CN106754606A - 柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法 - Google Patents

柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法包括步骤：(1)提取柑橘溃疡病菌DNA；(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：A、以引物Hfq‑up‑F、Hfq‑up‑R，Hfq‑down‑F、Hfq‑down‑R分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列；B、回收PCR片段；C、将回收产物分别与载体pEASY‑T1vector连接；D、连接产物分别转化大肠杆菌；E、提取阳性克隆质粒；F、双酶切上/下游T‑载体重组质粒、pK18mobSacB；G、酶切后产物连接，连接液转化DH5α大肠杆菌；(3)将重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌；(4)蔗糖培养基法筛选突变体。

Description

柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基因无标记缺失突变体的筛选方法，具体涉及一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法。
背景技术
柑橘溃疡病菌(拉丁名：Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)为假单胞菌目、黄单胞菌科、黄单胞杆菌属，引起柑橘溃疡病。革兰氏阴性菌，好气性，短杆菌。造成的病害主要发生在叶、小枝、刺、老枝和果实上，引起落果和落叶。
目前在细菌中应用的基因突变策略主要有三种：(1)携带目的基因部分片段的自杀载体通过单交换同源重组实现基因插入突变；(2)转座子介导目的基因体外突变，然后与目的基因双交换同源重组实现基因插入或缺失；(3)自杀载体中引入负选择标记，实现目标基因无标记缺失，这种突变具有不引入抗生素基因，且一次可敲除多个基因等优点。
自杀载体是指能在一种宿主内复制但在另一宿主中却不能的质粒或噬菌体。枯草芽孢杆菌的SacB基因被引入至异源宿主(主要是革兰氏阴性菌)时，其在外源蔗糖存在的情况下会导致宿主死亡。SacB基因介导的无标记基因缺失突变体系已经广泛运用到多种革兰氏阴性和阳性细菌中，其中常用的自杀载体就是pK18mobSacB。革兰氏阴性植物病原菌在SacB基因的存在下，于5％-10％的蔗糖培养基上产生致死表型。该基因介导的无标记基因缺失体系，需通过同源双交换来进行，传统的方法是先扩增缺失基因的上下游侧翼序列，然后经过酶切连接等手段将上下侧翼序列连接到自杀载体pK18mobSacB(该载体上面还有卡那霉素抗性基因)，转化重组质粒到宿主细胞。经卡那霉素和无糖固体培养基筛选经电转将质粒整合到宿主基因组上的重组子。筛选的转化子经无糖培养基扩大培养后转接到含5％-10％蔗糖的液体培养基，使其产生蔗糖筛选压力。最后将蔗糖液体培养基的菌液涂布到蔗糖固体培养基，获得单菌落，并将这些单菌落一一划线到有抗和无抗平板上，对比有抗平板上不能生长而在无抗平板上能生长的菌落进行PCR检测，寻找突变体，最后进行一系列验证。传统的筛选方法效率较低，且工作量大。并且，目前没有关于柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法，包括如下步骤：
(1)提取柑橘溃疡病菌基因组DNA；
(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：
A、分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列：以柑橘溃疡病菌基因组DNA为模板，以引物Hfq-up-F、Hfq-up-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上游侧翼序列，以引物Hfq-down-F、Hfq-down-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因下游侧翼序列；所述引物Hfq-up-F、Hfq-up-R、Hfq-down-F、Hfq-down-R的序列为：
Hfq-up-F：TGGGATCCCGCGTGTTGAAGGTGGTATT，
Hfq-up-R：TGGGTACCCGAAAAATCCTCTTCATTATTGT，
Hfq-down-F：TGGGTACCCGGAGTAGTGCGTGTTTGATC，
Hfq-down-R：GCTCTAGAAAGCCTCTGCACCGGTCAACA；
B、分别回收步骤A得到的柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列PCR扩增产物片段；
C、将步骤B的回收产物分别与载体pEASY-T1vector连接，得到上游T-载体连接产物和下游T-载体连接产物；
D、将步骤C得到的上游/下游T-载体连接产物分别转化大肠杆菌；
E、提取步骤D中的阳性克隆的质粒，分别得到上游T-载体重组质粒和下游T-载体重组质粒；
F、用BamHI和KpnI双酶切上游T-载体重组质粒，用KpnI和XbaI双酶切下游T-载体重组质粒，用BamHI和XbaI双酶切质粒pK18mobSacB；
G、将步骤F得到的上/下游T-载体重组质粒与质粒pK18mobSacB酶切后产物进行连接，将连接液转化入DH5α大肠杆菌感受态，保存经筛选获得的阳性克隆即缺失hfq基因的重组自杀质粒载体；
(3)将步骤G构建好的缺失hfq基因的重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌感受态细胞，挑取转化后经Kan+无糖NA筛选的单菌落；
(4)将步骤(3)挑取的单菌落用蔗糖培养基筛选，即得突变体。
所述步骤A中分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列，扩增上、下游侧翼序列的PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 10μL、10mM的上下游引物各0.5μL、浓度为100～200ng/μL的柑橘溃疡病菌基因组DNA0.5μL、加ddH2O补足至20μL；
扩增上游侧翼序列的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；72℃10min；
扩增下游侧翼序列的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s，32个循环；72℃10min。
本发明的另一方面提供了一种用蔗糖培养基筛选柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的方法，包括如下步骤：
(1)挑取前述步骤(3)中缺失hfq基因的重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌感受态细胞后经Kan+无糖NA筛选的单菌落，接到无蔗糖的NB培养基中培养过夜；
(2)将步骤(1)扩繁的菌液转接到新的无糖NB培养基中，连续培养4-5代；
(3)将步骤(2)获得的菌液，稀释后涂布到Kan+无糖NA的筛选培养基上，28～30℃，放置24～36h；
(4)将步骤(3)获得的单菌落一一划线到含有5～10％的蔗糖的NA培养基，28～30℃，培养68～72h；
(5)将步骤(4)获得的菌落，再一一划线到对应的Kan+无糖NA和5～10％蔗糖NA板上，放置24～36h；
(6)将步骤(5)中抗性平板上不能生长而在无抗平板上能生长的菌落，进行初步验证突变；
(7)将步骤(6)获得的疑似突变体菌落，挑到NB培养基中培养，连续传代，将能稳定遗传的菌落进行验证，得到柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体。
在上述技术方案中，所述步骤(6)中验证突变的方法为PCR验证：提取突变体的基因组DNA，用检测突变的引物Hfq-F/Hfq-R验证缺失片段的大小是否与目的基因hfq的大小一致，所述引物Hfq-F/Hfq-R的序列为：Hfq-F：GCTTCAGGCGTGTAACATCC，Hfq-R：GCGAACTCCTCCAACACATC。
作为优选地，所述步骤(6)中验证突变的方法为测序验证或者Southern blot验证。
本发明的有益效果是：本发明首次成功筛选出了柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体，为进一步研究hfq的致病机理、鉴定hfq直接调控靶标，以及发掘与hfq相互作用的sRNA等奠定基础，同时为柑橘溃疡病菌的防治研究工作奠定了良好的基础。本发明的蔗糖培养基筛选柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的方法成功地得到了突变体，解决了传统蔗糖培养基筛选方法找不到突变体或者需要大量的挑单菌落划线才能找到很少的突变体的问题，本发明方法工作量大大减少、筛选效率更高。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图，1：扩增侧翼序列；2：侧翼序列融合；3：缺失载体；4、5：第一次交换；6：第二次交换；7：缺失突变体。
图2是缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的PCR产物电泳图谱，M：maker2000；1、2、3、4、5、6、7、8为缺失hfq基因的重组质粒样品；9为负对照；10为基因组DNA对照。
图3是筛选出的疑似突变体菌落用引物Hfq-F/Hfq-R验证的PCR产物电泳图谱，M：maker5000；1-37为菌落样品，其中验证发现13、14、34为缺失突变体，38为缺失重组质粒正对照。
图4是突变体基因组DNA用引物SacB F/SacB R PCR扩增后的电泳检测图谱，M：maker2000；1-8为突变体样品；9为负对照；10为重组质粒载体。
图5是突变体Southern blot检测结果，1、2：突变体，3：Xcc野生型对照。
图6是突变体生长曲线测定结果图。
图7是突变体游动性检测结果图。
图8是传统的蔗糖培养基筛选突变体的部分PCR产物电泳图谱，M：maker2000；1-38为筛选出的菌落样品。
具体实施方式
实施例一、准备实验材料
一、培养基的配置
用于E.coli培养的液体和固体培养基的各组分为：Tryptone 10g/L、NaCl10g/L、Yeast Extract 5g/L，加水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌。LB固体培养基另加Agar 15g/L。
用于黄单胞菌培养的NA固体和NB液体培养基的各组分为：Polypeptone5g/L、Sucrose 10g/L、Yeast Extract 1g/L、牛肉浸膏3g/L、Agar 15g/L，加水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌，NB液体培养基去掉Agar。
二、主要试剂及来源
细菌基因组DNA提取试剂盒：美国Axygen公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒：美国Promega公司；Southern杂交试剂盒：德国Roche公司；BamHI、KpnI、KpnI、XbaI、BMJM 109感受态细胞、DH5α大肠杆菌：日本Takara公司；Sph I、instant sticky-end ligase matermix：美国NEB公司；2×Taq PCR Mix：北京艾德莱公司生物科技有限公司；pEASY-T1vector：北京全氏金生物技术有限公司；pK18mobSacB质粒：福建农林大学邹华松教授惠赠；本实施例使用的柑橘溃疡病菌株是29-1：上海交通大学陈功友教授惠赠。
实施例二、柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选
其流程如图1所示，具体按照如下步骤操作：
一、提取柑橘溃疡病菌基因组DNA
采用Axygen公司细菌基因组DNA提取试剂盒来提取柑橘溃疡病菌细菌培养物的总DNA。
二、缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建
1、扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上下游侧翼序列
(1)扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上游侧翼序列，扩增引物为：
Hfq-up-F：TG GGATCC CGCGTGTTGAAGGTGGTATT(SEQ ID No:1，下划线处为BamH I酶切位点)
Hfq-up-R：TG GGTACC CGAAAAATCCTCTTCATTATTGT(SEQ ID No:2，下划线处为KpnI酶切位点)
以前面提取的柑橘溃疡病菌基因组DNA为模板，用引物Hfq-up-F、Hfq-up-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上游侧翼序列，反应体系为：
2×Taq PCR Mix(含染料2) 10μL
Hfq-up-F(10mM) 0.5μL
Hfq-up-R(10mM) 0.5μL
ddH2O 8.5μL
柑橘溃疡病菌基因组DNA(100-200ng/μL) 0.5μL
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；72℃10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增出的正确片段长度为480bp。
(2)扩增柑橘溃疡病菌hfq基因下游侧翼序列，扩增引物为：
Hfq-down-F：TG GGTACC CGGAGTAGTGCGTGTTTGATC(SEQ ID No:3，下划线处为KpnI酶切位点)
Hfq-down-R：GC TCTAGA AAGCCTCTGCACCGGTCAACA(SEQ ID No:4，下划线处为XbaI酶切位点)
以前面提取的柑橘溃疡病菌基因组DNA为模板，用引物Hfq-down-F、Hfq-down-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因下游侧翼序列，反应体系为：
2×Taq PCR Mix(含染料2) 10μL
Hfq-down-F(10mM) 0.5μL
Hfq-down-R(10mM) 0.5μL
ddH2O 8.5μL
柑橘溃疡病菌基因组DNA(100-200ng/μL) 0.5μL
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s，32个循环；72℃10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增出的正确片段长度为680bp。
2、柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列的PCR产物回收
将前述的柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳后用Promega公司的胶回收试剂盒进行回收，分别得到回收的上、下游侧翼序列PCR产物。
3、PCR纯化产物连接
用pEASY-T1vector将前述回收得到的上、下游侧翼序列PCR产物分别直接与载体连接，连接体系如下：
pEASY-T1vector 1μL
上/下游侧翼序列PCR回收产物 0.5-4μL
加ddH2O 至3-5μL
轻轻混合，室温反应10min，分别得到上游T-载体连接产物和下游T-载体连接产物。
4、将上游/下游T-载体连接产物分别转化大肠杆菌，按照如下步骤操作：
(1)将上游/下游T-载体连接产物稍许离心后加到置于冰上的1.5mL离心管中；
(2)取出BMJM 109感受态细胞，放置在冰水浴中直至融化，轻轻振动离心管使之混匀；
(3)在准备的每个转化管中加入50μL感受态细胞；
(4)轻轻振动小管混匀，冰水浴30min，在42℃水浴中热击60～90s；
(5)迅速冰水浴2min；
(6)向转化细胞中加平衡至室温的800μL LB液体培养基，在37℃，150rpm摇床中复苏培养1～1.5h；
(7)室温4000rpm离心5min，倒去上清液，余下100～150μL上清重悬菌体，将重悬菌体涂到IPTG、X-Gal加入到预先加入了卡那霉素的固体LB培养平板上，将平板于37℃倒置过夜培养，至蓝、白斑区分明显为止。
转化子检测及测序：
(1)菌落平均直径2mm左右时，取出平板正置于4℃1h使蓝白斑清晰；用火焰灭菌的镊子夹取灭菌10μL枪头挑取白色单克隆菌斑，涂抹至PCR管底，再接种至1mL LB+Kan液体培养基(按1mL LB液体培养基加1μL 50mg/mL Kan)，37℃恒温条件下220rmp振荡培养8h。
(2)选菌液PCR阳性样品2-3个进行双向测序(每管取500μL菌液)，剩余菌液可加40％灭菌甘油使其终浓度为20％，-20℃保存。
5、重组白斑质粒的提取
将送基因测序正确的阳性克隆的菌液扩大培养，取5mL用Promega公司的质粒提取试剂盒提取质粒，得到上游T-载体重组质粒和下游T-载体重组质粒。
6、上、下游T-载体重组质粒及自杀载体的双酶切
(1)上游T-载体重组质粒的酶切位点是BamHI和KpnI，下游T-载体重组质粒的酶切位点是KpnI和XbaI。在1μg的上/下游T-载体重组质粒中添加10U的限制性内切酶，在50μL的反应体系中，37℃下反应1h可以完全降解DNA。
上游T-载体重组质粒的酶切体系为：
下游T-载体重组质粒酶切体系为：
(2)pK18mobSacB质粒的提取、酶切、与回收(BamHI和XbaI)(见NEB双酶切试剂盒)。
将上/下游T-载体重组质粒与pK18mobSacB质粒酶切的目的片段分别回收，备用。
7、将前述回收得到的上/下游T-载体重组质粒与pK18mobSacB质粒酶切的目的片段进行连接，构建缺失hfq的重组质粒。连接体系为：上/下游T-载体重组质粒酶切的目的片段(10ng/μL)各2.5μL，instant sticky-end ligase mater mix2μL，用移液枪混7-10次，然后加0.5μLpK18mobSacB质粒酶切的目的片段和3μL的instant sticky-end ligase matermix，用移液枪混7-10次。最后将连接液转化入DH5α大肠杆菌感受态中，并用卡那霉素(Kan)筛选重组质粒，挑选单克隆摇菌，做菌液PCR，并送菌液进行基因测序，将阳性克隆的菌液以40％的甘油保存在-80℃，即得到缺失hfq基因的重组自杀质粒载体。重组质粒的提取、验证方法参考前述步骤“5、重组白斑质粒的提取”。缺失hfq基因的重组自杀质粒载体PCR验证结果，如图2所示，与野生型相比，重组自杀质粒载体刚刚缺失掉hfq基因279bp的片段，说明成功构建了缺失质粒。
三、制备柑橘溃疡病菌的感受态细胞
按照如下步骤操作：
(1)柑橘溃疡病菌在NA平板上28℃生长活化,将单菌落细胞接入3mLNB液体培养基中；
(2)28℃震荡培养(180rpm)24h至OD600＝1.0，吸取1mL培养液转接入100mL新的NB液体培养基中28℃继续培养8-14h，至OD600＝0.6左右；
(3)将菌液转至预先冷却的50mL灭菌的离心管中，冰上放置l0min，冰上冷冻10min，使其停止生长(后面步骤需在冰浴条件完成)；
(4)4℃,6000rpm离心l0min收集菌体，倒出培养液，将管倒置1min使残留的痕量培养液流尽；
(5)收集的菌体细胞用30mL10％的甘油(灭菌预冷)于4℃,6000rpm离心l0min，洗涤三次；
(6)最后的菌体细胞用0.5mL 10％预冷的甘油定容，使感受体细胞浓度达到l08cfu/mL，感受态细胞分装为90μL/管，储存在-70℃下备用。
四、重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌
将前述步骤二中构建好的缺失hfq基因的重组自杀质粒载体通过电击转化到柑橘溃疡病菌的感受态中，按照如下步骤操作(除电击步骤，其他均需无菌操作)：
(1)将制备好的感受态放在冰盒中解冻，同时将经过灭菌处理过的电击杯和重组子放在冰上预冷。
(2)加10μL待转化质粒到融化的90μL感受态中，放置30min，吸入电击杯中，注意不要有气泡。
(3)将仪器电压升到2.0KV。
(4)把装好细胞的电脉冲杯外壁檫干，并放入接应器上，把接应器推至电极之间，用食指和中指同时按住两个脉冲键，听到“吱”声放电完毕后放手，脉冲时间一般为3ms；
(5)立即取出电脉冲杯，并在10s内加入1mL的无糖NB培养基。
(6)无菌条件下降混合物转入2mL离心管中，28℃180rpm振荡培养3h，浓度尽量大一些。
(7)5000rpm离心3min，吸去部分上清，留100-200μL菌液混合后均匀涂布到不含蔗糖含Km 50μg/mL NA培养基上，28℃倒置培养3天观察是否长出单菌落。
五、利用同源双交换筛选突变体
(1)挑取电转后经Kan+无糖NA筛选的单菌落，接到3mL无蔗糖的NB培养基中28℃，200rmp培养过夜，使得菌液浓度尽量大一些。
(2)转接30μL菌液到新的3mL无糖NB里面，连续培养4-5代，至OD＝0.5。
(3)将前面获得的OD＝0.5的菌液，按照10倍比稀释105，吸取60μL涂布到Kan+无糖NA的筛选培养基上，28℃，放置24h。
(4)将获得的单菌落一一划线到含有10％的蔗糖的NA培养基，划100单菌落，28℃，培养72h，观察菌落的生长情况。
(5)将获得10％蔗糖NA板上的菌落，再一一划线到对应的10％蔗糖NA和Kan+无糖NA板上，放置24h，观察两个板上菌落生长情况。
(6)将抗性板上不能生长而在10％蔗糖NA板上生长的菌落，进行菌落PCR初步验证突变。
(7)将获得的疑似突变体菌落，挑到NB培养基中培养，连续传代5次，看是否能稳定遗传，将能够稳定遗传的保存菌液。
六、缺失突变体的验证
1、采用PCR验证
A、参照NCBI中Xanthomonas axonopodis Xac29-1全基因组设计hfq的上下游引物：
hfq基因上游引物Hfq-F:GCTTCAGGCGTGTAACATCC(SEQ ID No:5)，
hfq基因下游引物Hfq-R:GCGAACTCCTCCAACACATC(SEQ ID No:6)。
提取步骤“五、利用同源双交换筛选突变体”中步骤(7)中能够稳定遗传的菌液的基因组DNA，用检测突变的引物Hfq-F/Hfq-R验证缺失片段的大小是否与目的基因一致。在100个菌落中筛选到6个突变体，100个菌落的部分PCR电泳图谱如图3所示，图中13、14、34为缺失突变体，38为缺失重组质粒正对照。
B、用pK18mobSacB的引物SacB F/SacB R验证自杀载体是否存在，引物序列为：
SacB F：GATCTAGAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG(SEQ ID No:7)；
SacB R：CAGTCGACCTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC(SEQ ID No:8)。
在突变体中不能检测到SacB基因，与预期一致，部分检测结果如图4所示。
2、测序验证
用引物Hfq-F/Hfq-R扩增突变体的基因组DNA，并将目的片段进行测序，结果显示缺失片段刚好是目的基因。
3、Southern blot验证
主要实验步骤如下：
(1)提取柑橘溃疡病菌基因组DNA
操作步骤参照细菌基因组DNA小量提取试剂盒(Axygen)。nanodrop检测基因组DNA的浓度，1％的琼脂糖电泳纯度，-20℃保存备用。
(2)基因组DNA酶切
使用NEB公司Sph I限制性内切酶于37℃下酶切4h，具体的酶切体系如下：
(3)DNA酶切产物的琼脂糖凝胶电泳
(4)探针制备
设计探针引物，进行常规PCR扩增，做琼脂糖凝胶电泳，对目的带切胶回收，进行地高辛(DIG)标记。各个样品加样量如下：
移液枪吹打，充分混匀，37℃处理20h，65℃处理10min终止反应，得到探针。
(5)探针标记效率(浓度)检测。
(6)转膜。
(7)杂交。
(8)洗膜。
(9)免疫检测。
检测结果如图5所示，突变体和野生型对照相比缺失了hfq基因片段大小。
4、生长曲线测定
挑选活化后野生型、突变体单菌落，采用新鲜的NB液体培养基，28℃，200rpm，过夜培养，调节三者OD600＝0.6，按照1:1000的比例转接至5mL新鲜的NB液体培养基。28℃，200rpm每隔2h测一次OD600值，试验设置3个重复，取平均值作图，结果如图6所示，可见，缺失hfq基因能引起Xcc菌株在NB培养基中的对数期和平台期都较野生型菌株晚，同时也表明缺失该基因会影响Xcc的生长。
5、游动性检测
挑选活化后野生型、突变体单菌落，采用新鲜的NB液体培养基，28℃，200rpm，过夜培养，调节三者OD600＝0.6，吸取2μL菌液于0.3％琼脂糖NA固体培养基上，28℃，培养48h，观察菌落生长情况，并测量菌落直径，拍照。试验设置3个重复，重复3次实验。结果如图7所示，可见，突变体游动性明显降低，该基因对Xcc的鞭毛有重要作用。
实施例三、传统的和改进后的蔗糖培养基筛选突变体方法的对比
一、传统的蔗糖培养基筛选突变体步骤为：
(1)挑取电转后经Kan+无糖NA筛选的单菌落，接到3mL无蔗糖的NB培养基中28℃，200rmp培养过夜。
(2)将上一步扩繁的菌液按照1:100的比例，转接到10％的蔗糖NB培养基中28℃，200rmp传代3-4次；
(3)将传代后OD600＝0.5的菌液稀释101、102、103、104、105，吸取60μL涂在10％的蔗糖NA板上，28℃，培养72h；
(4)将10％蔗糖NA板上的单菌落一一划线到Kan+无糖NA(有抗)和10％蔗糖NA(无抗)的平板上，划100单菌落，28℃，培养36h，观察菌落的生长情况。
(5)对无抗平板上能生长，有抗平板上不能生长的菌落进行PCR验证。
(6)将获得的疑似突变体菌落，挑到NB培养基中培养，连续传代5次，看是否能稳定遗传，并保存菌液。
二、改进后的蔗糖培养基筛选突变体步骤为：
(1)挑取电转后经Kan+无糖NA筛选的单菌落，接到3mL无蔗糖的NB培养基中28℃，200rmp培养过夜。
(2)将上一步扩繁的菌液按照1:100的比例转接到新的无糖NB里面，连续培养4-5代，至OD600＝0.5。
(3)将前面获得的OD600＝0.5的菌液，按照10倍比稀释101、102、103、104、105，吸取60μL涂布到Kan+无糖NA的筛选培养基上，28℃，放置24h。
(4)将Kan+无糖NA获得的单菌落一一划线到含有10％的蔗糖的NA培养基，划100单菌落，28℃，培养72h，观察菌落的生长情况。
(5)将获得10％蔗糖NA板上的菌落，再一一划线到对应的Kan+无糖NA(有抗)和10％蔗糖NA(无抗)板上，放置24h，观察两个板上菌落生长情况。
(6)将抗性板上不能生长而在无抗板上生长的菌落，进行菌落PCR初步验证突变。
(7)将获得的疑似突变体菌落，挑到NB培养基中培养，连续传代5次，看是否能稳定遗传，并保存菌液。
三、将两种方法对比，可以发现改进后的筛选方法更能降低第一次交换成功的菌株，在蔗糖存在下，发生第二次交换并回复为野生型菌株的数量。进而增加筛选缺失突变体的概率。改进后的方法较传统方法的优点主要体现在：
(1)筛选效率更高
传统的方法，就Xcc中hfq基因做了1000个以上的单菌落划线没有找到一个突变体，发现一半以上在蔗糖压力下回复到野生型，另外一部分则不发生第二次交换，部分筛选结果如图8所示。
改进后的方法100个单菌落划线可以找到5-10个突变体(部分筛选结果如图3所示)，另有少数几个不发生双交换，另外的恢复到野生型。
(2)减少工作量
传统的方法需要大量的挑单菌落划线，优化后只需要最多划线100个就能筛选到突变体。
序列表
<110> 中国农业科学院柑桔研究所
<120> 柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法
<130> 1
<160> 8
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Hfq-up-F
<400> 1
tgggatcccgcgtgttgaaggtggtatt 28
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Hfq-up-R
<400> 2
tgggtacccgaaaaatcctcttcattattgt 31
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Hfq-down-F
<400> 3
tgggtacccggagtagtgcgtgtttgatc 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Hfq-down-R
<400> 4
gctctagaaagcctctgcaccggtcaaca 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Hfq-F
<400> 5
gcttcaggcgtgtaacatcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Hfq-R
<400> 6
gcgaactcctccaacacatc 20
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> SacB F
<400> 7
gatctagaaagaaacgaaccaaaaggccatataag 35
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> SacB R
<400> 8
cagtcgacctatttgttaactgttaattgtcc 32

Claims (5)

1.一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取柑橘溃疡病菌基因组DNA；
(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：
A、分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列：以柑橘溃疡病菌基因组DNA为模板，以引物Hfq-up-F、Hfq-up-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上游侧翼序列，以引物Hfq-down-F、Hfq-down-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因下游侧翼序列；所述引物Hfq-up-F、Hfq-up-R、Hfq-down-F、Hfq-down-R的序列为：
Hfq-up-F：TGGGATCCCGCGTGTTGAAGGTGGTATT，
Hfq-up-R：TGGGTACCCGAAAAATCCTCTTCATTATTGT，
Hfq-down-F：TGGGTACCCGGAGTAGTGCGTGTTTGATC，
Hfq-down-R：GCTCTAGAAAGCCTCTGCACCGGTCAACA；
B、分别回收步骤A得到的柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列PCR扩增产物片段；
C、将步骤B的回收产物分别与载体pEASY-T1vector连接，得到上游T-载体连接产物和下游T-载体连接产物；
D、将步骤C得到的上游/下游T-载体连接产物分别转化大肠杆菌；
E、提取步骤D中的阳性克隆的质粒，分别得到上游T-载体重组质粒和下游T-载体重组质粒；
F、用BamHI和KpnI双酶切上游T-载体重组质粒，用KpnI和XbaI双酶切下游T-载体重组质粒，用BamHI和XbaI双酶切质粒pK18mobSacB；
G、将步骤F得到的上/下游T-载体重组质粒与质粒pK18mobSacB酶切后产物进行连接，将连接液转化入DH5α大肠杆菌感受态，保存经筛选获得的阳性克隆即缺失hfq基因的重组自杀质粒载体；
(3)将步骤G构建好的缺失hfq基因的重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌感受态细胞，挑取转化后经Kan+无糖NA筛选的单菌落；
(4)将步骤(3)挑取的单菌落用蔗糖培养基筛选,即得突变体。
2.如权利要求1所述的柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法，其特征在于，所述步骤A中分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列，扩增上、下游侧翼序列的PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 10μL、10mM的上下游引物各0.5μL、浓度为100～200ng/μL的柑橘溃疡病菌基因组DNA 0.5μL、加ddH2O补足至20μL；
扩增上游侧翼序列的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；72℃10min；
扩增下游侧翼序列的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s，32个循环；72℃10min。
3.一种用蔗糖培养基筛选柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)挑取权利要求1的步骤(3)中缺失hfq基因的重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌感受态细胞后经Kan+无糖NA筛选的单菌落，接到无蔗糖的NB培养基中培养过夜；
(2)将步骤(1)扩繁的菌液转接到新的无糖NB培养基中，连续培养4-5代；
(3)将步骤(2)获得的菌液，稀释后涂布到Kan+无糖NA的筛选培养基上，28～30℃，放置24～36h；
(4)将步骤(3)获得的单菌落一一划线到含有5～10％的蔗糖的NA培养基，28～30℃，培养68～72h；
(5)将步骤(4)获得的菌落，再一一划线到对应的Kan+无糖NA和5～10％蔗糖NA板上，放置24～36h；
(6)将步骤(5)中抗性平板上不能生长而在无抗性平板上能生长的菌落，进行初步验证突变；
(7)将步骤(6)获得的疑似突变体菌落，挑到NB培养基中培养，连续传代，将能稳定遗传的菌落进行验证，得到柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体。
4.如权利要求3所述的用蔗糖培养基筛选柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的方法，其特征在于，所述步骤(6)中验证突变的方法为PCR验证：提取突变体的基因组DNA，用检测突变的引物Hfq-F/Hfq-R验证缺失片段的大小是否与目的基因hfq的大小一致，所述引物Hfq-F/Hfq-R的序列为：Hfq-F：GCTTCAGGCGTGTAACATCC，Hfq-R：GCGAACTCCTCCAACACATC。
5.如权利要求3所述的用蔗糖培养基筛选柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的方法，其特征在于，所述步骤(6)中验证突变的方法为测序验证或者Southern blot验证。
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