CN101899431B - 一种快速高效dna重组的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒，通过提取发光杆菌的总DNA，以此为模板PCR扩增plu2935和plu2936基因，将plu2935和plu2936基因克隆入pET32a载体，构建获得重组酶表达载体pET-plu，将pET-plu导入BL21(DE3)中，获得可表达重组酶Plu2935和Plu2936的工程菌BL21-REC。IPTG诱导BL21-REC，表达Plu2935和Plu2936重组酶，并制备成感受态细胞。将含有同源序列的两DNA片段工转化入BL21-REC感受态细胞，在相应抗性平板上筛选获得含重组DNA的转化子。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体为可对靶标DNA进行缺失、突变和插入外源DNA片段，一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒。
背景技术
DNA重组技术自从20世纪70年代初期问世以来，经过了近40年的发展历程，无论是在基础理论研究领域，还是在生产实际应用方面，都已经取得了惊人的成绩。DNA重组技术不仅使整个生命科学的研究发生了前所未有的深刻变化，同时也有力地促进了医学科学研究的发展，在疾病的临床诊断、遗传病的基因治疗、新型疫苗的研制以及癌症和艾滋病的研究等诸多科学均已取得了相当的成就。
然而，利用限制性内切酶和连接酶为主要工具的传统DNA重组技术，很难对像BAC文库这样的大分子DNA进行修饰。传统DNA重组技术中，大多要求DNA片段上存在单一的限制性内切酶位点，而在大分子DNA中一般的内切酶都存在多个位点。另外，大分子DNA的体外操作困难、易断裂，连接、转化效率也随DNA片段长度的增加而下降。
如果可以在细菌体内完成DNA重组操作，将可以解决以上传统DNA重组技术中存在的不足之处。研究发现，来自发光杆菌(Photorhabdusluminescens)的重组酶——Plu2935和Plu2936可以在细菌体内协同作用，完成DNA分子之间的重组。Plu2936为5’-3’核酸外切酶，Plu2935为单链DNA退火蛋白。在进行DNA重组时，Plu2936与双链线性DNA片段结合并按5’-3’方向降解DNA单链，在另外一条DNA链上产生3’突出端。接着，Plu2935便与DNA 3’突出端结合，形成蛋白-DNA复合体。在受体DNA进行复制时，蛋白-DNA复合体寻找同源序列的DNA并退火，新成新的DNA分子。在Plu2935和Plu293重组酶的配合作用下，带有短同源臂(35～50bp)的供体DNA分子可以在体内重组到受体DNA分子的同源区域上，从而实现对DNA分子的替换、插入、删除、突变等多种修饰。该重组酶体系对靶标DNA分子的大小没有限制，不受内切酶位点的限制，不需要体外链接和转化过程，可以对各种大小DNA分子进行操作，尤其DNA大分子修饰方面具有独特的优势。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于：提供一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒，以解决背景技术中的问题。
一种快速高效DNA重组的方法包括以下两步：
1.引物设计与PCR扩增
因为Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同源的序列。PCR扩增的条件一般为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min(时间长短根据PCR产物大小设定，一般是1min/1kb DNA)，30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物。因为模板DNA可能会被转化进BL-REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难。引物则可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降。
2.DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞
将纯化的PCR产物(供体DNA)与受体DNA片段按照摩尔比1∶1混匀，取DNA混合物(＜10μg)加入到BL-REC感受态细胞中，混匀后加入到电转杯中，1250v电击一次。在电击杯中加入1mL复苏液(SOC培养基，0.1mM的MgCl2溶液)，将细菌悬浮并转移至Ep管中，37℃复苏1h，涂板，37℃倒置培养。挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。
一种快速高效DNA重组的试剂盒，本发明在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达来自发光杆菌的重组酶基因——plu2935和plu2936，利用重组酶Plu2935和Plu2936共同作用，在不需要体外酶切、链接的情况下完成DNA重组，达到快速、高效修饰DNA的目的，由表达重组酶的感受态细胞、对照感受态细胞、标准样品、复苏液组成。
在本发明中，所述的重组酶的感受态细胞，由经IPTG诱导过的BL-REC工程菌制备，所述的BL-REC工程菌，由克隆有发光杆菌重组酶基因的pET32a质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中构建而成，所述的发光杆菌重组酶基因，由plu2935和plu2936基因组成的共表达框，所述的对照感受态细胞，由未经诱导的BL-REC工程菌制备，所述的标准样品，包括pUC19质粒和含同源序列的氯霉素抗性基因PCR产物组成，氯霉素抗性基因PCR产物，所述的pUC19质粒，200ng/μL的水溶液，所述的氯霉素抗性基因PCR产物，200ng/μL的水溶液，所述的复苏液，由SOC培养基和0.1mM MgCl2溶液均匀混合而成。
有益效果：
本发明操作简单，效率较高，尤其在DNA大分子修饰方面具有独特的优势。
附图说明
图1重组酶Plu2935和Plu2936的工作模型
图2重组酶表达质粒pET-plu构建
图3试剂盒中标准样品重组效率的检测
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒，首先制备DNA重组试剂盒：
1.抽提发光杆菌总DNA
将发光杆菌接种到LB斜面，30℃培养6～8h进行活化，然后接一环于50ml LB液体培养基中，30℃，200r/min摇床培养过夜。离心收集菌体，用TES溶液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，100mM NaCl)冲洗一次。离心，沉淀重悬于TE1(25％蔗糖，25mM Tris-HCl，pH8.0，25mM EDTA)中，加入十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为2％，混匀使细胞裂解，加入1M NaCl溶液，37℃温育5min。离心，取上清，等体积酚：氯仿抽提，2倍体积乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，吹干，用溶于一定体积的溶液TE2(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中，再加入1MNaCl，10μg/mlRNase，0.6mg/ml蛋白酶K，37℃温育30min。等体积酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，加100ml水溶解沉淀，-20℃保存。
2.PCR扩增plu2935和plu2936基因
设计引物两对引物Plu5-F/Plu5-R，Plu6-F/Plu6-R。Plu5-F：5’-GCCCAT GGCCATGAGCACAGCAGTACAAAAAG-3’(Nco I)，Plu5-R：5’-CTAGGG ATCCTTATGATGCCTTTTTCC-3’(BamH I)；Plu6-F：5’-AAGGATCCCTAGCAGGAGGAATTCATATGATCAGCAATGAACTCATTC-3’(BamH I)，Plu6-R：5’-GCGAGCTCTCATTTCCATTGATCGCCAAATTTG-3’(Sac I)。以发光杆菌总DNA为模板，以Plu5-F/Plu5-R或Plu6-F/Plu6-R为引物，分别PCR扩增plu2935基因和plu2936基因。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45sec；，58℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min。采用试剂盒回收纯化PCR产物，-20℃保存。
3.重组酶基因plu2935和plu2936克隆入pET32a载体
Nco I和BamH I双酶切pET32a和plu2935基因的PCR产物，连接、转化DH5α，获得的质粒命名为pET-plu2935。BamH I和Sac I双酶切pET-plu2935和plu2936基因的PCR产物，连接、转化DH5α，获得重组酶表达质粒pET-plu。将pET-plu转入宿主菌BL(DE3)中，获得工程菌BL21-REC。
4.制备高效表达重组酶的工程菌感受态细胞
将工程菌BL21-REC接入5ml LB培养基中，37℃培养过夜。按2％接种量转接到50ml LB培养基中，37℃振荡培养1.5h左右，至OD600值达0.2～0.3，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃培养1h，诱导表达重组酶Plu2935和Plu2936。4℃，10000rpm离心5min收集菌体，倒净培养基，加入10mL预冷无菌水，充分悬浮菌体。4℃，10000rpm离心5min收集菌体，倒净无菌水，加入10mL预冷无菌水，充分悬浮菌体。4℃，10000rpm离心5min收集菌体，倒净无菌水，加入0.5mL无菌水悬浮菌体，将感受态细胞按每管50μL分装到EP管中，-80℃保存。
5.制备重组效率测试标准样品和对照样品
为了检测4中感受态细胞中重组酶Plu2935和Plu2936的重组活性，我们制备了用于重组效率测定的标准样品，包括：氯霉素抗性基因的PCR产物和pUC19质粒。设计引物对Chl-F/Chl-R，PCR扩增氯霉素抗性基因。Chl-F：5’-ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTTACCTGTGACGGAAGATCACTTC-3’(下划线部分40的碱基为pUC 19质粒同源序列，其余部分为卡那霉素抗性基因的引物部分)，Chl-R：5’-AATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCATCCGCTTATTATCACTTATTC-3’(下划线部分40的碱基为pUC19质粒同源序列，其余部分为氯霉素抗性基因的引物部分)。氯霉素抗性基因的PCR产物中存在40bp与pUC19质粒同源序列。
同时，我们还设置了对照感受态细胞(Control)。除了不加入IPTG进行诱导外，对照感受态细胞的制备与4中表达重组酶的BL21-REC工程菌制备完成一致。因为没有进行IPTG诱导，对照感受态细胞中没有重组酶Plu2935和Plu2935表达，无法进行DNA重组，在相应抗生素平板上不会有克隆子出现。
一种快速高效DNA重组的方法：
1.引物设计与PCR扩增
因为Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同源的序列。PCR扩增的条件一般为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min(时间长短根据PCR产物大小设定，一般是1min/lkb DNA)，30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物。因为模板DNA可能会被转化进BL-REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难。引物则可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降。
2.DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞
将纯化的PCR产物(供体DNA)与受体DNA片段按照摩尔比1∶1混匀，取DNA混合物(＜10μg)加入到BL-REC感受态细胞中，混匀后加入到电转杯中，1250v电击一次。在电击杯中加入1mL复苏液(SOC培养基，0.1mM的MgCl2溶液)，将细菌悬浮并转移至Ep管中，37℃复苏1h，涂板，37℃倒置培养。挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。
利用本发明测定的plu2935和plu2936共表达框序列：
ATGAGCACAGCAGTACAAAAAGTTTATGAAATCATCAACCCGCTCAAG
ACTGAATTTGAGCAAATTTGTAGTGAGCCGGGCATAGTATTTAAACGTG
AGTCTGAATTTGCTATGCAGATATTCGCAAATAATGATTTTTTAGCCACA
ACTGCATTAAATAATCCGGTTTCAGCGCGTAGCGCAGTAATGAACATTG
CAGCAATTGGCATTAGTCTAAACCCTGCGCAAAAGCTGGCTTATCTAGT
GCCACGAAACAAAAGCGTGTGTCTTGATATCAGTTACATGGGTTTTGATG
CACATCGCTCAACAATCGGGTGCTATTAAGTGGTGTCAATCCGCTGTTG
TTCGAAAAAATGACATATTCAAGCGCACATCTATTGATACTGCGCCAAT
TCACGAATACAACGAATTCGACACAGCGCAATCGAGGGGGGACATTGT
CGGCGCGTATACAGTAATCAAAACGGATGACTGTGATTACATTACTCAC
ACAATGAGAGCATCAGCTATATTTGATATCAGAGATAGATCATCGGCATG
GATAGCATATAAAACAAAAGGGAAATCGTGTCCGTGGGTCACGGACGA
GGAACAAATGATTTTAAAAACCGTAGTCAAGCAGGCGGCTAAGTATTG
GCCTCGCAGGGAGCGATTAGATAAAGCCATTGACTATGTAAACACAGA
GGCGGGTGAAGGAATTGATTTTAGCAAAGGTCAAAACTCTTACATTGA
CGTAACTCCCGCAGCAGATAGCACAATCGAAAGTATAACAAACTTACTT
ACAACAATGAATAAAACTTGGGACGATGATTTACTTCCACTTTGTTCAA
AGATATTCAGACGACAAATATTATCACCCGCCGAATTAACAGAGTCGGA
GGCAATTAAAGCATCTGATTTTTTAAGGAAAAAGGCATCATAAGGATCC
CTAGCAGGAGGAATTCATATGATCAGCAATGAACTCATTCTCAGCAAAA
CAGGGGTTGATTTGCTCACAGTCGAACAGGGAAGTCATGATTGGCAGC
GGTTAAGATTGGGAGTAATAACGGCATCGGAAGCCGGAAAAGTGATAT
CAAAACCGCGTAGTGGTACAAAATGGACAGACATGAAGCTGACATATT
TCTATACACTTCTGGGCGAAGTGTGCACAGGTAGTACGCCGGAAGTAA
ATGCAAAAACATTAGCGTGGGGAAAAAATTACGAAGAATCAGCAAGA
GCAACTTTTGAATTTGTAGCTGATGTAAATGTAACGGAAACTTCAATTC
TATTTAAAGATGAATCGCTCAGAACCGCATGCTCACCAGATGGTATTTG
TAGTGACGGACTTGGGCTTGAACTTAAATGTCCTTTTACTACTGCTGTA
TTTATGAAATTCCGCTTGGGTGGTTTTGATGCTATTAAATCTGAATATAT
GGCTCAAGTTCAATATTCGATGTGGGTCACAGGTAAAAATGAATGGTAC
TTTGCTAATTATGACCCGCGTATGACTCGTGAAGGGATTCATTACGTTGT
TGTTGAGCGTGACAACGAATATATGAGTCAGTTTAATGATATGGTTCCC
GATTTCATAGAAAAAATGGACGAATCATTAAATGAAATCGGCTTCAAAT
TTGGCGATCAATGGAAATGA
利用本发明测定的含同源序列的氯霉素抗性基因序列：
ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTTACCTGTGA
CGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATAC
CGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC
ACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGG
CGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATG
GAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATC
GTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAA
CCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAA
AAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGA
TGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGG
TGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAAC
TGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCA
GTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTG
GCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAA
TCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGAC
AACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCG
ACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGA
TGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGAT
GAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTT
AAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGCTGTC
AGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATT
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种快速高效DNA重组的方法，其特征在于，包括以下两步：
(1).引物设计与PCR扩增：Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同源的序列；PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min，30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物，因为模板DNA可能会被转化进BL-REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难，引物则可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降；
(2).DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞：将纯化的PCR产物与受体DNA片段按照摩尔比1∶1混匀，取小于10μg的DNA混合物，加入到BL-REC感受态细胞中，混匀后加入到电转杯中，1250v电击一次；在电击杯中加入1mL复苏液，所述的复苏液为SOC培养基和0.1mM的MgCl2溶液，将细菌悬浮并转移至Ep管中，37℃复苏1h，涂板，37℃倒置培养；挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。
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