CN104745616B

CN104745616B - 一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN104745616B
Application number: CN201510186254.1A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 童鹏; 牛欢青; 李楠; 郭亭; 柳冬
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2035-04-17
Also published as: CN104745616A

Abstract

本发明公开了一株肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌，该菌株是通过构建大片段同源重组质粒，然后将该质粒转化节杆菌使其与节杆菌基因组中肌苷酸脱氢酶基因进行双交换，得到肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌。该大片段同源重组质粒的同源臂的长度大于10kb，提高了同源重组的效率，利用该方法进行基因敲除，不会向菌株中引入新的抗性基因。重组菌AR‑dIMP最高cAMP产量为9.37g/L，比出发菌株提高了120％。

Description

一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

微生物育种是以提高微生物菌株生产性能为目标，人为改造微生物菌株的遗传性能的过程。主要是通过阻断代谢支路或者增强目标基因的表达来实现，对于代谢途径的阻断，传统的方法是通过诱变，筛选缺陷型突变株，该方法工作量大、筛选过程繁琐，并且存在回复突变率高、菌株发酵性能不稳定的缺点。随着现代生物学的发展，通过分子生物学的手段从基因组上进行定点敲除成为了最佳选择。基因敲除又分为多种方法，其中以同源重组法最为成熟。在

生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组(Homologous Recombination)。同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度(即序列的相似程度)、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。为了快速、高效的筛选到目的基因敲除的重组子，需要尽可能延长敲除质粒的同源臂。然而常规的构建方法是通过聚合酶链式反应来获得同源臂，受到DNA聚合酶保真度和测序长度的限制，无法获得太长的同源臂，目前普遍应用的同源臂的长度约为50～5000bp。但是由于微生物基因比较复杂，即使同源臂的长度为2000～5000，发生重组的概率仍然很低。因此需要寻找一种获得较长同源臂的方法，提高同源重组的效率。

cAMP作为细胞内的第二信使，其生物合成受到严格的代谢调控。为使其过量积累，只有运用代谢工程的手段，去除代谢通路中不必要的分支途径，促使碳流流向目的产物积累的方向；或者切除产物的分解途径，避免发酵过程中产物的降解。IMP是嘌呤类核苷酸合成途径中的代谢节点，起到重要的流量分配作用。选育肌苷酸脱氢酶(EC1.1.1.205，简称IMPDH)缺失的突变株，可以阻断IMP到XMP的支路代谢，避免进入GMP循环造成的代谢流浪费，保证代谢流向AMP循环的方向进行。而且从代谢途径上分析，IMPDH缺失还能够解除GMP、XMP对PRPP转酰胺酶的反馈抑制，进一步加强嘌呤核苷从头合成途径的通量。作为节杆菌生长代谢的重要基因，利用普通的同源重组的方法很难将肌苷酸脱氢酶基因敲除，因此，需要寻找一种能够高效敲除该基因的方法，同时，不引入抗性基因、能稳定遗传的肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种遗传稳定肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供一种利用大片段同源重组质粒敲除节杆菌肌苷酸脱氢酶基因的方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在发酵产cAMP中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)大片段获取：提取节杆菌基因组DNA，用限制性内切酶HindIII酶切该基因组DNA，回收酶切得到的DNA片段；

(2)同源线性化载体扩增：以pARK质粒为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为引物，扩增得到线性化载体；

(3)利用Rec-ET系统连接线性化载体与大片段：制备大肠杆菌Gbdir感受态，将步骤(1)得到的DNA片段和步骤(2)得到的线性化载体同时转化大肠杆菌Gbdir感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，得到的阳性克隆中含有pUK-gIMP重组质粒；

(4)PCR-targeting替换目的基因：将pUK-gIMP重组质粒转化大肠杆菌BW25113/pIJ790感受态细胞，再将含有pUK-gIMP重组质粒的大肠杆菌BW25113/pIJ790进一步制备成感受态；

以pIJ773质粒为模板，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列为引物，扩增安普霉素抗性基因，并回收PCR得到的片段，将该安普抗性基因片段电转化含有pUK-gIMP重组质粒的大肠杆菌BW25113/pIJ790感受态细胞，涂布含有卡那霉素和安普霉素双重抗性的平板，得到的阳性克隆中含有impdh基因部分被安普抗性霉素抗性基因替换的pUK-gIMP-AP质粒；

(5)删除插入片段：用SpeI酶切pUK-gIMP-AP质粒，去除安普抗性基因，回收大片段后，自连环化，转化大肠杆菌DH5a感受态，得到的阳性克隆中含有pUK-dIMP质粒；

(6)双交换重组子筛选：将pUK-dIMP质粒电转化节杆菌，涂布含有卡那霉素抗性的平板，对得到的阳性转化子进行松弛实验，直到筛选得到发生双交换的重组子，该发生双交换的重组子即肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌。

步骤(6)中，所述的节杆菌的保藏号为CGMCC NO.3584。

步骤(6)中，所述的松弛实验按照如下方法进行：

将步骤(6)所述的阳性转化子，挑至不含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浑浊，划线至不含卡那霉素的LB平板培养基，分出单菌落，双挑至含有卡那霉素抗性平板和不含卡那霉素的LB平板培养基，观察转化子生长情况；

若抗性平板上生长的菌体，应当是发生单交换的转化子，保留了载体上的卡那抗性基因，若发生双交换，则载体上的卡那抗性基因会丢失，因此只能在无抗性平板上生长；

如没有符合要求的转化子出现，则重新将不含卡那霉素的LB平板培养基上的转化子，挑至不含抗性的LB液体培养基，进行第二轮松弛，直至筛选到在卡那霉素抗性平板上不长，在无抗性平板上生长的节杆菌转化子。

上述肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法得到的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在本发明的保护范围之内。

上述肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在制备cAMP中的应用，包括如下步骤：

(1a)将肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌先在节杆菌培养基上划线活化，再挑单菌落于液体培养基中，培养19～24h；

(2a)将液体培养基中的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌转接到发酵培养基中，在发酵罐中，发酵产cAMP。

其中，步骤(1a)所述的节杆菌培养基的组成为：葡萄糖1～15g/L，蛋白胨1～20g/L，酵母膏5～20g/L，牛肉膏10g/L，pH 7.2，溶剂为水；

其中，步骤(2a)所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖30～60g/L，K₂HPO₄ 15～25g/L，KH₂PO₄ 1～10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，尿素10～15g/L，CoCl₂ 0.01～0.02g/L，NaF0.1～1g/L，生物素0.01～0.05g/L，次黄嘌呤5～10g/L，黄嘌呤0.1～0.2g/L，pH 7.0，溶剂为水。

步骤(2a)中，发酵过程中，发酵罐的搅拌转速250～400rpm，优选350rpm。

步骤(2a)中，发酵过程中，发酵罐的通气量为5～15L/min，优选8L/min。

制备大肠杆菌Gbdir感受态：37℃平板活化；挑单菌落至5mL LB培养基，37℃过夜(OD₆₀₀约为3-4)；转接40μL至1.4mL LB培养基，37℃培养2h左右，至OD₆₀₀约为0.4；加入阿拉伯糖至终浓度为2.5mg/mL，37℃诱导45min；4℃，9500×g离心30s，收集菌体；弃上清，加入1mL冰冷的无菌水，洗涤菌体；重复一次；用30μL冰冷的无菌水重悬菌体，作为电转感受态。

向Gbdir电转感受态中加入0.5μg线性化载体和约5μg基因组酶切回收片段，1350V(1mm)，电击；立即加入1mL LB，37℃复苏70min；离心，涂50μg/mL卡那平板；菌落PCR，检验是否含有目的基因，阳性克隆命名为pUK-gIMP。

大肠杆菌Gbdir在阿拉伯糖的诱导下，能够表达来自Rac噬菌体的RecE、RecT重组酶和来自λ噬菌体的Redγ重组酶，可以使两个具有50bp同源臂的线性化片段发生同源重组，称为LLHR(Linear-Linear Homologous Recombination)。将基因组DNA酶切回收片段与线性化载体混合，电转Gbdir感受态，根据线性化载体上的卡那霉素抗性基因筛选发生重组的转化子。

含有pUK-gIMP重组质粒的大肠杆菌BW25113/pIJ790感受态制备：30℃平板活化；挑单菌落至5mL LB培养基(含氯霉素25μg/mL、卡那霉素50μg/mL)，30℃过夜(OD₆₀₀约为3-4)；转接100μL至10mL LB培养基(含10mmol/L阿拉伯糖、氯霉素25μg/mL、卡那霉素50μg/mL)，30℃培养3-4h左右，至OD₆₀₀约为0.4；4℃，4000×g离心5min，收集菌体；弃上清，加入预冷的10％甘油，洗涤菌体；重复一次；用100μL冰冷的10％甘油重悬菌体，分装成2管，作为电转感受态。

大肠杆菌BW25113内包含pIJ790质粒，在阿拉伯糖的诱导下，能够表达λ噬菌体的Redα、β和γ重组酶，可以使两端各具有39bp同源序列的线性化片段与环状质粒发生同源重组，称为LCHR(Linear-Circle Homologous Recombination)。通过该方法可以在无需考虑酶切位点的情况下，一步法替换掉质粒上位于两个39bp同源序列之间的序列，称为PCR-targeting技术。

有益效果：

1、将同源臂长度增加至10kb以上，大大提高了发生同源重组的效率，构建得到了新型大片段同源重组质粒，该重组质粒不但可以快速、有效的对节杆菌中的基因进行敲除，而且不引入抗性基因，不影响后续对菌株的分子操作。

2、遗传稳定性实验显示，同源重组敲除的菌株基因型稳定，在不含抗生素的培养基中连续培养10代以上，并未发现菌株回复突变的现象。

3、基因敲除菌株AR-dPDE结果显示，其cAMP合成能力分别比出发菌株CGMCC3584提高了约120％，说明消除菌体内cAMP的分解途径，更有利于cAMP的积累。

附图说明

图1Arthrobacter CGMCC 3584基因组DNA提取；1：DL10000marker，2：基因组DNA，3：40kb片段。

图2基因组酶切和线性化载体扩增，1：HindIII酶切基因组DNA，2：IMP-fusion-F和IMP-fusion-R扩增线性化载体，M：DL10000 marker。

图3一步克隆后质粒提取；1-5：pUK-gIMP重组质粒，；M：DL10000 marker。

图4一步克隆后质粒PCR验证；1-5：pUK-gIMP质粒PCR，6：基因组酶切回收片段PCR阳性对照，M：DL5000 marker

图5PCR扩增安普霉素抗性基因；1：PCR fragment，M：DL5000 marker。

图6质粒PCR验证；1：pUK-dIMP-AP质粒PCR，M：DL5000 marker。

图7PCR验证新型同源重组质粒，1-4：pUK-dIMP质粒PCR验证；M：DL5000marker。

图8新型同源重组质粒图谱。

图9重组菌连续培养十代后菌落PCR；1：AR-dIMP重组菌菌落PCR，2：出发菌对照(IMPDH)；M：DL2000 marker。

图10松弛实验流程示意图。

图11重组节杆菌AR-dIMP发酵过程曲线。

图12pARK质粒图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明中所用的菌株节杆菌CMCC3584已经在申请号为201010191515.6的专利中详细公开过。

本发明中使用的大肠杆菌Gbdir、大肠杆菌BW25113/pIJ790均可以购买得到。

本发明中涉及的核苷酸序列及编号。

IMP-fusion-F	SEQ ID NO：1
		IMP-fusion-R	SEQ ID NO：2
IMP-target-F	SEQ ID NO：3
		IMP-target-R	SEQ ID NO：4
IMP-UP-F	SEQ ID NO：5
		IMP-D-R	SEQ ID NO：6
肌苷酸脱氢酶基因原始的序列	SEQ ID NO：7
		肌苷酸脱氢酶基因敲除后的序列	SEQ ID NO：8
PARK质粒序列	SEQ ID NO：9

实施例1：新型同源重组质粒的构建。

(1)引物设计：

表1引物序列

(2)大片段获取：

提取Arthrobacter CGMCC 3584基因组DNA，电泳结果如图1所示，所提取基因组较完整，且浓度高。

用限制性内切酶HindIII酶切节杆菌基因组，得到包含impdh基因的15.7kb片段。，经异丙醇沉淀、浓缩后，用灭菌的去离子水溶解。

以pARK质粒(质粒图件图12，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示)为模板，以IMP-fusion-F和IMP-fusion-R为引物对，PCR扩增出两端与含目的基因的基因组酶切片段各具有50个碱基同源序列的线性化载体。如图2所示。

(3)同源线性化载体扩增:

以pARK质粒为模板，使用表1中IMP-target-F和IMP-target-R引物，扩增不含节杆菌复制原点pCGori的线性化质粒。线性化载体两端各含50bp同源序列，与包含与包含impdh基因的大片段两端的基因序列匹配。

(4)利用Rec-ET系统连接线性化载体与大片段

向Gbdir电转感受态中加入0.5μg线性化载体和约5μg基因组酶切回收片段，1350V(1mm)，电击；立即加入1mL LB，37℃复苏70min；离心，涂50μg/mL卡那平板；菌落PCR，检验是否含有目的基因，阳性克隆命名为pUK-gIMP。提取质粒进行PCR验证，考察是否为包含目的基因的大片段重组质粒，结果如图3所示。电泳结果显示，1号和3号分别与阳性对照一致，且条带较亮，为正确克隆。

将提取质粒进行PCR验证，考察是否为包含目的基因的大片段重组质粒，结果如图4所示。电泳结果显示，1号和3号分别与阳性对照一致，且条带较亮，为正确克隆。

(5)PCR-targeting替换目的基因。

取pUK-gIMP质粒1μL，按照钙转法转化至大肠杆菌BW25113。验证正确后，按照以下方法进一步制成感受态。

感受态制备：30℃平板活化；挑单菌落至5mL LB培养基(含氯霉素25μg/mL、卡那霉素50μg/mL)，30℃过夜(OD₆₀₀约为3-4)；转接100μL至10mL LB培养基(含10mmol/L阿拉伯糖、氯霉素25μg/mL、卡那霉素50μg/mL)，30℃培养3-4h左右，至OD₆₀₀约为0.4；4℃，4000×g离心5min，收集菌体；弃上清，加入预冷的10％甘油，洗涤菌体；重复一次；用100μL冰冷的10％甘油重悬菌体，分装成2管，作为电转感受态。

为了便于PCR-targeting后的筛选，一般是扩增出一段与质粒上不同的抗性基因，此处选择的是来自pIJ773质粒的安普抗性基因。以pIJ773质粒为模板，使用IMP-target-F/IMP-target-R引物，PCR扩增带同源序列的安普霉素抗性基因。经异丙醇沉淀、浓缩后，用灭菌的去离子水溶解。电泳结果显示，PCR扩增条带大小为1.5kb左右，与目的片段相符，且特异性较好，如图5所示。

PCR-targeting：取2μL PCR回收片段，加入100μL感受态细胞，混匀，2500V(2mm)，电击；立即加入1mL LB，37℃复苏1h；离心，涂50μg/mL卡那霉素和50μg/mL安普霉素双重抗性平板。转化子提质粒，PCR验证，阳性克隆命名为pUK-gIMP-AP。

将回收得到的安普霉素抗性基因，电转入已经包含大片段同源重组质粒的大肠杆菌BW25113，替换质粒上的目的基因序列，命名为pUK-dIMP-AP。电转后，在卡那霉素和安普霉素双重抗性平板上挑选转化子，提质粒进行PCR验证，结果均为阳性(图6)。

(6)删除插入片段。

为了使同源重组敲除目的基因后，不引入外加抗性，需要将同源臂内部的安普霉素抗性基因去除。引物设计时，在安普霉素抗性基因两侧加入了SpeI酶切位点，可以通过酶切、自连的方式，去除质粒上的抗性基因。载体自连后，转化子先涂卡那霉素抗性平板；长出单菌落后，再双挑至卡那霉素以及安普霉素+卡那霉素双抗性的平板，选择在前一平板上长，后一平板上不长的转化子，说明安普霉素抗性已经去除。提质粒进一步验证，得到最终所需的pUK-dIMP新型同源重组质粒。经PCR-targeting后，目的基因内部部分缺失，以IMP-UP-F/IMP-D-R为引物pUK-dIMP阳性质粒应扩增出约670bp条带(如图7)。

新型同源重组质粒pUK-dIMP经异丙醇沉淀后，加无菌水溶解，终浓度分别为1228.3ng/μL。图谱如图8所示。

实施例2：pUK-dIMP质粒电转化节杆菌。

节杆菌感受态制备与电转方法如下：

节杆菌感受态制备：

a、LB平板活化，挑单菌落至5mL LB液体培养基，30℃培养24h；

b、转接0.1％至100mL LB液体培养基，30℃培养约18h，至OD₆₀₀接近0.6；

c、加青霉素G钠盐至终浓度为30μg/mL，继续培养1h；

d、4000×g，4℃离心10min，收集菌体，用30mL 10％甘油+0.5mol/L山梨醇洗；

e、重复洗3遍；

f、用1mL 10％甘油+0.5mol/L山梨醇重悬，分装成10管，-80℃保存。

节杆菌电转：

a、质粒提取后用异丙醇沉淀浓缩，终浓度至500ng/uL左右；

b、取2μL质粒加入100μL感受态细胞，轻轻混匀，加入预冷的2mm电击杯；

c、2.5kV，25μF，400Ω，电击；

d、立即加入含0.5mol/L山梨醇的900μL LB培养基，30℃复苏8h；

e、稀释适当倍数后涂卡那150μg/mL平板，36h可看到明显菌落。

实施例3：双交换重组子筛选。

将电转同源重组质粒后，发生单交换的重组子在不含抗生素的培养基中培养，利用菌体自身的同源重组作用，除去抗性基因，以期获得发生双交换的重组子，称为松弛实验。具体过程如下：将150μg/mL卡那霉素抗性平板上的节杆菌电转转化子，挑至不含卡那霉素的LB液体培养基，进行第一轮松弛；30℃培养24h至菌液浑浊，划线至不含卡那霉素的LB平板培养基，分出单菌落；双挑至150μg/mL卡那抗性平板和不含卡那霉素的LB平板培养基，观察转化子生长情况。抗性平板上生长的菌体，应当是发生单交换的转化子，保留了载体上的卡那抗性基因；若发生双交换，则载体上的卡那抗性基因会丢失，因此只能在无抗性平板上生长。如没有符合要求的转化子出现，则重新将不含卡那霉素的LB平板培养基上的转化子，挑至不含抗性的LB液体培养基，进行第二轮松弛，直至筛选到在卡那霉素抗性平板上不长，无抗性平板上生长的节杆菌转化子。松弛过程如图10所示。

实施例4：目的基因敲除菌株验证。

对于松弛实验得到的无抗性转化子，通过菌落PCR区分菌体回复野生型或是目的基因缺失型转化子。以IMP-UP-F/IMP-D-R为引物对，进行菌落PCR，延伸时间为2.5min。

IMP-UP-F：acatGCATGCATGACCGAGCCCGAACAC

IMP-D-R：cGAGCTCGAAGATGGCGGCTATCCGGTC

实施例5：转化子遗传稳定性。

对目的基因敲除的重组子AR-dIMP进行遗传稳定性研究，在未添加卡那霉素的培养基中连续培养十代后，进行菌落PCR验证(图9)。结果显示，目的基因内部缺失的AR-dIMP重组菌，未发生回复突变的现象，说明重组菌遗传稳定性较好。

实施例6：重组菌发酵。

(1)摇瓶发酵

节杆菌培养基(g·L^-1)：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，pH 7.2。固体培养基中加入琼脂2％。121℃高压蒸汽灭菌15min。

平板培养：30℃培养48h。

种子培养：将平板活化的单菌落挑于新鲜的液体培养基中，200rpm，30℃培养16-18h。其中需添加相应浓度的卡那霉素抗生素。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，K₂HPO₄ 18，KH₂PO₄ 5，MgSO₄·7H₂O 0.1，尿素10，CoCl₂ 0.005，NaF 0.4，生物素0.01，次黄嘌呤6，黄嘌呤0.1g/L，pH 7.0，115℃灭菌20min。

(2)5L发酵罐发酵

摇瓶种子以10％的接种量在火圈口接入5L自动控制发酵罐(NBS)，装液量3L，通风量8L/min，搅拌转速350rpm，发酵过程中通过消泡泵手动或自动流加泡敌消泡，通过自动流加1mol/L NaOH或0.5mol/L H₂SO₄控制pH为7.0，发酵总时间为72h。

如图11所示，出发菌株CGMCC 3584的cAMP产量为4.25g，与出发菌株CGMCC3584相比，72h时，重组菌AR-dIMP最高cAMP产量为9.37g/L，比出发菌株提高了120％。说明通过敲除impdh基因，提高cAMP产量的方法是有效的。

为了排除菌体浓度对于cAMP产量的影响，本文对单位菌体合成cAMP的能力进行了比较，出发菌株CGMCC 3584的单位菌体cAMP产量为0.53g cAMP/每克菌体，其次为重组节杆菌AR-dIMP，能够产生0.99g cAMP/每克菌体，比出发菌株高约86.79％。

Claims

1.一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法，其特征在于，所述节杆菌的出发菌株为保藏号为CGMCC NO.3584的菌株；

所述 CGMCC NO.3584 菌株中肌苷酸脱氢酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO：7 所示；

所述肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌中肌苷酸脱氢酶基因的核苷酸序列如 SEQ IDNO：8 所示；

肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法包括如下步骤：

(1) 大片段获取：提取节杆菌基因组 DNA，用限制性内切酶 HindIII 酶切该基因组DNA，回收酶切得到包含肌苷酸脱氢酶的15.7kb的DNA 片段；

(2) 同源线性化载体扩增：以 pARK质粒为模板，SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示的序列为引物，扩增得到线性化载体，所述 pARK 质粒其核苷酸序列如 SEQ ID NO：9；

(3) 利用 Rec-ET 系统连接线性化载体与大片段：制备大肠杆菌 Gbdir 感受态，将步骤(1)得到的 DNA 片段和步骤(2)得到的线性化载体同时转化大肠杆菌 Gbdir 感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，得到的阳性克隆中含有 pUK-gIMP 重组质粒；

(4) PCR-targeting 替换目的基因：将 pUK-gIMP 重组质粒转化大肠杆菌 BW25113/pIJ790感受态细胞，再将含有pUK-gIMP重组质粒的大肠杆菌BW25113/pIJ790 进一步制备成感受态；以 pIJ773 质粒为模板，SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示的序列为引物，扩增安普霉素抗性基因，并回收 PCR 得到的片段，将该安普抗性基因片段电转化含有 pUK-gIMP 重组质粒的大肠杆菌 BW25113/pIJ790 感受态细胞，涂布含有卡那霉素和安普霉素双重抗性的平板，得到的阳性克隆中含有 impdh 基因部分被安普抗性霉素抗性基因替换的 pUK-gIMP-AP 质粒；

(5) 删除插入片段：用 SpeI 酶切 pUK-gIMP-AP 质粒，去除安普抗性基因，回收大片段后，自连环化，转化大肠杆菌 DH5a 感受态，得到的阳性克隆中含有 pUK-dIMP 质粒；

(6) 双交换重组子筛选：将 pUK-dIMP 质粒电转化节杆菌，涂布含有卡那霉素抗性的平板，对得到的阳性转化子进行松弛实验，直到筛选得到发生双交换的重组子，该发生双交换的重组子即肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌。

2.根据权利要求 1 所述的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的松弛实验按照如下方法进行：将步骤(6)中阳性转化子挑至不含卡那霉素的 LB 液体培养基中，培养至菌液浑浊，划线至不含卡那霉素的 LB 平板培养基，分出单菌落，双挑至含有卡那霉素抗性平板和不含卡那霉素的 LB 平板培养基，观察转化子生长情况；

如没有符合要求的转化子出现，则重新将不含卡那霉素的 LB 平板培养基上的转化子，挑至不含抗性的 LB 液体培养基，进行第二轮松弛，直至筛选到在卡那霉素抗性平板上不长，在无抗性平板上生长的节杆菌转化子。

3.权利要求 1 中所述的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在制备 cAMP 中的应用。

4.根据权利要求 3 所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1a) 将肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在固体节杆菌培养基上划线活化，再挑单菌落于液体节杆菌培养基中，培养 19~24h；

(2a) 将液体节杆菌培养基中的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌转接到发酵培养基中，在发酵罐中，发酵产 cAMP。

5.根据权利要求 4 所述的应用，其特征在于，所述的液体节杆菌培养基的组成为：葡萄糖 1~15g/L，蛋白胨 1~20 g/L，酵母膏 5~20 g/L，牛肉膏 10 g/L， pH 7.2，溶剂为水；

所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖 30~60 g/L，K₂HPO₄ 15~25 g/L，KH₂PO₄ 1~10 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1~0.5 g/L，尿素 10~15 g/L，CoCl₂ 0.01~0.02 g/L，NaF 0.1~1 g/L，生物素 0.01~0.05 g/L，次黄嘌呤 5~10 g/L，黄嘌呤 0.1 ~0.2g/L ，pH 7.0，溶剂为水。

6.根据权利要求 4 所述的应用，其特征在于，步骤(2a)中，发酵过程中，发酵罐的搅拌转速 250~400 rpm。

7.根据权利要求 4所述的应用，其特征在于，步骤(2a)中，发酵过程中，发酵罐的通气量为 5~15L/min。