq）(0.625Ｕ)に加え、全容を25μｌとした。これを9
5℃で１分保持した後に、95℃で30秒保持、56℃で30秒
保持、72℃で30秒保持の３段階からなる反応サイクルを
25回繰り返し、72℃で１分保持の後４℃に冷却した。こ
こで得られたＰＣＲ産物について実施例１と同様にアガ
ロース電気泳動を行い染色して増幅された遺伝子を確認
した。その結果、表３に示す通り試験した全てのガノデ
ルマ・ボニネンス株のみが選択的に増幅され検出され
た。
４）及びプライマーＬＲ21（5'- ACTTCAAGCGTTTCCCTTT-
3';配列番号７）各５pmoleを、各菌株から抽出したＤＮ
Ａ（0.1μｇ）及びＤＮＡポリメラーゼ溶液（Takara Ex
Taq）(0.625Ｕ)に加え、全容を25μｌとした。これを9
5℃で１分保持した後に、95℃で30秒保持、56℃で30秒
保持、72℃で30秒保持の３段階からなる反応サイクルを
25回繰り返し、72℃で１分保持の後４℃に冷却した。こ
こで得られたＰＣＲ産物について実施例１と同様にアガ
ロース電気泳動を行い染色して増幅された遺伝子を確認
した。その結果、表３に示す通り試験した全てのガノデ
ルマ・ボニネンス株のみが選択的に増幅され検出され
た。
【００２５】
【表３】
【００２６】
【発明の効果】本発明により、アブラヤシの土壌病害ガ
ノデルマ属菌を他のガノデルマ属菌から選択的に識別、
検出することが可能となり、該菌類感染を早期に発見す
るうえで格別の作用効果を付与する。
ノデルマ属菌を他のガノデルマ属菌から選択的に識別、
検出することが可能となり、該菌類感染を早期に発見す
るうえで格別の作用効果を付与する。
【００２７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology <120> Origonucleotides and methods for detecting the genus Ganoderma being soil borne pathogen <130> 11900248 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 56 <212> DNA <213> Ganoderma boninense <400> 1 tatagatcgt gtggagcgag ctcgttcgtt tgacgagttt gcgaacgcgt ctgtgc 56 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Ganoderma boninense <400> 2 cgttcgtttg acgagtttgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Ganoderma boninense <400> 3 tcgtttgacg agtttgcgaa 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Ganoderma boninense <400> 4 gagtttgcga acgcgtct 18 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <300> <301> Vilgalys, R. and Hester, M. <302> Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species <303> J. Bacteriol. <304> 172 <306> 4238-4246 <307> 1990 <400> 5 ggttggtttc ttttcct 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <300> <301> Vilgalys, R. and Hester, M. <302> Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species <303> J. Bacteriol. <304> 172 <306> 4238-4246 <307> 1990 <400> 6 tactaccacc aagatct 17 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <300> <301> Vilgalys, R. and Hester, M. <302> Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species <303> J. Bacteriol. <304> 172 <306> 4238-4246 <307> 1990 <400> 7 acttcaagcg tttcccttt 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <300> <301> White, T.J. et al. <302> Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press <306> 315-322 <307> 1990 <400> 8 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <300> <301> White, T.J. et al. <302> Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press <306> 315-322 <307> 1990 ＜４００＞ ９ ｔｃｃｔｃｃｇｃｔｔ ａｔｔｇａｔａｔｇｃ
２０
２０
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１２月１０日（１９９９．１２．
１０）
１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、アブラヤシの
土壌病害菌であるガノデルマ属菌を他のガノデルマ属菌
から選択的に識別し得る、配列表（後記）記載の配列番
号１に示す塩基配列:5'-TATAGATCGTGTGGAGCGAGCTCGTTCG
TTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'からなる配列、ある
いはそれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠
失、置換、挿入又は付加された該選択的識別を可能とす
る配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。また、本
発明においては、上記の選択的に識別し得る配列番号１
に示す塩基配列中の連続する１５〜２５塩基からなる塩
基配列、あるいは該塩基配列において１若しくは数個の
塩基が欠失、置換、挿入又は付加された該選択的識別を
可能とする塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドを提供
する。
土壌病害菌であるガノデルマ属菌を他のガノデルマ属菌
から選択的に識別し得る、配列表（後記）記載の配列番
号１に示す塩基配列:5'-TATAGATCGTGTGGAGCGAGCTCGTTCG
TTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'からなる配列、ある
いはそれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠
失、置換、挿入又は付加された該選択的識別を可能とす
る配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。また、本
発明においては、上記の選択的に識別し得る配列番号１
に示す塩基配列中の連続する１５〜２５塩基からなる塩
基配列、あるいは該塩基配列において１若しくは数個の
塩基が欠失、置換、挿入又は付加された該選択的識別を
可能とする塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドを提供
する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】上記方法によって、アブラヤシ土壌病害ガ
ノデルマ属菌の識別に有効な配列として、該菌のリボソ
ームＤＮＡの18Ｓと5.8Ｓの間のスペーサー領域に基く
配列番号１に示す下記の配列：5'-TATAGATCGTGTGGAGCGA
GCTCGTTCGTTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'を見出し
た。この配列中の連続する少なくとも15塩基、より詳し
くは15〜25塩基からなる配列をもつプライマーを作製
し、それを用いるＰＣＲによってアブラヤシの土壌病害
菌であるガノデルマ・ボニネンス株を他のガノデルマ属
菌から選択的に識別することが可能である。たとえば、
以下のプライマー配列を挙げることができる。
ノデルマ属菌の識別に有効な配列として、該菌のリボソ
ームＤＮＡの18Ｓと5.8Ｓの間のスペーサー領域に基く
配列番号１に示す下記の配列：5'-TATAGATCGTGTGGAGCGA
GCTCGTTCGTTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'を見出し
た。この配列中の連続する少なくとも15塩基、より詳し
くは15〜25塩基からなる配列をもつプライマーを作製
し、それを用いるＰＣＲによってアブラヤシの土壌病害
菌であるガノデルマ・ボニネンス株を他のガノデルマ属
菌から選択的に識別することが可能である。たとえば、
以下のプライマー配列を挙げることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】本発明にはさらに、上記の選択的な識別を
可能とする限り配列番号１中の連続する少なくとも15塩
基、より詳しくは15〜25塩基からなる配列において１若
しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された配
列を有するオリゴヌクレオチドも包含される。このよう
な改変配列を含むプライマーは上記のＤＮＡ合成技術を
用いて作製することができる。また、改変配列を含むプ
ライマーが有効であることは、部位特異的突然変異法
（PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Third Ed.)A Comp
endium of Methods from Current Protocols in Molecu
lar Biology, Ausbel, F.M. et al., John Wiley & Son
s, Inc.）からも明らかである。 ─────────────────────────────────────────────────────
可能とする限り配列番号１中の連続する少なくとも15塩
基、より詳しくは15〜25塩基からなる配列において１若
しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された配
列を有するオリゴヌクレオチドも包含される。このよう
な改変配列を含むプライマーは上記のＤＮＡ合成技術を
用いて作製することができる。また、改変配列を含むプ
ライマーが有効であることは、部位特異的突然変異法
（PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Third Ed.)A Comp
endium of Methods from Current Protocols in Molecu
lar Biology, Ausbel, F.M. et al., John Wiley & Son
s, Inc.）からも明らかである。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年４月２８日（２０００．４．２
８）
８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、アブラヤシの
土壌病害菌であるガノデルマ属菌を他のガノデルマ属菌
から選択的に識別し得る、配列表（後記）記載の配列番
号１に示す塩基配列:5'-TATAGATCGTGTGGAGCGAGCTCGTTCG
TTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'からなる配列、ある
いはそれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠
失、置換、挿入又は付加された該選択的識別を可能とす
る配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。また、本
発明においては、上記の選択的に識別し得る配列番号１
に示す塩基配列中の連続する１５〜２５塩基からなる塩
基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
土壌病害菌であるガノデルマ属菌を他のガノデルマ属菌
から選択的に識別し得る、配列表（後記）記載の配列番
号１に示す塩基配列:5'-TATAGATCGTGTGGAGCGAGCTCGTTCG
TTTGACGAGTTTGCGAACGCGTCTGTGC-3'からなる配列、ある
いはそれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠
失、置換、挿入又は付加された該選択的識別を可能とす
る配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。また、本
発明においては、上記の選択的に識別し得る配列番号１
に示す塩基配列中の連続する１５〜２５塩基からなる塩
基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】本発明にはさらに、上記の選択的な識別を
可能とする限り配列番号１に示す塩基配列において１若
しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された配
列を有するオリゴヌクレオチドも包含される。このよう
な改変配列を含むプライマーは上記のＤＮＡ合成技術を
用いて作製することができる。また、改変配列を含むプ
ライマーが有効であることは、部位特異的突然変異法
（PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Third Ed.) A Com
pendium of Methods from Current Protocols inMolecu
lar Biology, Ausbel, F.M. et al., John Wiley & Son
s, Inc.）からも明らかである。
可能とする限り配列番号１に示す塩基配列において１若
しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された配
列を有するオリゴヌクレオチドも包含される。このよう
な改変配列を含むプライマーは上記のＤＮＡ合成技術を
用いて作製することができる。また、改変配列を含むプ
ライマーが有効であることは、部位特異的突然変異法
（PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Third Ed.) A Com
pendium of Methods from Current Protocols inMolecu
lar Biology, Ausbel, F.M. et al., John Wiley & Son
s, Inc.）からも明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 倉根 隆一郎 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 マルヅキ アザハリ マレーシア国 セランゴール ダラール エーサン，カジャン 43000，バンダール バル バンギ，ペルシアラン インステ ィチューシ，ナンバー６，パーム オイル リサーチ インスティチュート オブ マレーシア (72)発明者 イドリス アブセマン マレーシア国 セランゴール ダラール エーサン，カジャン 43000，バンダール バル バンギ，ペルシアラン インステ ィチューシ，ナンバー６，パーム オイル リサーチ インスティチュート オブ マレーシア (72)発明者 アリフィン ダルス マレーシア国 セランゴール ダラール エーサン，カジャン 43000，バンダール バル バンギ，ペルシアラン インステ ィチューシ，ナンバー６，パーム オイル リサーチ インスティチュート オブ マレーシア Ｆターム(参考） 4B024 AA07 BA80 CA03 CA09 DA11 HA12 4B063 QA01 QQ07 QQ19 QQ43 QR32 QR76 QS25
Claims (7)
- 【請求項１】 アブラヤシ（Elaeis guineensis）の土
壌病害菌であるガノデルマ（Ganoderma）属菌を他のガ
ノデルマ属菌から選択的に識別し得る、配列番号１に示
す塩基配列中少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも
15塩基、より好ましくは15〜25塩基からなる配列、ある
いは該配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置
換、挿入又は付加された該選択的識別を可能とする配
列、を含むオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 配列番号２、３又は４に示す塩基配列か
らなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 アブラヤシの土壌病害菌であるガノデル
マ属菌がガノデルマ・ボニネンス（Ganoderma boninens
e）株である、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項４】 ガノデルマ属菌から抽出した遺伝子を、
請求項１又は２に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして使用するポリメラーゼ連鎖反
応に掛けて、遺伝子増幅が検出された微生物をアブラヤ
シの土壌病害ガノデルマ属菌として識別する、該土壌病
害ガノデルマ属菌の検出方法。 - 【請求項５】 配列番号５、６又は７に示す塩基配列を
逆方向プライマーとしてさらに使用する、請求項４に記
載の方法。 - 【請求項６】 配列番号２と５、配列番号３と６、又は
配列番号４と７に示すいずれかの組の塩基配列を順方向
及び逆方向プライマーとして使用する、請求項５に記載
の方法。 - 【請求項７】 検出されるガノデルマ属菌がガノデルマ
・ボニネンス（Ganoderma boninense）株である、請求
項４〜６のいずれかに記載の方法。
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-
1999
- 1999-02-02 JP JP11024566A patent/JP3094098B2/ja not_active Expired - Lifetime
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