CN1482247A - 非抗生素抗性穿梭质粒表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，是一种非抗生素抗性穿梭质粒表达载体及构建方法和应用。本发明是把基本质粒载体pMG36e，经限制性内切酶EcoRI在其酶切位点上酶切，成为线型。在近红霉素Er端连接非抗生素抗性基因，之后环化回环状。再在这个环上把红霉素基因Er用内切酶去除，形成非抗生素抗性穿梭表达质粒载体。将人或动物疾病的保护性抗原基因连接入本发明的非抗生素抗性质粒载体，可以制造功能性食品，对特定疾病具有预防、保护作用的细菌悬液、口服补剂、管饲产品以及动物性疫苗。本发明用非抗生素可行基因替代红霉素基因，在使用过程中不存在抗生素抗性基因扩散的问题。

Description

非抗生素抗性穿梭质粒表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及非抗生素抗性穿梭质粒表达载体及对以抗生素基因为选择压力质粒载体的非抗生素基因选择压力改造方法，应用此方法构建非抗生素基因选择压力的质粒表达载体，并把这种载体应用在乳酸杆菌科微生物中，特别是应用在乳酸杆菌属微生物中。通过该载体和其在乳酸杆菌属微生物中应用，可用于预防、治疗特定疫病或发挥出其具有的生长调节功能及营养功能。具体而言，本发明涉及对以抗生素基因为选择压力质粒载体的非抗生素基因选择压力改造方案和用此方案构建的质粒载体及使用非抗生素基因选择压力质粒载体制备的可摄食的支持物和含有该支持物的组合物。

技术背景

自1857年巴斯德(Pasteur)发现发酵酸乳的乳酸菌后，又有人相继自肠道分离到双歧杆菌和嗜酸乳酸杆菌，从此开辟了乳酸菌研究的新纪元。

乳酸菌是生物圈中的一个主要成员，它们广泛分布于自然界，如土壤、水、植物中，尤其存在于人畜消化道，除少数外，绝大部分是人和动物体内必不可少的具有重要生理功能的正常菌群。乳酸菌作为活菌制剂及人和动物体内正常菌群的重要成员之一，与人类及动物的生命息息相关，它在生命科学中的应用日益受到人们的关注和得到广泛开发利用。

由于重组保护性抗原的受体菌株主要是活的减毒病原菌，而细菌疫苗的免疫保护力往往和菌株的残余毒力成正比。所以试图寻找能良好地表达外源性抗原且安全的受体菌株日益受到人们的关注。乳酸杆菌为人及动物体内正常菌群的重要成员，以乳酸杆菌作为表达外源保护性抗原基因的受体菌株，就可以将乳酸菌的生物学功能和外源功能抗原基因的特异性免疫相结合，同时乳酸杆菌作为正常生理性细菌，又具有新型疫苗的口服安全、方便、廉价等特点。这类疫苗的研制成功将为新型疫苗的发展探索一条新路。

但迄今为止报道的人和动物消化道共生乳酸杆菌表达载体系统，均是以抗生素抗性作为外源基因稳定表达的压力和筛选标记。将外源抗原基因插入到多克隆酶切位点后，质粒载体在加入抗生素抗性选择标记物的选择平板上由于没有插入外源基因的质粒载体不能存活，而插入外源基因的质粒载体却可以生长，所以很容易筛选到阳性克隆质粒载体，但是随着抗生索的广泛应用甚至是滥用，抗生素耐药性基因扩散问题也日趋严重，因而这类表达系统离“可食性”的要求还有很大的距离，不能直接用于人和动物。由于抗药性基因不断向环境中漂移扩散，可能造成对环境微生态的破坏，带来无法想象的严重后果，现在有些细菌几乎对所有抗生素均产生耐药性一出现了超级细菌；而且耐药性基因可以通过质粒在细菌间传递造成耐药性基因大面积扩散、普及，无论对人体微环境、动物体内环境，还是对大自然生态环境均造成严重污染。据世界卫生组织统计，每年全世界有很多医院内病人的死因是由于耐药性基因扩散而造成抗生素药物失效而导致的重复感染。非抗生素选择压力质粒载体构建策略能避免由于抗生素抗性基因在质粒载体间的传递而引起的一系列问题。所以，构建以非抗生素抗性为标记和选择压力的“食品级”和“饲料级”的乳酸杆菌表达系统就显得十分必要。而且具有巨大的使用价值和市场应用前景。

发明内容

本发明为了克服由于抗药性基因通过质粒在细菌间传递造成耐药性基因大面积扩散、普及，对人体微环境、动物体内环境，大自然生态环境造成严重污染问题，通过构建以非抗生素抗性为标记和选择压力的“食品级”和“饲料级”的乳酸杆菌表达系统，目的是提供一种非抗生素抗性穿梭质粒表达载体及构建方法和应用

本发明的非抗生素抗性穿梭表达质粒载体是把基本质粒载体pMG36e，经限制性内切酶EcoR I在其酶切位点上酶切，使其成为线型。在近红霉素Er端连接非抗生素抗性基因，之后环化回环状。再在这个环上把红霉素基因Er用内切酶去除，形成非抗生素抗性穿梭表达质粒载体，用pMG425t表示。为了更清楚表达非抗生素抗性穿梭表达质粒载体的组成，用下式进行表示：

  pMG36e+ThyA/(β-Gal)-Er＝pMG425t式中，pMG36e为基本质粒载体，它含有红霉素抗性基因，可在大肠杆菌和乳酸杆菌中表达；ThyA/(β-Gal)为非抗生素抗性基因，其中ThyA是胸苷酸合成酶基因，(β-Gal)是β-半乳糖苷酶基因；Er表示红霉素抗性基因；+号表示连接；-号表示去除；＝号表示形成；pMG425t表示本发明的非抗生素抗性穿梭表达质粒载体。

pMG425t具有以下特点：选择标记基因为非抗生素抗性基因，如胸苷酸合成酶基因(ThyA)、β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)，而不是抗生素抗性基因；它可以在大肠杆菌和乳酸杆菌，即革蓝氏阴性菌和革蓝氏阳性菌中进行穿梭表达；载体在ThyA或β-Gal基因缺陷型的大肠杆菌和乳酸杆菌中可以进行功能互补而使受体菌株健康生长。

本发明的非抗生素抗性穿梭载体的构建方法，是把基本质粒载体pMG36e，经限制性内切酶EcoR I在其酶切位点上酶切，成为线型。在近红霉素Er端连接非抗生素抗性基因，之后环化回环状。再在这个环上把红霉素基因Er用内切酶去除，形成非抗生素抗性穿梭表达质粒载体。

本发明非抗生素抗性穿梭载体的构建是以pMG36e为基本质粒载体。pMG36e是一个公开发表的乳酸菌常见穿梭，可在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达，大小为3611bps，红霉素抗性基因为筛选标记，P-32为启动子，载体内一部分限制性内切酶位点如图1。

根据抗生素抗性基因两侧的限制性内切酶种类及位置，设计引物扩增非抗性筛选标记侯选基因，如胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因ThyA或β-半乳糖苷酶基因(β-gal)，再连接到含抗生素抗性基因的载体中，最后用限制性内切酶彻底去除抗生素抗性基因。在这里非抗生素抗性基因就相当于抗生素抗性筛选基因的作用。

由于非抗生素抗性基因本身大小不同，例如ThyA基因有1132个碱基(bp)，β-Gal基因有3660个碱基(bp)，所以连接到载体以后新载体的大小不同；构建载体表达系统所用的受体菌株也不同；相对而言，以ThyA基因为选择压力的载体的外源片段负载量大，而以β-Gal基因为选择压力的载体的外源片段负载量小，只是β-Gal基因本身具有分泌信号肽的功能，所以它应更有利于表达相对较小的外源片段。但以ThyA基因和β-Gal基因为选择压力的质粒载体的构建方法是一致的。以下仅用以ThyA基因为选择压力质粒载体的构建方法进行说明。

现详述本发明非抗生素抗性穿梭质粒载体的构建方法具体过程。

(1)用内切酶EcoR I对质粒载体pMG36e进行酶切，使环状的DNA成为线型，再用聚合酶T4 DNA处理被EcoR I酶切为线型的质粒载体，以备下一步与非抗生素抗性基因进行连接。

(2)扩增非抗生素抗性基因ThyA。以干酪乳酸杆菌的染色体DNA为模板，根据已发表的干酪乳酸杆菌ThyA基因序列，设计了一对引物，在引物的5’端分别加有Pst I和Nsi I酶切位点。所设计的引物的表达式如下：Primer1：5，TC  CTGCAG CAC AGC TTG ATG CGA TC 3’25个碱基

             PstIPrimer2：5，TT  ATGCAT GTG TCA TTG GTA AAC CTG 3’26个碱基

             NsiI

用高保真聚合酶Tag PlusI进行聚合酶链式反应PCR扩增ThyA基因。

(3)将(1)中已切为线型的基本质粒载体pMG36e和(2)中得到的非抗生素抗性基因ThyA进行连接、转化，即ThyA基因与质粒载体pMG36e的连接与转化，其中在连接过程中，所用的线型质粒载体pMG36e与非抗生素抗性基因ThyA的连接的比例在1∶1～1∶10之间。此时载体具有双抗性，即红霉素基因和ThyA基因的质粒载体pMG425et。

因为在线型的基本质粒载体pMG36e和非抗生素抗性基因ThyA连接转化过程中存在未连接上和连接方向错误的问题，所以必须确定ThyA基因连接的正确性与方向性。为了确定连接的正确性与方向性，将上述以双抗性(红霉素和胸腺嘧啶核苷或β-半乳糖苷酶)为选择压力的菌株，进行质粒小抽提、电泳。根据电泳结果选择其中的阳性菌株进行质粒大抽提，再用内切酶Nsi I进行酶切鉴定，以确定ThyA基因插入的正确性与方向性。

(4)彻底去除质粒载体pMG425et中的红霉素抗性基因。用内切酶EcoR I和Nsi I对具有双抗性包含红霉素基因和ThyA基因的质粒载体pMG425et进行酶切，目的是为彻底去除红霉素抗性基因。为了进一步鉴定质粒载体pMG425et中的红霉素基因从分子量角度确定是否彻底被切除，将阳性细菌的提取质粒用内切酶Hinc II进行酶切鉴定。

为了确定红霉素基因是否被彻底去除，必须进行红霉素抗性筛选鉴定，在含有红霉素的LB培养基上鉴定重组载体，以确切证实红霉素基因是否被切除，因为如果被彻底切除，则该细菌就不能在含有红霉素的LB培养基上生长。反之，则能生长。

为了确定质粒载体pMG425t中的ThyA基因的存在还要进行质粒载体pMG425t的修复功能的鉴定，即ThyA基因缺陷的大肠杆菌在普通的LB培养基上不能生长或生长不良，必须在加有外源的胸腺嘧啶核苷条件下才能恢复生长。含ThyA基因重组质粒的转入能使ThyA基因缺陷的大肠杆菌在基础培养基上恢复生长，将获得的含有重组载体pMG425t的菌株在未含有胸腺嘧啶核苷或β-半乳糖苷酶的LB培养基上继续传代，对阳性克隆子提取质粒，如图6。

本发明的非抗生素抗性穿梭载体可应用于制造功能性乳品和饲料添加剂以及动物疫苗。

将人或动物疾病的保护性抗原基因连接入本发明的非抗生素抗性质粒载体，再将载体电激转化入乳酸杆菌受体菌株中，用此转基因乳酸杆菌即可以制造功能性食品，如抗特定疾病的功能牛奶、酸奶、凝乳、发酵牛奶、牛奶基粉末、牛奶基发酵产品。

另外，将动物保护性抗原基因连接入本发明的非抗生素抗性质粒载体，再将载体电激转化入乳酸杆菌受体菌株中，用此转基因乳酸杆菌制造对特定疾病具有预防、保护作用的细菌悬液、干的口服补剂、湿的口服补剂、的管饲产品或湿的管饲产品、动物性疫苗和具有生长调节功能及营养功能的添加剂。。

本发明的非抗生素抗性穿梭载体的构建方法应用非抗生素可行基因ThyA/β-gal基因替代红霉素基因，在使用过程中不存在抗生素抗性基因扩散的问题，进而突出了环保意识和效应，这在理论和实践上均具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明所用的基本质粒载体pMG36e结构图和一部分限制性内切酶位点，图中Ori为复制起始基因，Er为红霉素抗性基因，P32为磷32启动子基因，MCS为多克隆位点，T为终止子基因，EcoR I 2476、Ec47 III 3319等为限制性内切酶名称及在载体中相对1/0位脱氧核糖核苷酸的位置。

图2为本发明所用的非抗生素抗性ThyA基因的PCR扩增产物电泳成像图，图中1为λDNA/EcoR I and Hind III标准DNA分子量，2、3、5为PCR扩增的ThyA基因，大小为1132bp，4为阴性对照结果。

图3为线型质粒载体pMG36e与ThyA基因反向连接后重组载体pMG36e+ThyA的酶切鉴定电泳成像图，图中M为λDNA/EcoRI+HindIII标准分子量，75为载体pMG425t用HincII酶切结果。

图4为线型质粒载体pMG36e与ThyA基因正向连接后重组载体pMG425t+ThyA的酶切鉴定电泳成像图，图中M为λDNA/EcoRI+HindIII标准分子量，36为载体pW425t用HincII酶切结果。

图5为用限制性内切酶HincII酶切鉴定重组质粒载体pw425et确定红霉素基因是否彻底被去除的酶切鉴定电泳成像图，图中1为λDNA/EcoRI+HindIII标准分子量，2、3为重组载体pMG425t用HincII酶切结果。

图6为本发明的以非抗生素抗性ThyA基因为选择压力的乳酸菌穿梭表达质粒载体物理结构示意，图中Ori为复制起始基因，ThyA为胸腺嘧啶核苷酸基因，P32为磷32启动子基因，MCS为多克隆位点，T为终止子基因，EcoR I 2021、Ec47 III 3424等为限制性内切酶名称及在载体中相对1/O位脱氧核糖核苷酸的位置。

具体实施方式

根据抗生素抗性基因两侧的限制性内切酶种类及位置，设计引物扩增非抗性筛选标记侯选基因，首先将基本质粒载体pMG36e用内切酶EcoR I在2476位进行酶切，使环型的质粒载体成为线型，用聚合酶T4 DNA对线型的pMG36e质粒载体和ThyA基因进行处理，在切口加A/T尾巴，再将ThyA基因连接到含抗生素抗性基因的线型载体中环化，最后用限制性内切酶Nsi I和EcoR I彻底去除抗生素抗性基因。

(1)对质粒载体pMG36e用内切酶EcoR I在2476位进行酶切使成为线型，再用T4 DNA聚合酶处理EcoR I酶切为线型的质粒载体，以利于下一步与外源片段进行连接。

(2)扩增非抗生素抗性筛选标记基因ThyA。以干酪乳酸杆菌的染色体DNA为模板，根据已发表的干酪乳酸杆菌ThyA基因的序列，设计了一对引物，在引物的5’端分别加有PstI和NsiI酶切位点。用高保真聚合酶Tag Plus I进行PCR扩增ThyA基因。

引物的设计：Primer1：5’TC  CTGCAG CAC AGC TTG ATG CGA TC 3’25个碱基

             PstIPrimer2：5’TT  ATGCAT GTG TCA TTG GTA AAC CTG 3’26个碱基

             NsiI反应体系：500微升灭菌PCR管内按下式加入各成分：

  10倍PCR缓冲液                   5.0微升

  10毫摩尔d NTP                   2.5微升

  100皮摩尔Primer1                0.5微升

  100皮摩尔Primer2                0.5微升

  L.casei DNA模板                 2.0微升

  D.D.W.                          38.5微升

  5 单位Taq PlusI DNA聚合酶       1.0微升

  总体积                          50.0微升

混匀、瞬时离心后，再加50微升(μL)灭菌液体石蜡覆盖，PCR仪上进行94℃变性8分钟，再进行下列反应，94℃变性1分钟，51℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，30个循环。72℃延伸10分钟。反应结束后用试剂盒进行纯化回收ThyA基因，如图2。

(3)将已经加A/T尾巴的载体pMG36e与非抗生素抗性基因ThyA基因进行连接，即非抗生素抗性基因ThyA基因6微升，2微升线型pMG36e，T4 DNA连接酶2微升，10倍T4 DNA连接酶缓冲液2微升，双蒸水8微升。首先14℃连接过夜，再4℃连接过夜，在这里线型质粒载体pMG36e与非抗生素抗性基因的连接的比例为1∶3。ThyA基因与载体质粒pMG36e的转化，在预冷的1.5毫升离心管内，加入200微升大肠杆菌感受态细胞DH5α、连接物20微升，轻轻混匀，冰浴40分钟，42℃水浴热激2分钟。加入预热至37℃的LB液体培养基800微升，37℃、200转每分钟振摇1小时，涂布于加有红霉素的LB培养基平板，37℃温箱培养过夜。随机挑取LB(加有红霉素，未加外源性胸腺嘧啶核苷)上几个克隆，扩大培养后提取质粒并鉴定。此时载体为具有双抗性—红霉素基因和ThyA基因的质粒载体pMG425et。

LB培养基包含蛋白胨(bacto-tryptone)10克，酵母提取物(bacto-yeast extract)5克，NaCl 10克。

(4)确定ThyA基因插入的正确性与方向性。将上述含有双抗性(红霉素抗性基因和胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因)为选择压力质粒载体pMG425et的菌株，进行质粒小抽提、电泳。根据电泳结果选择其中的阳性菌株进行大抽提质粒，用Nsi I酶进行酶切鉴定，以确定ThyA基因插入的正确性与方向性。如果ThyA基因是反向连接，用Nsi I酶切后应产生2584个碱基和2159个碱基两条片段。如果ThyA基因是正向连接，用Nsi I酶切后应产生3716个碱基和1027个碱基两条片段，如图3、4。

(5)去除重组载体中的红霉素基因。用限制性内切酶EcoR I和Nsi I酶切质粒载体pMG425et，以彻底去除红霉素抗性基因。再用内切酶Hinc II进行酶切鉴定。为了进一步鉴定重组质粒载体中的红霉素基因从分子量角度确定是否彻底被切除，将阳性细菌的提取质粒用内切酶Hinc II进行酶切鉴定，因为根据原始质粒载体的物理图谱及ThyA基因内部的酶切位点：在红霉素基因的内部有一个Hinc II酶切位点，在多克隆位点内也有一个Hinc II酶切位点，ThyA基因内部也有一个Hinc II酶切位点。所以如果红霉素基因被完全切除了，则重组载体被Hinc II酶切后，只能得到两条片段，2657个碱基的大片段和1059个碱基的小片段，如图5。反之，如果红霉素基因没被完全切除，用Hinc II酶切后，出现了三条片段，其中一条大片段为2494个碱基，另两条小片段分别为1059个碱基和1190个碱基。

(6)红霉素抗性筛选鉴定。将阳性细菌大量提取质粒，用限制性内切酶Nsi I重新酶切，回收大片段，重新连接环化、转化、筛选真正的阳性菌落，并鉴定。在含有红霉素的LB培养基上鉴定重组载体：挑选阳性的菌落，小抽提质粒和电泳，筛选其中分子量较小的质粒(即红霉素基因切除的质粒)在含有红霉素的LB培养基上培养，以确切证实红霉素基因是否被切除，因为如果被彻底切除，则该细菌就不能在含有红霉素的LB培养基上生长。反之，则能生长。

(7)pMG425t质粒载体的修复功能稳定性的鉴定。ThyA基因缺陷的大肠杆菌在普通的LB培养基上不能生长或生长不良，必须在加有外源的胸腺嘧啶核苷条件下才能恢复生长。含ThyA基因重组质粒的转入能使ThyA基因缺陷的大肠杆菌在基础培养基上恢复生长，将获得的含有重组载体pMG425t的菌株在未含有胸腺嘧啶核苷的LB培养基上继续传代，对阳性克隆子提取质粒，测其修复的稳定性。图6为以ThyA非抗生素抗性基因为选择压力的乳酸菌穿梭质粒载体物理结构示意图。

Claims (11)

1.一种非抗生素抗性穿梭质粒表达载体，其特征是先在基本质粒载体pMG36e的酶切位点上进行酶切，再在近红霉素Er端连接非抗生素抗性基因，最后除去红霉素抗性基因Er，用pMG425t表示，表达式为：

  pMG36e+ThyA/(β-Gal)-Er＝pMG425t式中，pMG36e为基本质粒载体，它含有红霉素抗性基因，可在大肠杆菌和乳酸杆菌中表达，ThyA/(β-Gal)为非抗生素抗性基因，Er表示红霉素抗性基因，+号表示连接，-号表示去除，＝号表示形成，pMG425t表示本发明的非抗生素抗性穿梭表达质粒载体。

2.根据权利要求1所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体，其特征是表达式为：

  pMG36e+ThyA-Er＝pMG425t式中ThyA是胸苷酸合成酶基因。

3.根据权利要求1所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体，其特征是表达式为：

  pMG36e+(β-Gal)-Er＝pMG425t式中(β-Gal)是β-半乳糖苷酶基因。

4.根据权利要求1所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体的构建方法，其特征是把基本质粒载体pMG36e，经限制性内切酶EcoR I在其酶切位点上酶切，成为线型；在近红霉素Er端连接非抗生素抗性基因，之后环化回环状；再在这个环上把红霉素基因Er用内切酶去除，形成非抗生素抗性穿梭表达质粒载体pMG425t。

5.根据权利要求4所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体的构建方法，其特征是根据抗生素抗性基因两侧的限制性内切酶种类及位置，设计引物扩增非抗性筛选标记侯选基因。

6.根据权利要求5所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体的构建方法，其特征是：

1)用内切酶EcoR I对质粒载体pMG36e进行酶切，使环状的DNA成为线型，再用聚合酶T4 DNA处理被EcoR I酶切为线型的质粒载体，以备下一步与非抗生素抗性基因进行连接；

2)扩增非抗生素抗性基因胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因(ThyA)或β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因，以干酪乳酸杆菌或保加利亚乳杆菌的染色体DNA为模板，根据已发表的干酪乳酸杆菌ThyA基因或保加利亚乳杆菌的β-Gal基因序列，设计引物，用高保真聚合酶Tag PlusI进行聚合酶链式反应PCR扩增ThyA或β-Gal基因；

3)将1)中已切为线型的基本质粒载体pMG36e和2)中得到的非抗生素抗性基因ThyA或(β-gal)进行连接、转化，此时载体为具有双抗性，即红霉素基因和ThyA或(β-gal)基因的质粒载体pMG425et；

4)用内切酶EcoR I和Nsi I对具有双抗性包括红霉素基因和ThyA基因或β-Gal基因的质粒载体pMG425et进行酶切，彻底去除红霉素抗性基因。

7.根据权利要求6所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体的构建方法，其特征是ThyA基因或(β-gal)基因与质粒载体pMG36e的连接过程中，所用的线型质粒载体pMG36e与非抗生素抗性基因ThyA或(β-gal)的连接的比例在1∶1～1∶10之间。

8.根据权利要求6所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体的构建方法，其特征是：

1)将阳性细菌的提取质粒用内切酶Hinc II进行酶切鉴定，从分子量角度确定pMG425et中的红霉素基因是否彻底被切除；

2)在含有红霉素的LB培养基上对重组载体进行功能鉴定，以确切证实红霉素基因是否被切除；

3)确定质粒载体pMG425t中的ThyA基因或β-Gal基因的修复功能，含ThyA基因或β-Gal基因重组质粒的转入能使ThyA基因或β-Gal基因缺陷的大肠杆菌在基础LB培养基恢复生长。

9.根据权利要求1所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体的用途，其特征是在质粒载体内连接外源保护性抗原基因后应用于制造功能性乳品和饲料添加剂以及动物疫苗。

10.根据权利要求9所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体的用途，其特征是将人或动物疾病的保护性抗原基因连入质粒载体，再将载体电激转化入乳酸杆菌受体菌株中，制造抗特定疾病的功能牛奶、酸奶、凝乳、发酵牛奶、牛奶基粉末、牛奶基发酵产品。

11.根据权利要求9所述的非抗生素抗性穿梭质粒表达载体的用途，其特征是将动物保护性抗原基因连入质粒载体，再将载体电激转化入乳酸杆菌受体菌株中，制造对特定疾病具有预防、保护作用的细菌悬液、干的口服补剂、湿的口服补剂、干的管饲产品或湿的管饲产品、动物性疫苗和具有生长调节功能及营养功能的添加剂。

Images