CN105779446B - 3-磷酸甘油酸激酶启动子和终止子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过扩增斯达氏油脂酵母3‑磷酸甘油酸激酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可广泛用于产油酵母中油脂酵母属(Lipomyces)及丝孢酵母属(Trichosporon)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本发明还涉及含有这些元件的DNA表达盒或重组载体，及利用相关元件构建油脂酵母属或丝孢酵母属基因工程菌株的方法及相应的菌株。

Description

3-磷酸甘油酸激酶启动子和终止子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)的启动子终止子及其用途，包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等。

背景技术

微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有卓越的生物合成能力，几乎能合成地球上所有的有机化学品。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其化合物的生产高效、快捷，具有反应条件温和、可控性强、易于大规模生产等特点，可作为一个优良的细胞工厂。

自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞内贮存超过其细胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯为主，具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等，其中产油酵母包括Lipomyces，Trichosporon， Rhodotorula，Candida，Cryptococcu和Yarrowia属中的某些菌株(Ratledge，C.and Wynn，J.P.Adv App1Microbiol，2002，51，1-51.)。利用微生物转化生物质资源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术，是形成化学品的石化资源替代品新的生产途径(赵宗保.中国生物工程杂志，2005，25，8-11.)。然而完全依赖于这些菌株固有的代谢途径，生产强度及性能往往达不到工业化要求。利用基因工程技术进一步优化或改变它们的代谢网络和表达调控网络，加快生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的种类，是构建优良工业化应用菌株的重要途径之一。虽然对于一些常规酵母的基因工程改造已经较为成熟(Alper，H.，and Stephanopoulos，G.Nat Rev Microbiol，2009，7， 715-723.)，但是对于这些非常规油脂酵母的遗传操作尚处于起步状态，许多酵母没有合适的基因操作平台。开发合适的基因操作方法，对于这些非常规微生物的应用意义重大。

油脂酵母属(Lipomyces)中的斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)是一株优良的产油酵母，它可以积累超过细胞干重60％以上的油脂(Zhao，X.，Kong，X. L.，Hua，Y.Y.，et al.Eur J Lipid Sci Tech，2008，110，405-412.)。它不仅具有底物利用范围广(Angerbauer，C.，Siebenhofer，M.，Mittelbach，M.，et al.Bioresour Technol， 2008，99，3051-3056；Liu，J.X.，Yue，Q.Y.，Gao，B.Y.，et al.Bioresour Technol，2012， 106，69-73.)，可调控性强等特点(武双.，华艳艳.，仲崇斌等.微生物学通报， 2008，35，200-203.)，还能够降解和利用除草剂等有毒物质(Nishimura，K.， Yamamoto，M.，Nakagomi，T.，etal.Appl Microbiol Biot，2002，58，848-852.)，是一株具有良好工业应用前景的菌株。但是至今为止，未见适合于斯达氏油脂酵母的启动子序列报道，也未见适用于斯达氏油脂酵母的遗传操作系统，这些都制约了靶向性的菌株改造。

丝孢酵母属(Trichosporon)中的皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)一般在一些工业废水、含酚类物质的废液及炼油厂附近被发现，具有很强的酚类化合物分解能力及重金属吸附能力(Anderson，J.J.，and Dagley，S.J Bacteriol，1980， 141，534-543；Yotova，L.，Tzibranska，I.，Tileva，F.，et al.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.， 2009，36，367-372.)；底物利用范围广(袁锦云，艾佐佐，张志斌，et al.生物工程学报，2011，27，453-460.)，同时能够同步利用五碳糖和六碳糖积累超过自身重量 40％以上的油脂(Hu，C.，Wu，S.，Wang，Q.，et al.Biotechnol Biofuels，2011，4，25.)。并且从其中分离出来的一些工业用酶，如一氧化氮还原酶(Zhang，L.，Takaya，N.， Kitazume，T.，et al.Eur J Biochem，2001，268，3198-3204.)，木聚糖酶(Liu，W.，Zhu， W.M.，Lu，Y.L.，et al.Process Biochem，1998，33，331-336.)等暗示着这类菌株良好的工业应用潜力。但是至今为止，未见适合于皮状丝孢酵母的启动子序列报道，也未见适用于斯达氏油脂酵母的内源启动子，这些都制约了靶向性的菌株改造。

虽然曾有人分离米根霉(Rhizopus oryzae)和丛枝菌根真菌(Glomus mosseae)的磷酸甘油酸激酶启动子用于丝状真菌(霉菌)的基因工程操作(US 6528636；US 6465635；Harrier，LA1.，Paterson，LJ.Curr Genet，2002，42(3)：169- 178.)，但这些启动子都不适用于斯达氏油脂酵母和皮状丝孢酵母。然而，启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此，分离能够在斯达氏油脂酵母和皮状丝孢酵母中启动报告基因表达的磷酸甘油酸激酶启动子成为目前研究的焦点。

发明内容

鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可通用于斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母中外源基因表达的启动子和终止子，及采用合适的转化技术对这两类酵母菌种进行改良的方法。

为实现本发明的目的，本发明人通过对斯达氏油脂酵母的基因组序列进行分析，获得糖酵解代谢途径的关键酶——3-磷酸甘油酸激酶的DNA序列，并进一步通过PCR技术从斯达氏油脂酵母染色体DNA中成功分离了包含有效启动子的DNA片段，采用合适的转化方法将含有pLsPGK启动子的外源DNA片段分别导入斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母中，成功实现了外源基因的表达，完成了本发明。

本发明成功分离了能够在斯达氏油脂酵母和皮状丝孢酵母中启动报告基因表达的斯达氏油脂酵母磷酸甘油酸激酶启动子，并构建了其表达载体。

具体讲，本发明包含下述实施方案(A)到(H)：

(A)本发明涉及一种具有斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段：

(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起1500bp以内的部分序列，

(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起 1500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或

(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

(B)本发明涉及一种来自斯达氏油脂酵母的DNA片段，所述DNA片段可作为终止子，并且：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列；或(2)具有可与如(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。

(C)本发明涉及一种可完成靶基因在斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母中转录起始和转录终止的DNA分子，它具有上述(A)所述的具有斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母转录启动子活性的DNA序列，或同时具有上述(A)所述的具有斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母转录启动子活性的DNA序列，和(B)所述的DNA片段，且(B)所述的DNA片段位于(A)所述的DNA序列的下游，与其相邻1-10000个核苷酸的DNA片段。

(D)本发明涉及一种可将靶基因与(A)-(C)所述的任一种DNA分子连接的DNA表达盒，以便于所述靶基因能够在斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸。优选地，所述目的基因的cDNA序列具有如SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列 (LsPGK cDNA)。

(E)本发明涉及一种携带(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一个的重组载体。所述载体可以是游离型载体或整合型载体，所述游离型载体例如，但不限于，pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212等，所述整合型载体为农杆菌介导的双元表达载体，例如，但不限于，pZPK或pPZP200等。

(F)本发明涉及将如(D)所述的DNA分子或如(E)所述的载体的转入油脂酵母属或丝孢酵母属菌株的转化方法。

(G)本发明涉及转入了如(D)所述的DNA表达盒或如(E)所述的重组载体的油脂酵母属或丝孢酵母属的基因工程菌株。

(H)本发明所涉及的3-磷酸甘油酸激酶(pLsPGK)启动子，其特征在于：其来源为斯达氏油脂酵母，可启动目的基因在油脂酵母属或丝孢酵母属菌株中的转录和表达，所述启动子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起1500bp以内的部分序列，(2)具有可与如 SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ IDNO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列；

本发明所述的LsPGKt终止子，其特征在于：其来源为斯达氏油脂酵母，可终止目的基因在油脂酵母属或丝孢酵母属菌株中的转录和表达，所述终止子： (1)具有如SEQ IDNO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可与如SEQ IDNO：2所示序列的全部或其DNA序列5’- 末端的部分序列杂交的、且保持转录终止子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：2所示序列具有50％以上同源性、且具有终止子活性的序列。

使用本发明的具有启动子活性的DNA分子和具有转录终止子活性的 DNA，可实现外源基因或内源基因在油脂酵母属或丝孢酵母属菌株中的表达。

本发明提供了用于油脂酵母属或丝孢酵母属菌株遗传工程改造的启动子、终止子和载体。为油脂酵母属或丝孢酵母属菌株开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型酵母菌株。

综上所述，本发明提供下述技术方案：

1.3-磷酸甘油酸激酶启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.第1项所述的3-磷酸甘油酸激酶启动子用于构建能够在油脂酵母属(Lipomyces)或者丝孢酵母属(Trichosporon)的酵母菌株中表达的重组表达载体的应用，其中克隆了包含所述磷酸甘油酸激酶启动子的重组表达载体的油脂酵母属或者丝孢酵母属酵母菌株构成油脂酵母属或者丝孢酵母属遗传操作系统。

3.一种DNA表达盒，其含有SEQ ID NO：1所示的3-磷酸甘油酸激酶启动子的核苷酸序列。

4.第3项所述的表达盒，其还含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQ ID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2之间为编码目的基因的开放阅读框架。

5.第4项所述的DNA表达盒，其特征在于：所述编码目的基因的开放阅读框架的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.一种包含第3-5项中任一项所述的DNA表达盒的重组载体。

7.第6项所述的重组载体，其特征在于：所述载体为游离型或者整合型载体。

8.第7项所述的重组载体，其中所述整合型载体为农杆菌介导的双元表达载体，例如pZPK或pPZP200，或者为携带有靶基因翼侧1500-4000碱基同源重组臂的同源重组载体，所述同源重组载体骨架或所述游离型载体选自 pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212等大肠杆菌克隆载体或酵母穿梭载体。

9.包含第6-8项中任一项所述的重组载体的宿主细胞。

10.第9项所述的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。

11.一种用于产油酵母遗传表达的表达系统，所述表达系统包含：

(1)能够在油脂酵母属或者丝孢酵母属菌株中表达的改良载体，所述改良载体通过在能够在油脂酵母属或者丝孢酵母属中整合表达或游离表达的质粒中插入SEQ ID NO：1所示的启动子序列和SEQ ID NO：2所示的终止子序列构建获得，其中SEQ ID NO：1所示的启动子序列位于SEQ ID NO：2所示的终止子序列的上游，SEQ ID NO：1所示的序列与SEQ IDNO：2所示的序列之间为多克隆位点，并且所述载体还包含选择性标记基因；

(2)目的基因开放阅读框序列，其能够可操作性地插入到(1)所述的改良载体中，并使所述目的基因与(1)所述的改良载体中的启动子和终止子符合阅读框地连接，和

(3)油脂酵母属或者丝孢酵母属菌株。

12.第11项的用于产油酵母遗传表达的表达系统，其中(1)所述的改良载体通过在能够在油脂酵母属或者丝孢酵母属中表达的质粒中插入SEQ ID NO：1所示的启动子序列和SEQ ID NO：2所示的终止子序列构建获得。

13.第12项的用于产油酵母遗传表达的表达系统，其中所述质粒为游离型或者整合型质粒，并且，其中所述整合型质粒为农杆菌介导的双元表达质粒，例如pZPK或pPZP200，并且，所述游离型质粒选自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t 或pYX212。

14.第11项的用于产油酵母遗传表达的表达系统，其中(3)所述的油脂酵母属菌株选自产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)，所述丝孢酵母属菌株选自产油丝孢酵母(Trichosporonoleaginosus)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans)、产孢丝孢酵母 (Trichosporon porosum)、白氏毛孢子菌(Trichosporonbeigelii)或乳头状丝孢酵母(Trichosporon capitatum)。

15.第11项的用于产油酵母遗传表达的表达系统，其中(2)所述的目的基因开放阅读框序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本领域技术人员应该理解，术语“表达系统”是指包括重组载体、待表达的目标蛋白的编码核苷酸序列、适合的宿主细胞或宿主菌株等的组合物体系，用来在所述宿主细胞或宿主菌株中表达所述目标蛋白。

本发明的有益效果是：

为油脂酵母属及丝孢酵母属的酵母菌提供了启动子、终止子遗传转化方法，将有力促进今后的油脂酵母属及丝孢酵母属酵母菌的菌株改良和代谢工程研究。

附图说明

图1表示LsPGK简并PCR产物(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准。

图2表示pLsPGK启动子DNA片段(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准。

图3表示LsPGKt终止子DNA片段(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准。

图4表示质粒PGKHYG的结构示意图，LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA 右边界。

图5表示使用HYG基因转化产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)CBS 944 后PCR鉴定结果，泳道M为分子量标准，泳道1-6分别表示不同的Hyg抗性转化子，WT表示野生型，+为阳性对照，-表示阴性对照。

图6表示HYG基因的表达检测——Western blot分析，泳道1-3为农杆菌介导转化产油油脂酵母CBS 944潮霉素转化子1-3号总蛋白；泳道4为作为阴性对照的出发菌株产油油脂酵母CBS 944总蛋白样品。

图7表示质粒URA3-PGKBLE的结构示意图。

图8表示使用BLE筛选标记敲除斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi) NRRL Y-11557 URA3基因的转化平板。

图9表示BLE抗性Ura3营养缺陷斯达氏油脂酵母重组菌株的转录水平表达分析——RT-PCR结果，泳道1-2为BLE抗性Ura3营养缺陷斯达氏油脂酵母 NRRL Y-11557重组菌株1-2，泳道3为对照菌株斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557。

图10表示PGKKAN-CpFAH的结构示意图。

图11表示重组油脂酵母属CBS 7729中油酸羟化酶Western blot分析，泳道1-3为重组油脂酵母属CBS 7729菌株1-3号总蛋白；泳道4为作为阴性对照的出发菌株油脂酵母属CBS 7729总蛋白样品。

图12表示使用BLE筛选标记转化产油丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus)ATCC 20509后PCR鉴定结果，泳道M为分子量标准，泳道1-6分别表示不同的Hyg抗性转化子，WT表示野生型，+为阳性对照。

图13显示3-磷酸甘油酸激酶的基因组DNA序列(碱基数1681)和相应外显子的编码氨基酸序列。

序列表说明

SEQ ID NO：1 LsPGK启动子，来源于斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)

SEQ ID NO：2 LsPGK终止子，来源于斯达氏油脂酵母

SEQ ID NO：3 LsPGK阅读框架

SEQ ID NO：4 LsPGK cDNA

SEQ ID NO：5 LsPGK氨基酸序列

SEQ ID NO：6 HYG

SEQ ID NO：7 pLsPGK-HYG-LsPGKt

SEQ ID NO：8 pURA3-URA3-URA3t

SEQ ID NO：9 BLE

SEQ ID NO：10 pURA3-PGKBLE-URA3t

SEQ ID NO：11 Kanmx

SEQ ID NO：12 CpFAH

SEQ ID NO：13 PGKKAN-CpFAH

SEQ ID NO：14 LB序列

SEQ ID NO：15 RB序列

SEQ ID NO：16 pLsPGK-orf-LsPGKt

具体实施方式

在本文中，“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还可理解为：包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。

启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法：将报告基因(如抗性基因)连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因是否表达。如果人们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。

在本文中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA 模板分离而使转录终止的一段DNA序列。可以通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而确定终止子的活性。

本发明中的“斯达氏油脂酵母”，包括属于该“物种”的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。本发明中的“油脂酵母属或丝孢酵母属”，没有具体限制，其实例包括归属于该属的真菌，除斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母外，还有如产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)，油脂酵母属(Lipomycessp.)其它物种，或者发酵性丝孢酵母 (Trichosporon fermentans)，产孢丝孢酵母(Trichosporon porosum)，产油丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus)，白氏毛孢子菌(Trichosporon beigelii)，乳头状丝孢酵母(Trichosporon capitatum)。

本发明的“目的基因”，包括能够在油脂酵母属或丝孢酵母属菌株中表达的蛋白编码序列、反义RNA编码序列和核酸酶编码序列。能够在油脂酵母属或丝孢酵母属菌株中表达的蛋白编码序列的例子包括源于这两类菌属中的蛋白或者核酸序列，且并不局限于此，还包括来源于其它微生物、植物和动物的蛋白或者核酸序列。本领域技术任意应该理解，当使用来源于其它微生物、植物和动物的蛋白编码序列作为目的基因(即，外源目的基因)时，为优化在油脂酵母属或丝孢酵母属菌株中的表达，通常需要针对油脂酵母属或丝孢酵母属菌株的密码子优先性对所述目的基因进行密码子优化。而密码子优化属于本领域的常规技术手段。

本发明中的启动子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起1500bp以内的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

本发明中的终止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列杂交的、且保持转录终止子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：2所示序列具有50％以上同源性、且具有终止子活性的序列。

本发明中的启动子-目的基因的构建体、目的基因-终止子的构建体或启动子-目的基因-终止子的构建体，可以直接或经载体介导转化脂酵母属或丝孢酵母属菌株，以便于目的基因表达，可以优选质粒载体作为介导载体。

本发明的启动子可以按照以下方面从斯达氏油脂酵母中分离。

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作，如无特别说明则均由大连TakaRa公司完成。

实施例1：斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)NRRL Y-11557总RNA的提取

将斯达氏油脂酵母(L.starkeyi)NRRL Y-11557(购自美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)，Bacterial Foodborne Pathogens&Mycology Research，1815N. UniversityStreet IL 61604.Peoria，Illinois)由斜面接种到50ml YEPD液体培养基 (葡萄糖20.0g/l，酵母提取物10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，pH 6.0)中，于30℃摇床培养24h，再以1∶50的体积比例将菌液分别转接到100ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养12h达对数生长期。在4℃下，5000rpm离心4min，收集菌体，用液氮迅速冷冻菌体，研磨破壁。使用TakaRa公司RNAiso试剂盒，并按照其标准步骤提取总RNA。

RNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的两条带。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝2.01，表明总RNA质量很好。总RNA样品冻存于-80℃，备用。

实施例2：斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557cDNA第一链合成和PGK简并PCR

以斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。首先，将1.0μl总RNA(约2μg)，1.0μl引物SMART IV： 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′和1.0μl oligo dT-接头引物CDSIII/3′：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) _30N-1N-3′，2.0μl DEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TakaRa公司)，加入到PCR管中混匀，于72℃保温2min，立即置于冰上冷却2min，将2.0μl 5×第一链缓冲液(Clontech公司)，1.0μl DTT(20mM)，1.0μl dNTP(10mM)， 1.0μlpowerscript反转录酶(Clontech公司)加入到体系中，混匀。于42℃延伸反应60min，最后4℃结束反应，存于-20℃，备用。

设计合成两条简并引物PGK-sense： 5′-ATGTCA(AGCT)TCA(AGCT)(CT)AA(AGCT)AAG(CT)TCG(ACT)CA-3′(括号内碱基在此位置随机出现，为简并碱基)和PGK-anti：5′-TTA(AGCT) TT(ACT)(AGCT)CG(AGCT)TCAA(AGCT)GCCGCGA-3′(括号内碱基在此位置随机出现，为简并碱基)，以反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PGK基因的简并PCR扩增，10×PCR缓冲液5.0μl，dNTPs(10mM)1.0μl，上游引物 (50mmol/l)1.0μl，下游引物(50mmol/l)1.0μl，rTaq酶(大连TakaRa) 0.5μl，合成的cDNA第一链模板1.0μl，ddH₂O 40.5μl，于94℃保温3min，然后于94℃30s，57℃45s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到1.2kb 左右的条带(图1)，利用DNA回收试剂盒(购自碧云天)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照大连TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T 载体(购自大连TakaRa)，转化入E.coli DH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，序列结果推测出的氨基酸序列经Blastp分析，证实为3-磷酸甘油酸激酶序列(LsPGK氨基酸序列)，如SEQ ID NO：5所示。 3-磷酸甘油酸激酶cDNA序列(LsPGK cDNA)如SEQ IDNO：4序列所示。

实施例3：斯达氏油脂酵母NRRLY-11557基因组DNA的扩增

斯达氏油脂酵母NRRLY-11557的基因组DNA提取采用玻璃珠破壁法(精编分子生物学实验指南第三版第13章，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)。制备好的基因组DNA，利用Nanodrop 1000测定，测得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.85，表明基因组DNA质量很好。浓度为120ng/μl，共500μl，基因组DNA样品冻存于-20℃，备用。

根据实施例2中获得的3-磷酸甘油酸激酶cDNA序列，设计1对基因特异性引物，PGK-p1：5’-ATGCTTAACCTCAAAGTATCTGTT-3’和PGK-p2： 5’-TTAGAACTTCTGCTCGACATCT-3’，以斯达氏油脂酵母NRRLY-11557的基因组DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，得到约1.6kb的PCR产物(未显示)。PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤回收、克隆到pMD18-T 载体，并进行测序，得到如序列表SEQ ID NO：3所示的DNA序列(LsPGK 阅读框架)。经与实施例2中获得的3-磷酸甘油酸激酶cDNA序列比对，证实该基因片段为其3-磷酸甘油酸激酶基因组DNA序列(gDNA)，其中含有7 个内含子和8个外显子。

实施例4：染色体步移获得LsPGK基因5’翼侧序列(启动子)

本实施例利用Genome Walking Kit(购自大连TakaRa)完成。

根据实施例3中得到的PGK DNA序列，设计3条基因特异性引物，分别为PGK-SP1：5’-CAATAAATTGATAATTGTCGCGATG-3’，PGK-SP2： 5’-CTAGACTGCGATTGCAACTTACC-3’和PGK-SP3：5’-CTCTTGTCCTTGAGATCGACGTCG-3’，做为下游引物，按照试剂盒说明书进行以下操作。

1.1^st PCR反应

以实施例3中精制的基因组DNA为模板，进行第一轮扩增。反应体系50μl： 10×LAPCR bufferⅡ(Mg²⁺plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0 μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1 Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，PGK-SP1(10μmol/l)1.0μl，斯达氏油脂酵母NRRLY-11557 基因组DNA模板(120ng/μl)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：先进行5 个高温退火温度的高特异性反应，然后进行1个极低退火温度的低特异性反应；然后进行热不对称PCR：2个高退火温度(65℃)的高特异性反应和1个低退火温度(44℃)的低特异性反应交替循环，共15次。具体参数如下：94℃1 min，98℃1min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，共5个循环；94℃30 s，25℃3min，72℃2min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30 s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

2.2^nd巢式PCR反应

反应体系50μl：10×LA PCR bufferⅡ(Mg²⁺plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1 Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，1^st PCR反应产物1.0μl，PGK-SP2 (10μmol/l)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃ 2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2 min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

3.3^rd巢式PCR反应

反应体系50μl：10×LA PCR bufferⅡ(Mg²⁺plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1 Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，2^nd巢式PCR反应产物1.0μl，PGK-SP3 (10μmol/l)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃ 2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2 min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

3^rd巢式PCR反应产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带(如图2所示)，利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa 公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp 抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，证实为预期的pLsPGK基因序列。

实施例5：染色体步移获得LsPGK基因3’翼侧序列(终止子)

本实施例也是利用Genome Walking Kit(购自大连TakaRa)完成。

根据实施例3中得到的PGK DNA序列，设计3条基因特异性引物，分别为PGK-SP11：5'-GTGGGGCGCCGAGGACAAGCTCTCG-3’，PGK-SP22： 5’-CGTCTCAACTGGAGGTGGCGCATCG-3’和PGK-SP33： 5’-GAGCTCCTTGAGGGCAAGGTACTCC-3’，做为上游引物，按照试剂盒说明书进行3’翼侧染色体步移操作，除Specific Primer分别由PGK-SP1，PGK-SP2， PGK-SP3依次更换为PGK-SP11，PGK-SP22，PGK-SP33外，其它同实施例4。

3^rd巢式PCR反应产物(如图3所示)利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化，经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，证实为预期的3-磷酸甘油酸激酶终止子(LsPGKt)基因序列。

实施例6：LsPGK启动子-开放阅读框架-终止子全长基因获得

根据实施例4和实施例5中获得的启动子和终止子序列，重新设计一对引物进行LsPGK“启动子-开放阅读框架-终止子”全长基因的扩增。pPGK-p2： 5’-TTTCTTGAAGGAGACGACTGGCAG-3’，PGKt-p2： 5’-GTATACATGCATGGATTTTGACCG-3’。以实施例3中制备的L.starkeyi NRRL Y-11557基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR体系(50μl)：10×Speed buffer(大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(10mmol/l)1.0μl，上游引物(10μmol/l) 2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa公司)0.5μl，基因组DNA模板(120ng/μl) 2μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃1.0min， 35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度) 琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，证实为预期的pLsPGKt (3-磷酸甘油酸激酶)基因全长序列，该重组载体命名为T-PGK。

实施例7：RF克隆法构建潮霉素蛋白表达盒PGKHYG

根据NCBI报道的HYG蛋白质序列委托上海生工公司全基因合成HYG基因(如SEQ IDNO：6所示)。以合成的基因为模板，参照文献方法(van den Ent， F，and Lowe，J.J BiochemBiophys Methods，2006，67，67-74.)，设计RF克隆引物： HYG-RF-p1：5’-ATCGTCATATTCGTGGTCTCTGACAATGCCGGA GCTCACGGCGACGTCGG-3′和HYG-RF-p2：5’-TTAGAATCCCAACAT TAACGGGAGCTATTCTTTCGCCCGCGGGCGCGT-3’为引物，进行PCR扩增。进行RF第一轮扩增。体系(50μl)：5×Prime buffer(大连TakaRa)10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l) 2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，T-GFPuv质粒(100 ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15 s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20℃保存备用。

RF II反应：5×Prime buffer(大连TakaRa)10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0 μl，实施例5中构建的T-PGK质粒(100ng/μl)1.0μl，本实施例前述步骤中 RF I反应产物(200ng/μl)5.0μl，PrimeSTAR^TMHS DNA聚合酶(大连TakaRa) 1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，68℃12min，之后95℃ 30s，65℃45s(-1℃/cyc)，68℃12min，15个循环，接下来再进行一轮： 95℃30s，55℃45s，68℃12min，20个循环，72℃10min，4℃结束反应。

DpnI消化和电击转化：取8μl RF Ⅱ反应产物加入1μl DpnI(购自New EnglandBiolabs)和1μl DpnI buffer，混匀后在37℃作用120min去除原T-PGK 质粒后，取2μl电击转化DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃，4-8ms。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物HYG-RF-p1和 HYG-RF-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送大连TakaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为PGK启动子和PGK终止子的PGKHYG表达盒，同时，该重组载体命名为T-PGKHYG。完整的PGKHYG表达盒如SEQ ID NO：7所示(pLsPGK-HYG-LsPGKt)。

实施例8：利用PGKHYG表达盒进行产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)CBS 944 酵母的转化

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种革兰氏阴性菌，在自然条件下可以通过病斑或伤口进入寄主组织，将其体内的一段DNA转入植物基因组中，最终刺激寄主发育不正常，在侵染部位形成冠瘿瘤，引发根癌病。农杆菌这种特性最早被应用于植物基因组的改造，称为ATMT技术。随后ATMT 技术广泛应用于多种真菌和酵母遗传改造。

ATMT转化过程大致可以分为载体构建、农杆菌活化、宿主材料制备、共转化和转化子筛选这五个步骤。首先在双元载体的T-DNA区域间插入合适的选择标记，并转入农杆菌；含有双元载体的农杆菌工程菌株活化后用乙酰丁香酮(AS)诱导；宿主菌株经过活化后稀释到一定的浓度；将活化并诱导后的农杆菌与宿主材料混合，涂布于铺有载体介质的共培养平板上，在适宜的温度下进行共转化；将共培养的混菌转移到筛选平板上，置于宿主菌最适宜的温度下培养，至转化子出现。

1.含有PGKHYG表达盒的双元载体pZPK-PGKHYG的构建

pZPK为实验室按照常规分子克隆方法自行构建。构建方法如下：

以pZPK-RF-P1： 5’-GTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCCATATTCAACGGGA-3′和pZPK-RF-P2：5’- GATTGTAACGATGACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATTAGAAAAACTCATCGAGCA-3′为引物从pET24b(+)(购自Novegen公司)上扩增获得卡那霉素 (KAN)抗性基因片段，而后利用RF克隆方法(如实施例3中所示)将pPZP200 载体(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))上的链霉素/壮观霉素(aadA) 抗性基因替换为KAN，所获得的载体命名为pZPK。

pZPK-PGKHYG载体的构建则采用PGKHYG-RF-P1： 5’-GAATTGAATTCGAGCTCGCTCGGTACCATGAAAGTTAAGAAACGGC GGG-3′和PGKHYG-RF-P2： 5’-GCTTGCATGCTGCAGGTCGACTCTAGATAGCATCTGATGAAAATTTG TCAC-3′为引物，以实施例7构建的T-PGKHYG为模板扩增获得PGKHYG片段，PCR胶回收后采用RF克隆方法(如实施例7中所示)将PGKHYG片段插入pZPK双元载体的LB和RB之间。所获得的载体命名为pZPK-PGKHYG，结构如图4所示。

2.含有pZPK-PGKHYG质粒的农杆菌工程菌株的构建

所获得的pZPK-PGKHYG双元载体采用电击转化法转化至根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciems)AGL1(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)) 中，于含有50ng/μl卡那霉素的LB平板上挑取转化子。农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子，提取其中的质粒，转化至大肠杆菌中。双元载体通过大肠杆菌大量富集后送测序验证。含有测序正确质粒的农杆菌菌株为工程菌株，

3.PGKHYG基因在产油油脂酵母CBS 944酵母中的表达

产油油脂酵母CBS 944购自酵母菌种保藏中心(CBS，荷兰真菌菌种保藏中心)。取一环活化后的产油油脂酵母CBS 944酵母，接于5ml YEPD(葡萄糖20.0g/l，酵母提取物10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，pH 6.0)培养液中，30℃， 200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD₆₀₀＝0.1-0.8，备用。含有pZPK-PGKHYG质粒的农杆菌活化后，接于5ml含有卡那霉素(50ng/μl) 和利福平(50ng/μl)的LB液体中，30℃，200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD₆₀₀＝0.1-1.6，备用。

取上述酵母及农杆菌稀释液各400μl，混匀，直接滴于诱导平板(5mmol/l 葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/l磷酸二氢钾，2.05g/l磷酸氢二钾，0.15g/l氯化钠， 0.5g/l七水硫酸镁，66mg/l二水氯化钙，2.48g/l七水硫酸铁，0.5g/l硫酸铵， 40mmol/lMES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，2％琼脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)上 (Bundock，P.，den Dulk-Ras，A.，Beijersbergen，A.，et al.EMBO J.，1995，14， 3206-3214.)，24-25℃，培养4天。用10ml左右的无菌水将混合菌苔洗下，3000 r/min离心5min，弃去上层主要含有农杆菌的液体，剩余的细胞用800μl无菌水重悬，取50-200μl涂布于筛选平板(含50ng/μL潮霉素和300μg/mL头孢菌素的YEPD)上，于30℃进行培养，直至转化子出现。

4.产油油脂酵母CBS 944潮霉素转化子的PCR鉴定

随机挑取6个潮霉素抗性产油油脂酵母转化子，接入含有50ng/μL潮霉素的YEPD(葡萄糖20.0g/l，酵母提取物10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，pH 6.0)液体中，于30℃摇床培养24h。参考实施例3中所述玻璃珠破壁法提取产油油脂酵母CBS 944基因组DNA，采用HYG-RF-p1和HYG-RF-p2为引物，进行PCR 鉴定。PCR体系(50μl)：5×Prime buffer(大连TakaRa)10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l) 4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，基因组DNA(20ng/μl)1μl，ddH₂O 加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min， 35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度) 琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图5所示。可见，外源HYG片段成功整合进入产油油脂酵母CBS 944基因组中。

5.产油油脂酵母CBS 944潮霉素转化子的Western blot分析

除了直接利用潮霉素抗性表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动潮霉素抗性基因在产油油脂酵母的表达外，由于潮霉素抗性基因表达产物的 C-端携带6×HisTag，还可利用抗His Tag抗体通过Western blot分析确定基因的表达。上述PCR鉴定正确的6个转化子，随机挑取3个转化子，接入10ml 含有50ng/μL潮霉素的YEPD液体中，于30℃摇床培养48h，4000r/min离心10min收集菌株。获得的菌体用无菌水洗涤一遍后，加入400ul的玻璃珠破菌缓冲液(20mmol/lTris-HC1，10mmol/l氯化镁，1mmol/lEDTA，5％甘油， 1mmol/lDTT，0.3mmol/l硫酸铵，1mmol/lPMSF)重悬，再加入同等体积的酸洗玻璃珠。采用玻璃珠破壁法破碎细胞提取细胞总蛋白(精编分子生物学实验指南第三版第13章，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)。细胞总蛋白在12％SDS-PAGE胶上进行分离后，转移到硝酸纤维素膜上(Solarbio， Beijing，China)，采用小鼠抗His-tag抗体(购自上海碧云天生物技术有限公司) 和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(购自上海碧云天生物技术有限公司)作为一抗和二抗，DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)进行显色，均可观察到潮霉素基因的表达(图6)。

实施例9：利用PGKBLE表达盒进行斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557的URA3 基因敲除兼BLE蛋白表达

在此利用斯达氏油脂酵母URA3基因作为整合位点，通过RF克隆方法，使得PGKBLE的5’和3’末端携带有约1500bp的斯达氏油脂酵母URA3基因同源重组臂，利用BLE抗性筛选标记进行转化子的筛选。

1.斯达氏油脂酵母URA3基因的获得

根据斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557基因组测序结果，寻找到URA3 (orotidine-5′-phosphate decarboxylase)基因，设计特异引物：URA3-P1： 5'-TGGCTCCAATGAGTCGTTGCTTCCAGCGC-3′和URA3-P2： 5'-CAAGGAGAGAGGCGTTAAGCCTAAAG-3’，以斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557基因组为模板，扩增获得含有URA3启动子、阅读框架和终止子的全长基因组序列。利用DNA回收试剂盒纯化PCR产物后，克隆到pMD18-T载体，转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，序列结果与基因组测序结果比对，证实包含URA3启动子，终止子和阅读框架的DNA序列(如SEQ ID NO：8所示，pURA3-URA3-URA3t)。该质粒命名为T-URA3。

2.RF克隆方法构建PGKBLE表达盒

以pPICZαA(购自Invitrogen)为模板，利用一对引物BLE-RF-p1： 5'-CATCGTCATATTCGTGGTCTCTGACAATGGCCAAGTTGACCAGTGCCG -3′和BLE-RF-p2：5'-TTTAGAATCCCAACATTAACGGGAGTCAGTCCTGCT CCTCGGCCACG-3’，进行PCR扩增。依照实施例3中所述的RF克隆方法，以T-PGK为骨架，将BLE(SEQ ID NO：9)插入pLsPGK和LsPGKt之间，构建成的质粒命名为T-PGKBLE。

3.URA3-PGKBLE敲除盒的构建

采用引物PGKBLE-RF-P1：5’-CTTGTCTTCTACAGTATATCCCTAAATTCAACATGAAAGTTAAGAAACGGCGGG-3′和PGKBLE-RF-P2： 5'-CTGCCCTTCACTCATCAATTACCAATAGCATCTGATGAAAATTTGTCAC -3’为引物，进行PCR扩增。依照实施例3中所述的RF克隆方法，以T-PGKBLE 为骨架，将PGKBLE插入LsURA3中，所得的序列经过Takara测序后如SEQ ID NO：10所示(pURA3-PGKBLE-URA3t)，构建成的质粒命名为 T-URA3-PGKBLE，结构如图7所示。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，序列结果与基因组测序结果比对，证实该基因片段为两段带有1500bp URA3 重组臂的PGKBLE敲除盒。

4.URA3-PGKBLE敲除盒的准备

以T-URA3-PGKBLE质粒为模板，以URA3-P1和URA3-P2为引物，进行 URA3-PGKBLE敲除盒的大量制备。PCR体系(500μl)：10×Speed buffer(大连TakaRa)50.0μl，dNTPs(10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶(扩增速度快，1 kb/10s，购自大连TakaRa公司)5.0μl，基因组DNA模板(120ng/μl)15.0μl， ddH₂O加至500μl，混匀后分装。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度为300ng/μl，共 50μl，-20℃保存备用。

5.斯达氏油脂酵母NRRLY-11557感受态细胞制备

斯达氏油脂酵母NRRLY-11557感受态细胞的制备：斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557(菌株挑菌落接种10ml YEPD培养基(葡萄糖20.0g/l，酵母提取物 10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，pH 6.0)，30℃，200rpm，培养20h；培养物1∶50比例转接新鲜YEPD培养基，100ml(500ml锥形瓶，装液量100ml)，30℃， 200rpm，培养6-9h，OD值达到0.6-1.2；培养物冰浴10-30min，4℃，4000r/min 离心5min，弃上清；0℃无菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗涤2 次；冰浴，备用。取100μl斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557感受态细胞，加入 URA3-PGKBLE表达盒10μl(总共3μg)，混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，参数：电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；涂布YEPD平板(含博来霉素50ng/μl)， 30℃培养5天以上。结果如图8所示。

6.转化子的菌落PCR鉴定

博来霉素抗性转化子接种10ml YEPD液体培养基(含博来霉素50ng/μl)。参照实施例3中玻璃珠破壁法提取基因组DNA，采用BLE-RF-p1和BLE-RF-p2 进行PCR鉴定。PCR体系(25μl)：10×Speed buffer(大连TakaRa)2.5μl， dNTPs(10mmol/l)0.5μl，上游引物(10μmol/l)1.0μl，下游引物(10μmol/l) 1.0μl，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa 公司)0.25μl，基因组DNA模板(100ng/μl)1.0μl，ddH₂O加至25μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。结果显示，所有斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557重组菌株均可扩增出外源BLE基因片段，而对照菌株斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557则无相应 PCR产物。

进一步对上述鉴定正确的转化子进行表型验证。结果显示：所有重组子在 YEPD液体培养基上，菌株正常生长。将同一转化子菌落接种在不含尿嘧啶的 SD培养基上，没有菌落形成。可见转化子获得了新表型，即：尿嘧啶营养缺陷型。5'-FOA抗性表型分析结果显示，此尿嘧啶营养缺陷型斯达氏油脂酵母工程菌株在含有5’-FOA的培养基(0.1％5’-FOA，葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.1 g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂ PO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，pH6.0)上培养，能够正常生长，而野生型的L.starkeyiNRRL Y-11557则在含有5’-FOA的培养基中无法生长。

因此，从基因型到表型，均验证斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557重组菌株 URA3基因的缺失。

7.Ble基因的表达分析(转录水平表达分析，RT-PCR)

除了直接利用博莱霉素抗性表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动博莱霉素抗性基因在斯达氏油脂酵母的表达(博莱霉素抗性表型决定于莱霉素抗性基因的表达)外，还利用RT-PCR方法检测了博莱霉素抗性基因ble 的转录水平的表达。

随机挑取2株菌落PCR鉴定和表型分析均正确的博来霉素抗性转化子接种 10mlYEPD液体培养基(含博来霉素50ng/μl)。参照实施例1方法提取细胞总RNA，参照实施例2方法进行反转录(RT)，以所合成的cDNA第一链为模板，利用BLE-p1：ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCG和BLE-p2： TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACG为引物进行PCR扩增。PCR体系(25μl)： 10×Ex Taqbuffer(大连TakaRa)2.5μl，dNTPs(10mmol/l)0.5μl，上游引物 BLE-p1(10μmol/l)1.0μl，下游引物BLE-p2(10μmol/l)1.0μl，Ex Taq DNA 聚合酶0.25μl，cDNA第一链模板1.0μl，ddH₂O加至25μl。反应条件：98℃ 1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。结果显示，所有斯达氏油脂酵母NRRLY-11557重组菌株均可扩增出0.3kb BLE 基因片段，而对照菌株斯达氏油脂酵母NRRL Y-11557则无相应PCR产物(图9)。

实施例10：脂肪酸羟化酶及遗传霉素抗性蛋白在油脂酵母属(Lipomyces sp.)CBS 7729中的表达

蓖麻油酸(12-hydroxy-octadeca-cis-9-enoic acid：C18：1-OH)是一类十分有价值的重要工业原料。现有来源主要为植物榨取，但是资源受到限制。来源于病原性真菌——麦角菌(Claviceps purpurea)油酸羟化酶基因(CpFAH，Genbank登记号：EU661785)在微生物中的表达可为蓖麻油酸的供应提供一条新的途径。在此利用遗传霉素抗性基因为筛选标记，以PGK启动子启动油酸羟化酶基因 CpFAH的表达，以实现在斯达氏油脂酵母中合成蓖麻油酸的目的。

1.PGKKAN敲除盒的构建

采用引物KAN-RF-P1：5’-TCGTCATATTCGTGGTCTCTGACAA TGGGTAAGGAAAAGACTCACG-3′和KAN-RF-p2：5’-TTAGAATCCCAACA TTAACGGGAGTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3’为引物，以pFA6-kanmx4(购自EUROSCARF)为骨架，进行PCR扩增，扩增产物送Takara 测序，结果如SEQID NO：11所示(Kanmx)。依照实施例3中所述的RF克隆方法，以T-PGK为模板，将PGKKAN插入PGK中，构建成的质粒命名为 T-PGKKAN。

2.PGKCpFAH表达盒的构建

依据NCBI上报道的CpFAH(EU661785)基因委托上海生工全基因合成此基因，序列如SEQ ID NO：12所示(CpFAH)。引物CpFAH-RF-p1： 5’-CATCGTCATATTCGTGGTCTCTGACAATGGCTTCCGCTACTCCTGCAAT G-3′和CpFAH-RF-p2： 5’-TTAGAATCCCAACATTAACGGGAGCTACTGAGTCTTCATTGAAATGG G-3’为引物，进行PCR扩增。依照实施例3中所述的RF克隆方法，以T-PGK 为骨架，将油酸羟化酶基因CpFAH插入启动子pLsPGK和终止子LsPGKt之间，构建成的质粒命名为T-PGKCpFAH。

3.PGKKAN-CpFAH载体的构建

以PGKKAN-KpnI：5’-ATCGggtaccATGAAAGTTAAGAAACGGCGGG-3’和PGKKAN-PstI：5’-ACTGctgcagTAGCATCTGATGAAAATTTGTCAC-3’为引物，T-PGKKAN为模板，扩增获得带有KpnI和PstI酶切位点的PGKKAN序列，利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度为200ng/μl，共50μl，-20℃保存备用。

以PGKCpFAH-PstI：5’-ATCGctgcagATGAAAGTTAAGAAACGGCGG G-3’和PGKCpFAH-XbaI：5’-ACTGtctagaTAGCATCTGATGAAAATTTGTC AC-3’为引物，T-PGKCpFAH为模板，扩增获得带有PstI和XbaI酶切位点的 PGKCpFAH序列，利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度为220ng/μl，共50μl，-20℃保存备用。

将上述两个片段与KpnI和XbaI酶切后的pZPK载体以摩尔比1∶1∶1的比例混合，加入同等体积的DNA连接试剂Solution I(DNA连接试剂盒，购自于 Takara公司，货号6022)，反应总体积10μl。于16℃连接2h后，经过热击转化至DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)。挑选Kan抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品(质粒结构如图10所示)送至大连TakaRa 公司测序，序列结果与基因组测序结果比对，序列如SEQ ID NO：13所示 (PGKKAN-CpFAH)。证实包含PGKKAN和PGKCpFAH片段。

4.含有PGKKAN-CpFAH载体的农杆菌工程菌株的构建

所构建的PGKKAN-CpFAH载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中，于含有50ng/μl卡那霉素的LB平板上挑取转化子。卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子，增菌培养后提取其中的质粒，转化至大肠杆菌中。双元载体通过大肠杆菌大量富集后送测序验证。含有测序正确质粒的农杆菌菌株为则为重组农杆菌菌株。

5.PGKKAN-CpFAH表达盒在油脂酵母属CBS 7729酵母中的表达

油脂酵母属CBS 7729购自于酵母菌种保藏中心(CBS，荷兰真菌菌种保藏中心)。取一环活化后的L.starkeyi CICC 1715酵母，接于5ml YEPD(葡萄糖20.0g/l，酵母提取物10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，pH 6.0)中，25℃，200r/min 过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD₆₀₀＝1-2，备用。农杆菌活化后，接于5ml含有卡那霉素(100ng/μl)和利福平(80ng/μl)的LB液体中，250℃， 200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD₆₀₀＝1-3，备用。

取上述酵母及农杆菌稀释液各200μl，混匀，直接滴于诱导平板((5mmol/l 葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/l磷酸二氢钾，2.05g/l磷酸氢二钾，0.15g/l氯化钠， 0.5g/l七水硫酸镁，66mg/l二水氯化钙，2.48g/l七水硫酸铁，0.5g/l硫酸铵， 40mmol/l MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，2％琼脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)) 上，28℃，培养2天。用10ml左右的无菌水将混合菌苔洗下，3000r/min离心 10min，弃去上层主要含有农杆菌的液体，剩余的细胞用1ml无菌水重悬，取适量涂布于筛选平板(含50ng/μl遗传霉素和300μg/ml头孢菌素的YEPD)上，于25℃进行培养，直至转化子出现。

6.油脂酵母属CBS 7729转化子的菌落PCR鉴定

随机挑取6个遗传霉素抗性油脂酵母CBS 7729转化子接入50ml含有50 ng/μl遗传霉素的YEPD液体中培养，参考实施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因组DNA，采用PGKKAN-RF-P1和PGKKAN-RF-P2，CpFAH-RF-p1和 CpFAH-RF-p2为引物，进行PCR鉴定。结果显示，外源基因KAN及CpFAH 均成功整合进入油脂酵母CBS 7729基因组中。

7.重组油脂酵母属CBS 7729生产蓖麻油酸的发酵实验

挑取3个菌落PCR鉴定正确正确的转化子于平板上活化2-3天后，挑取大小基本一致的单菌落接于5ml含有50ng/μl遗传霉素的YEPD培养基中。培养 24h，以1∶50的接种量接于50ml含有50ng/μL遗传霉素的的YEPD培养基中，作为二级种子。二级种子培养24h后，取5mL加入45ml的YEPD发酵培养基中。发酵过程中每12h调节一次pH。培养120h后结束。取40ml发酵菌液置于50ml圆底离心管，8000r/min室温离心5min收集菌体，用去离子水洗涤 2次，105℃烘24h至恒重。取出后于干燥器中冷却，然后称量记录，称量后按1g干菌体加入6ml4mol/l盐酸的比例，每管加入4ml 4mol/l盐酸，78℃水浴消化1h，冷却后加入2倍体积的氯仿/甲醇(1∶1，v/v)，充分振荡混匀，萃取1h后离心，取氯仿层放入一个新的离心管中。水相以等体积氯仿再次萃取一次，充分振荡后离心，取氯仿层放入上述新的离心管中合并，并加入等体积 0.1％氯化钠溶液，振荡混匀后离心。用注射器将下层有机相小心抽取并注入事先准备好的玻璃漏斗中(漏斗事先塞入脱脂棉花，并加入适量无水硫酸钠)，待漏斗中有机溶液基本流入下方的玻璃油瓶中，加入适量的氯仿冲洗漏斗4遍，一并流入下方油瓶中，萃取有油脂的氯仿采用旋转蒸发仪进行油脂收集，将收集了油脂的油瓶放入烘箱烘干24h。

对菌油进行甲酯化：称取70.0mg的待测油脂，加入5％的KOH/CH₃OH 溶液0.5ml，加热回流50min，然后加入BF₃的甲醇溶液(V_{BF3乙醚溶液}∶V_CH3OH＝ 4∶10)0.7ml，继续回流10min。冷却后加入1ml去离子水和0.7ml正己烷，混匀后吸出有机相，经去离子水洗涤两遍后用于气相色谱分析。

8.重组油脂酵母CBS 7729生产蓖麻油酸的检测

将步骤7转酯化得到的样品溶解于正己烷中，采用文献(Meesapyodsuk，D.， andQiu，X.Plant Physiol.，2008，147，1325-1333.)中的方法进行检测，标准品为蓖麻油酸甲酯(CAS：141-24-2)，负对照为野生型油脂酵母CBS 7729的油脂转酯化产物。结果显示，转入CpFAH基因的油脂酵母CBS 7729中确有蓖麻油酸产生，含量为155μg/ml，总量占总体游离脂肪酸含量的52％以上。

9、重组油脂酵母CBS 7729中油酸羟化酶的表达分析——Western blot

除了直接通过蓖麻油酸生产表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动油酸羟化酶基因在油脂酵母属中的表达外，由于油酸羟化酶基因表达产物的C-端携带6×HisTag，还可利用抗His Tag抗体通过免疫印迹分析油酸羟化酶基因的表达。上述步骤6中PCR鉴定正确的6个转化子，随机挑取3个，接入10ml含有50ng/μL遗传霉素的YEPD液体中，于30℃摇床培养48h，4000 r/min离心10min收集菌株。获得的菌体用无菌水洗涤一遍后，加入400ul的玻璃珠破菌缓冲液(20mmol/lTris-HCl，10mmol/l氯化镁，1mmol/l EDTA，5％甘油，1mmol/l DTT，0.3mmol/l硫酸铵，1mmol/l PMSF)重悬，再加入同等体积的酸洗玻璃珠。采用玻璃珠破壁法破碎细胞提取细胞总蛋白(精编分子生物学实验指南第三版第13章，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)。细胞总蛋白在12％SDS-PAGE胶上进行分离后，转移到硝酸纤维素膜上(购自上海生物工程公司)，采用小鼠抗His-tag抗体(购自上海碧云天生物技术有限公司)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(购自上海碧云天生物技术有限公司)作为一抗和二抗，DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)进行显色，均可观察到油酸羟化酶基因的表达(图11)。

实施例11：利用PGKHYG表达盒进行橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) ATCC44833的转化

橘林油脂酵母ATCC 44833(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))由斜面接种到50ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养24h，再以1∶50的体积比例将菌液分别转接到100ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养12 h达对数生长期。3000g离心5min收集菌体，重悬细胞于25mL的无菌水中。 20℃，3000g离心5min收集细胞。再次用无菌水洗涤一遍，离心收集细胞。用1mL的无菌水重悬细胞。将细胞转移至1.5mL离心管中，13000g30s快速离心收集细胞，弃上清。用1mL无菌水重悬上述细胞，取250μL细胞(＞10⁸个细胞)加入1.5mL离心管中。此干净的1.5mL离心管中事先依次加入50％ (w/v)PEG3350，36μL 1mol/L LiAc，煮沸过的50μL 2g/L鲑鱼精子DNA，1μg PGKHYG敲除盒，混匀。将细胞于离心管中的混合样品混匀，置于42℃热击 40min。快速离心收集细胞，全部涂布于筛选平板。30℃培养3-4天。

阳性重组子接种10ml YEPD液体培养基(含潮霉素250ng/μl)。参照实施例3中提取基因组DNA后，采用HYG-RF-p1和HYG-RF-p2进行PCR鉴定。 PCR体系(25μl)：10×Speedbuffer(大连TakaRa)2.5μl，dNTPs(10mmol/l) 0.5μl，上游引物(10μmol/l)1.0μl，下游引物(10μmol/l)1.0μl，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa公司)0.25μl，基因组DNA模板(100ng/μl)1.0μl，ddH₂O加至25μl。反应条件：98℃1min， 98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物琼脂糖凝胶分析结果显示，所有重组子均含有外源HYG基因(结果未显示)。

除了直接利用潮霉素抗性表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动潮霉素抗性基因在橘林油脂酵母ATCC 44833中的表达外，由于潮霉素抗性基因表达产物的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过Western blot 分析确定基因的表达。Westernblot操作参考实施例10。均可观察到潮霉素抗性基因的表达(结果未显示)。

实施例12：利用PGKHYG表达盒进行乳头状丝孢酵母(Trichosporon capitatum)ATCC 36553酵母的转化

1.PGKHYG敲除盒的制备

乳头状丝孢酵母TCC 36553(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))。利用pPGK-p1和PGKt-p2为引物，以T-PGKHYG为模板，扩增获得PGKHYG 敲除盒。利用DNA回收试剂盒纯化PCR产物后，测试纯化后的DNA片段浓度为500ng/μl，共50μl，-20℃保存备用。

2.乳头状丝孢酵母ATCC 36553感受态细胞制备

乳头状丝孢酵母ATCC 36553感受态细胞的制备：乳头状丝孢酵母ATCC 36553(菌株挑菌落接种10ml YEPD培养基(葡萄糖20.0g/l，酵母提取物10.0 g/l，蛋白胨20.0g/l，pH6.0)，30℃，200rpm，培养20h；培养物1∶50比例转接新鲜YEPD培养基，100ml(500ml锥形瓶，装液量100ml)，30℃， 200rpm，培养6-9h，OD值达到0.6-1.2；培养物冰浴10-30min，4℃，4000rpm 离心5min，弃上清；0℃无菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗涤2 次；冰浴，备用。取50μl乳头状丝孢酵母ATCC 36553感受态细胞，加入 PGKHYG表达盒10μl(总共5μg)，混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，参数：电压0.8-2.5千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；涂布YEPD平板(含潮霉素250ng/μl)，30℃培养5天以上。

3.乳头状丝孢酵母转化子的鉴定

阳性重组子接种10ml YEPD液体培养基(含潮霉素250ng/μl)。参照实施例3中提取基因组DNA后，采用HYG-RF-p1和HYG-RF-p2进行PCR鉴定。 PCR体系(25μl)：10×Speedbuffer(大连TakaRa)2.5μl，dNTPs(10mmol/l) 0.5μl，上游引物(10μmol/l)1.0μl，下游引物(10μmol/l)1.0μl，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa公司)0.25μl，基因组DNA模板(100ng/μl)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：98℃1min， 98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。结果显示，所有重组子均含有外源HYG基因(结果未显示)。

4.乳头状丝孢酵母转化子中潮霉素抗性基因的表达分析——Western blot

除了直接利用潮霉素抗性表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动潮霉素抗性基因在乳头状丝孢酵母ATCC 36553中的表达外，由于潮霉素抗性基因表达产物的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过Western blot分析确定基因的表达。Western blot操作参考实施例10。均可观察到潮霉素抗性基因的表达(结果未显示)。

实施例13：利用PGKBLE表达盒进行产油丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus)ATCC 20509酵母的转化

1.PGKBLE敲除盒的制备

产油丝孢酵母ATCC 20509(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))。利用pPGK-p1和PGKt-p2为引物，以T-PGKBLE为模板，扩增获得PGKBLE 敲除盒。利用DNA回收试剂盒纯化PCR产物后，测试纯化后的DNA片段浓度为500ng/μl，共50μl，-20℃保存备用。

2.产油丝孢酵母ATCC 20509感受态细胞制备

产油丝孢酵母ATCC 20509感受态细胞的制备：产油丝孢酵母ATCC 20509 菌株挑菌落接种10ml YEPD培养基(葡萄糖20.0g/l，酵母提取物10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，pH6.0)，30℃，200rpm，培养20h；培养物1∶50比例转接新鲜YEPD培养基，100ml(500ml锥形瓶，装液量100ml)，30℃，200rpm，培养6-9h，OD值达到0.6-1.2；培养物冰浴10-30min，4℃，4000rpm离心5 min，弃上清；0℃无菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。取50μl产油丝孢酵母ATCC 20509感受态细胞，加入PGKBLE表达盒10μl(总共5μg)，混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，参数：电压0.8-2.5 千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD， 30℃温育1-2h；涂布YEPD平板(含博来霉素900ng/μl)，30℃培养5天以上。

3.转化子的鉴定

阳性重组子接种10ml YEPD液体培养基(含博来霉素900ng/μl)。参照实施例3中提取基因组DNA后，采用BLE-RF-p1和BLE-RF-p2进行PCR鉴定。PCR体系(25μl)：10×Speedbuffer(大连TakaRa)2.5μl，dNTPs(10 mmol/l)0.5μl，上游引物(10μmol/l)1.0μl，下游引物(10μmol/l)1.0μl， SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa公司) 0.25μl，基因组DNA模板(100ng/μl)1.0μl，ddH₂O加至25μl。反应条件： 98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。结果显示，所有重组子均含有外源BLE基因。结果如图9所示。

实施例14：脂肪酸羟化酶及遗传霉素抗性蛋白在皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)CGMCC 2.571中的表达

蓖麻油酸(12-hydroxy-octadeca-cis-9-enoic acid：C18：1-OH)是一类十分有价值的重要工业原料。来源于麦角菌(Claviceps purpurea)油酸羟化酶基因(Genbank：EU661785)在微生物中的表达可为蓖麻油酸的供应提供一条新的途径。在此利用遗传霉素为筛选标记，以PGK启动子启动CpFAH基因的表达，以实现在皮状丝孢酵母中合成蓖麻油酸的目的。

1.含有PGKKAN-CpFAH载体的农杆菌菌株转化皮状丝孢酵母CGMCC 2.571

取一环活化后的皮状丝孢酵母CGMCC 2.571酵母(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC)，接于5ml YEPD中，25℃，200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD₆₀₀＝1-2，备用。实施例9所述的含有 PGKKAN-CpFAH载体的农杆菌活化后，接于5ml含有卡那霉素(100ng/μl) 和利福平(80ng/μl)的LB液体中，250℃，200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD₆₀₀＝1-3，备用。

取上述酵母及农杆菌菌株稀释液各600μl，混匀，直接滴于诱导平板(5 mmol/l葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/l磷酸二氢钾，2.05g/l磷酸氢二钾，0.15g/l 氯化钠，0.5g/l七水硫酸镁，66mg/l二水氯化钙，2.48g/l七水硫酸铁，0.5g/l 硫酸铵，40mmol/lMES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，2％琼脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)上(Bundock，P.，den Dulk-Ras，A.，Beijersbergen，A.，et al.EMBO J.，1995，14， 3206-3214.)，24-25℃，培养4天。用10ml左右的无菌水将混合菌苔洗下，3000 r/min离心5min，弃去上层主要含有农杆菌的液体，剩余的细胞用800μl无菌水重悬，取50-200μl涂布于筛选平板(含50ng/μL遗传霉素G418和300μg/mL 头孢菌素的YEPD)上，于25℃进行培养，直至转化子出现。

2.皮状丝孢酵母CGMCC 2.571转化子的PCR鉴定

随机挑取6个皮状丝孢酵母CGMCC 2.571转化子接入含有50ng/μL遗传霉素的YEPD液体中培养，参考实施例8中所述方法提取基因组DNA，采用 PGKKAN-RF-P1和PGKKAN-RF-P2，CpFAH-RF-p1和CpFAH-RF-p2为引物，进行PCR鉴定。结果显示，外源KAN及CpFAH片段均成功整合进入皮状丝孢酵母基因组中(结果未显示)。

3.皮状丝孢酵母CGMCC 2.571转化子生产蓖麻油酸的发酵实验

取正确的转化子于平板上活化2-3天后，挑取大小基本一致的单菌落接于5 mLYEPD中。培养24h后，以1∶50的接种量接于50mL的YEPD培养基中，作为二级种子。二级种子培养24h后，取5mL加入45mL的YEPD发酵培养基中。发酵过程中每12h调节一次pH。培养120h后结束。取40mL发酵菌液置于50mL圆底离心管，8000rpm室温离心5min收集菌体，用去离子水洗涤2次，105℃烘24h至恒重。取出后于干燥器中冷却，然后称量记录，称量后按1g干菌体加入6mL 4mol/L盐酸的比例，每管加入4mL 4mol/L盐酸， 78℃水浴消化1h，冷却后加入2倍体积的氯仿/甲醇(1∶1，v/v)，充分振荡混匀，萃取1h后离心，取氯仿层放入一个新的离心管中。水相以等体积氯仿再次萃取一次，充分振荡后离心，取氯仿层放入上述新的离心管中合并，并加入等体积0.1％氯化钠溶液，振荡混匀后离心。用注射器将下层有机相小心抽取并注入事先准备好的玻璃漏斗中(漏斗事先塞入脱脂棉花，并加入适量无水硫酸钠)，待漏斗中有机溶液基本流入下方的玻璃油瓶中，加入适量的氯仿冲洗漏斗4遍，一并流入下方油瓶中，萃取有油脂的氯仿采用旋转蒸发仪进行油脂收集，将收集了油脂的油瓶放入烘箱烘干24h。

进行油脂收集，将收集了油脂的油瓶放入烘箱烘干12h。

对菌油进行甲酯化：称取70.0mg的待测油脂，加入5％的KOH/CH₃OH 溶液0.5mL，加热回流50min，然后加入BF₃的甲醇溶液(V_{BF3乙醚溶液}∶V_CH3OH＝ 4∶10)0.7mL，继续回流10min。冷却后加入1mL去离子水和0.7mL正己烷，混匀后吸出有机相，经去离子水洗涤两遍后用于气相色谱分析。

4.皮状丝孢酵母CGMCC 2.571转化子生产蓖麻油酸的测量

将转酯化的样品溶解于正己烷中，采用文献(Meesapyodsuk，D.，and Qiu，X.Plant Physiol.，2008，147，1325-1333.)中的方法进行检测，标准品为蓖麻油酸甲酯(CAS：141-24-2)，负对照为野生型皮状丝孢酵母的油脂转酯化产物。结果显示，转入CpFAH基因的皮状丝孢酵母CGMCC 2.571中确有蓖麻油酸产生，含量为 190μg/ml，总量占总体游离脂肪酸含量的60％以上。

5.皮状丝孢酵母CGMCC 2.571转化子中油酸羟化酶基因的表达分析—— Westernblot

除了直接通过蓖麻油酸生产表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动油酸羟化酶基因在皮状丝孢酵母CGMCC 2.571中的表达外，由于油酸羟化酶基因表达产物的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过免疫印迹分析油酸羟化酶基因的表达。Western blot操作参考实施例10。均可观察到油酸羟化酶基因的表达(结果未显示)。

实施例15：利用PGKBLE表达盒进行发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)ATCC 10675酵母的转化

1.PGKBLE基因在发酵性丝孢酵母ATCC 10675酵母中的表达

发酵性丝孢酵母ATCC 10675购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。取一环活化后的发酵性丝孢酵母ATCC 10675酵母，接于5ml YEPD中，30℃， 200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD₆₀₀＝0.1-1.9，备用。农杆菌活化后，接于5ml含有卡那霉素(50ng/μl)和利福平(50ng/μl)的LB 液体中，30℃，200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD₆₀₀＝0.1-1.9，备用。

取上述酵母及农杆菌稀释液各600μl，混匀，直接滴于诱导平板(5mmol/l 葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/l磷酸二氢钾，2.05g/l磷酸氢二钾，0.15g/l氯化钠， 0.5g/l七水硫酸镁，66mg/l二水氯化钙，2.48g/l七水硫酸铁，0.5g/l硫酸铵， 40mmol/l MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，2％琼脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)上 (Bundock，P.，den Dulk-Ras，A.，Beijersbergen，A.，et al.EMBO J.，1995，14， 3206-3214.)，24-25℃，培养4天。用10ml左右的无菌水将混合菌苔洗下，3000 r/min离心5min，弃去上层主要含有农杆菌的液体，剩余的细胞用800μl无菌水重悬，取50-200μl涂布于筛选平板(含50ng/μL博莱霉素和300μg/mL头孢菌素的YEPD)上，于30℃进行培养，直至转化子出现。

2.发酵性丝孢酵母ATCC 10675博来霉素转化子的PCR鉴定

随机挑取6个发酵性丝孢酵母ATCC 10675博来霉素转化子接入含有50 ng/μL博来霉素的YEPD液体中培养，参考实施例3中所述方法提取发酵性丝孢酵母ATCC 10675基因组DNA，采用BLE-RF-p1和BLE-RF-p2为引物，进行PCR鉴定。PCR体系(50μl)：5×Prime buffer(大连TakaRa)10.0μl，dNTPs (2.5mmol/l)4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl， PrimeSTAR^TMHS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，基因组DNA(20ng/μl) 1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃ 1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示可见，外源BLE片段成功整合进入发酵性丝孢酵母ATCC 10675基因组中(结果未显示)。

3.发酵性丝孢酵母ATCC 10675博莱霉素抗性转化子中博莱霉素抗性基因的表达分析——Western blot

除了直接利用博莱霉素抗性表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动博莱霉素抗性基因在发酵性丝孢酵母ATCC 10675中的表达外，由于博莱霉素抗性基因表达产物的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过 Western blot分析确定基因的表达。Western blot操作参考实施例10。均可观察到潮霉素抗性基因的表达(结果未显示)。

实施例16：利用PGKHYG表达盒进行产孢丝孢酵母(Trichosporon porosum) ATCC90770酵母的转化

1.PGKHYG基因在产孢丝孢酵母ATCC 90770酵母中的表达

产孢丝孢酵母ATCC 90770购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。取一环活化后的产孢丝孢酵母ATCC 90770酵母，接于5ml YEPD中，30℃， 200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD₆₀₀＝0.1-0.8，备用。农杆菌活化后，接于5ml含有卡那霉素(50ng/μl)和利福平(50ng/μl)的LB 液体中，30℃，200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD₆₀₀＝0.1-1.6，备用。

取上述酵母及农杆菌稀释液各400μl，混匀，直接滴于诱导平板(5mmol/l 葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/l磷酸二氢钾，2.05g/l磷酸氢二钾，0.15g/l氯化钠， 0.5g/l七水硫酸镁，66mg/l二水氯化钙，2.48g/l七水硫酸铁，0.5g/l硫酸铵， 40mmol/lMES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，2％琼脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)上 (Bundock，P.，den Dulk-Ras，A.，Beijersbergen，A.，et al.EMBO J.，1995，14， 3206-3214.)，24-25℃，培养4天。用10ml左右的无菌水将混合菌苔洗下，3000 r/min离心5min，弃去上层主要含有农杆菌的液体，剩余的细胞用800μl无菌水重悬，取50-200μl涂布于筛选平板(含50ng/μL潮霉素和300μg/mL头孢菌素的YEPD)上于30℃进行培养，直至转化子出现。

2.产孢丝孢酵母ATCC 90770潮霉素抗性转化子的PCR鉴定

随机挑取6个产孢丝孢酵母ATCC 90770潮霉素转化子接入含有50ng/μL 潮霉素的YEPD液体中培养，参考实施例3中所述方法提取产孢丝孢酵母ATCC 90770基因组DNA，采用HYG-RF-p和HYG-RF-p2为引物，进行PCR鉴定。 PCR体系(50μl)：5×Prime buffer(大连TakaRa)10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l) 4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，基因组DNA(20ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min， 35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度) 琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示可见，外源HYG片段成功整合进入产孢丝孢酵母ATCC 90770基因组中。

3.产孢丝孢酵母ATCC 90770潮霉素抗性转化子中潮霉素的表达分析——Western blot

除了直接利用潮霉素抗性表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动潮霉素抗性基因在乳头状丝孢酵母ATCC 36553中的表达外，由于潮霉素抗性基因表达产物的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过Western blot分析确定基因的表达。Western blot操作参考实施例10。均可观察到潮霉素抗性基因的表达(结果未显示)。

实施例17：利用PGKHYG表达盒进行白氏毛孢子菌(Trichosporon beigelii) ATCCMYA-911的转化

白氏毛孢子菌ATCC MYA-911(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)) 由斜面接种到50ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养24h，再以1∶50 的体积比例将菌液分别转接到100ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养 12h达对数生长期。3000g离心5min收集菌体，重悬细胞于25mL的无菌水中。20℃，3000g离心5min收集细胞。再次用无菌水洗涤一遍，离心收集细胞。用1mL的无菌水重悬细胞。将细胞转移至1.5mL离心管中，13000g30s 快速离心收集细胞，弃上清。用1mL无菌水重悬上述细胞，取250μL细胞(＞10⁸个细胞)加入1.5mL离心管中。此干净的1.5mL离心管中事先依次加入50％ (w/v)PEG3350，36μL 1mol/L LiAc，煮沸过的50μL 2g/L鲑鱼精子DNA，1μg PGKHYG敲除盒，混匀。将细胞于离心管中的混合样品混匀，置于42℃热击 40min。快速离心收集细胞，全部涂布于筛选平板。30℃培养3-4天。

阳性重组子接种10ml YEPD液体培养基(含潮霉素250ng/μl)。参照实施例3中提取基因组DNA后，采用HYG-RF-p1和HYG-RF-p2进行PCR鉴定。 PCR体系(25μl)：10×Speedbuffer(大连TakaRa)2.5μl，dNTPs(10mmol/l) 0.5μl，上游引物(10μmol/l)1.0μl，下游引物(10μmol/l)1.0μl，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa公司)0.25μl，基因组DNA模板(100ng/μl)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：98℃1min， 98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。结果显示，所有重组子均含有外源HYG基因。

除了直接利用潮霉素抗性表型来确定斯达氏油脂酵母PGK启动子可以启动潮霉素抗性基因在白氏毛孢子菌ATCC MYA-911中的表达外，由于潮霉素抗性基因表达产物的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过Western blot分析确定基因的表达。Western blot操作参考实施例10。均可观察到潮霉素抗性基因的表达(结果未显示)。

Claims (15)

1.3-磷酸甘油酸激酶启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种DNA表达盒，其含有SEQ ID NO：1所示的3-磷酸甘油酸激酶启动子的核苷酸序列。

3.权利要求2所述的表达盒，其还含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQ ID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2之间为编码目的基因的开放阅读框架。

4.权利要求3所述的DNA表达盒，其特征在于：所述编码目的基因的开放阅读框架的cDNA序列如SEQ ID NO：4所示。

5.一种包含权利要求2-4中任一项所述的DNA表达盒的重组载体。

6.权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述载体为游离型或者整合型载体。

7.权利要求6所述的重组载体，其中所述游离型载体选自大肠杆菌克隆载体或酵母穿梭载体。

8.权利要求7所述的重组载体，其中所述游离型载体选自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。

9.权利要求6所述的重组载体，其中所述整合型载体为农杆菌介导的双元表达载体，或者为携带有靶基因翼侧1500-4000碱基同源重组臂的同源重组载体。

10.权利要求9所述的重组载体，其中所述农杆菌介导的双元表达载体选自pZPK或pPZP200，其中所述pZPK通过用卡那霉素抗性基因片段替换pPZP200载体上的链霉素/壮观霉素抗性基因片段构建而成。

11.权利要求9所述的重组载体，其中所述同源重组载体的骨架选自大肠杆菌克隆载体或酵母穿梭载体。

12.权利要求11所述的重组载体，其中所述同源重组载体的骨架选自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。

13.包含权利要求5-12中任一项所述的重组载体的宿主细胞。

14.权利要求13所述的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。

15.一种用于产油酵母遗传表达的表达系统，所述表达系统包含：

(1)能够在油脂酵母属(Lipomyces)或者丝孢酵母属(Trichosporon)菌株中表达的改良载体，所述改良载体通过在能够在油脂酵母属或者丝孢酵母属中整合表达或游离表达的质粒中插入SEQ ID NO：1所示的启动子序列和SEQ ID NO：2所示的终止子序列构建获得，其中SEQ ID NO：1所示的启动子序列位于SEQ ID NO：2所示的终止子序列的上游，SEQ ID NO：1所示的序列与SEQ ID NO：2所示的序列之间为多克隆位点，并且所述载体还包含选择性标记基因；

(2)目的基因开放阅读框序列，其能够可操作性地插入到(1)所述的改良载体中，并使所述目的基因与(1)所述的改良载体中的启动子和终止子符合阅读框地连接，和

(3)油脂酵母属或者丝孢酵母属菌株。