CN1900289B - 一种纳豆激酶的表达方法及其专用表达载体和工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳豆激酶的表达方法及其专用表达载体和工程菌。该载体是含有组成型表达启动子、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌组成型表达载体，或是含有诱导型表达启动子、跨膜信号肽编码序列、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌诱导型分泌表达载体。实验证明，本发明工程菌的表达产物具有较高的纤溶活性，活性最高可达每毫升发酵上清液41.7尿激酶单位，食用安全，对人体无毒副作用，稳定性好，适用于各种食品，便于直接口服，生产成本低的优点，为将纳豆激酶开发生产为口服溶栓功能性保健食品奠定了基础，工业应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及纳豆激酶的表达方法及其专用表达载体和工程菌。
背景技术
纳豆激酶(Nattokinase，NK，GenBank号：AA065246)是一种来源于传统发酵食品-纳豆的丝氨酸蛋白酶。研究表明，纳豆激酶具有较强的纤溶活性，是一种潜在的溶栓药物，它不仅具有良好的溶栓效果，而且可经口服达到纤溶目的，同时也可促进内源组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)增加。纳豆激酶作为溶栓药物具有药效时间长，无抗原性，能使生物体自身纤溶酶系统活化的优点，可温和、持续地提高血液的纤溶活性，对心脑血管栓塞类疾病达到方便、安全、有效的预防和治疗，其特性优于当前临床应用的溶栓药物，如链激酶、尿激酶等。目前，纳豆激酶主要来源于野生枯草芽孢杆菌发酵的纳豆、豆豉等，但是纳豆、豆豉的风味还不能被许多人所习惯和接受，从发酵液中分离纯化纳豆激酶通常产量较低、生产成本高，这些因素都在一定程度上限制了纳豆激酶的开发和应用。
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类在食品工业中应用最广泛的革兰氏阳性菌，包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。很早以前，该菌即被用于制作泡菜、酱油、奶酪和酸奶等，被公认为是安全的(GRAS)食品级微生物。乳酸菌的主要作用包括改善食品风味、防止食品腐败、增加养分、平衡消化道菌群、降低胆固醇、控制内毒素等。近年来，LAB的遗传学及分子生物学研究取得了显著进展，使其作为一种新的表达系统表达外源基因成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳豆激酶的专用表达载体。
本发明所提供的用于表达纳豆激酶的载体，是含有组成型表达启动子、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌组成型表达载体，或是含有诱导型表达启动子、跨膜信号肽编码序列、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌诱导型分泌表达载体；在所述乳酸菌组成型表达载体中，组成型表达启动子位于纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的上游；在所述乳酸菌诱导型分泌表达载体中，跨膜信号肽编码序列与纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列形成融合基因，跨膜信号肽编码序列位于纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的5’端，诱导型表达启动子位于所述融合基因的上游。
所述乳酸菌组成型表达载体中组成型表达启动子的选择是多种多样的，如乳酸菌启动子P32(GenBank号：M24764)、P23(GenBank号：M24763)、P59(GenBank号：24806)或Pnuc(GenBank号：V01281)等。
所述乳酸菌诱导型分泌表达载体中的诱导型表达启动子的选择也是多种多样的，如乳链菌肽基因启动子PnisZ(GenBank号：L16226)、PlacA(GenBank号：M32103)或Pgad(GenBank号：AF005098)等；所述跨膜信号肽可为乳酸菌信号肽Usp45(GenBank号：M60178)或信号肽Nuc(GenBank号：V01281)等。
用于构建纳豆激酶基因的乳酸菌组成型和诱导型分泌表达载体的出发载体选择范围是非常广泛的，比如可为pMG36e、pMG36c、pIL253、pVE5523、pOri23、pOri59、pZTE32、pNZ9700、pNZ9800或pNZ9000等。
以pMG36e为出发载体，构建的含有所述乳酸菌启动子P32，纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌组成型表达载体为pXB520；以pMG36e为出发载体，构建的含有所述乳链菌肽基因启动子PnisZ、信号肽Usp45、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌诱导型分泌表达载体为pXB622。
上述表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建。
本发明的第二个目的是提供一种纳豆激酶的专用表达工程菌。
本发明所提供的用于表达纳豆激酶的工程菌，是将上述纳豆激酶的专用表达载体导入乳酸菌中得到的。
所述乳酸菌可为任何一种适于表达外源基因的乳酸菌，如L.lactis MG1363、L.lactis LM0230、L.lactis NZ9000、L.lactis NZ9700或L.lactis NZ9800等乳酸乳球菌，Lb.casei、Lb.acidophilus、Lb.bulgaricus或Lb.plantarum等乳酸乳杆菌。
以乳酸乳球菌MG1363为出发菌株，构建的转化有pXB520的重组乳酸菌菌株为L.lactis MG1363/pXB520。
以乳酸乳球菌NZ9000为出发菌株，构建的转化有pXB622的重组乳酸菌菌株为L.lactis NZ9000/pXB622。
可采用生物工程领域中常用的方法，例如电穿孔转化法、原生质体转化法等将所构建的重组表达载体导入乳酸菌中。
本发明的另一个目的是提供一种纳豆激酶的表达方法。
本发明所提供的纳豆激酶的表达方法，是发酵上述纳豆激酶的专用表达工程菌，得到纳豆激酶。
发酵携带有诱导型分泌表达载体的重组乳酸菌表达纳豆激酶时需加入乳链菌肽nisin，所加入nisin的浓度为10-100ng/mL，优选为50ng/mL，诱导温度为15-30℃，优选为30℃，诱导时间为6-10小时，优选为8小时。
本发明提供了一种纳豆激酶的表达方法及其专用表达载体和工程菌。所构建的纳豆激酶的专用表达载体是含有组成型表达启动子、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌组成型表达载体，或是含有诱导型表达启动子、跨膜信号肽编码序列、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌诱导型分泌表达载体。将所构建的纳豆激酶专用表达载体导入乳酸菌，即可得到纳豆激酶的专用表达工程菌，培养工程菌可使纳豆激酶基因得到表达。实验证明，本发明工程菌的表达产物具有较高的纤溶活性，每毫升发酵液活性最高可达41.7尿激酶单位，食用安全，对人体无毒副作用，稳定性好，适用于各种食品，便于直接口服，生产成本低的优点，为将纳豆激酶开发生产为口服溶栓功能性保健食品奠定了基础，工业应用前景广阔。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1为纳豆激酶组成型表达载体pXB520构建过程的示意图
图2为纳豆激酶诱导型分泌表达载体pXB622构建过程的示意图
图3为pXB520和pXB622的酶切鉴定结果
图4为纳豆激酶在乳酸菌中组成型表达产物的Western-blot检测结果
图5为纳豆激酶在乳酸菌中诱导型表达产物的Western-blot检测结果
图6为分泌表达的纳豆激酶的活性检测结果
图7为检测温度、诱导时间和Nisin浓度对纳豆激酶在乳酸菌中诱导分泌表达影响的结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成及测序工作均由上海生工完成。
实施例1、纳豆激酶专用表达载体的构建
一、纳豆激酶组成型表达载体的构建
参见图1构建纳豆激酶的组成型表达载体，具体过程包括以下步骤：
1、构建含乳酸菌启动子P32的中间载体pXB100
根据乳酸菌启动子P32的序列(GenBank号：M24764)设计引物，并在引物序列的两端分别添加上限制性内切酶EcoR I和Sac I的识别位点，在下游引物中引入连续的3个终止密码子和一个乳酸菌核糖体结合位点以形成转录融合，引物序列如下：引物1(上游引物)：5′-atcgaattcggtcctcgggatatg-3′(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)
引物2(下游引物)：5′-acgagctcgtatttgg
tcgaattacgaatttttc-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I识别位点，带双下划线碱基为连续的3个终止密码子，斜体碱基为乳酸菌核糖体结合位点。)
以乳酸菌质粒pMG36e为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环。反应结束后，对PCR扩增产物用限制性内切酶EcoR I和Sac I进行双酶切，再将230bp的酶切产物纯化后与用相同酶双酶切并经纯化的载体pUC18(TaKaRa公司)用T4 DNA连接酶在16℃下反应16小时进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100mg/L红霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，用限制性内切酶EcoR I和Sac I进行酶切鉴定，经酶切获得230bp和2700bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为引物1和引物2，对PCR产物进行测序，测序结果表明乳酸菌启动子P32片段已插入pUC18中，且序列正确，将此含乳酸菌启动子P32的重组载体，命名为pXB100。
2、构建含纳豆激酶前导肽和成熟肽编码序列的中间载体pXB120
根据纳豆激酶前导肽和成熟肽的编码序列(GenBank号：AY219901)设计引物，并在引物序列的两端分别添加上限制性内切酶BamH I和Pst I的识别位点，引物序列如下：
引物3(上游引物)：5′-cgcggatccttaaaaagagggaataaaatggccggaaaaagcag-3′(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)
引物4(下游引物)：5′-ttctgcagttattgtgcagctgcttg-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Pst I识别位点)
以含有纳豆激酶全基因的载体pXBL2(将纳豆激酶全基因克隆入载体pUC18多克隆位点的EcoR I和Sal I酶切位点得到的重组载体)为模板，在引物3和引物4的引导下进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环。反应结束后，对PCR扩增产物用限制性内切酶BamH I和Pst I进行双酶切，再将1060bp的酶切产物纯化后与用相同酶双酶切并经纯化的载体pXB100用T4 DNA连接酶在16℃下反应20小时进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，用限制性内切酶BamH I和Pst I进行酶切鉴定，经酶切获得1080bp和2900bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为引物3和引物4，对PCR产物进行测序，测序结果表明纳豆激酶前导肽和成熟肽的编码序列已插入pXB100中，且序列正确，将此含乳酸菌启动子P32及纳豆激酶前导肽和成熟肽的编码序列的重组载体，命名为pXB120。
3、纳豆激酶的组成型表达载体的获得
用限制性内切酶EcoR I和Pst I对载体pXB120进行双酶切，回收并纯化1330bp的小片段，将该片段与用相同酶双酶切并经纯化的载体pMG36e用T4 DNA连接酶在16℃反应20小时进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100mg/L红霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，先对质粒用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定，再对质粒用限制性内切酶Kpn I+SacI进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图3所示(泳道1为1kb DNA分子量标准，泳道4为pXB520的EcoR I酶切产物，泳道5为pXB520的Kpn I+Sac I的双酶切产物)，经EcoR I酶切获得了4700bp的片段，经Kpn I+Sac I双酶切获得1200bp和3500bp的片段，与预期结果相符，得到了纳豆激酶的组成型表达载体，命名为pXB520。
二、纳豆激酶诱导型分泌表达载体的构建
参见图2构建纳豆激酶的诱导型分泌表达载体，具体过程包括以下步骤：
1、构建含纳豆激酶前导肽和成熟肽编码序列的中间载体pXB020
根据纳豆激酶前导肽和成熟肽的编码序列设计引物，并在引物序列的两端分别添加上限制性内切酶EcoR I和Sal I的识别位点，引物序列如下：
引物5(上游引物)：5′-gacgaattcatggccggaaaaagcagt-3′(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)
引物6(下游引物)：5′-aggcgtcgacttattgtgcagctgcttg-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Sal I识别位点)
以含有纳豆激酶全基因的载体pXBL2(将纳豆激酶全基因克隆入载体pUC18多克隆位点的EcoR I和Sal I酶切位点得到的重组载体)为模板，在引物5和引物6的引导下进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环。反应结束后，对PCR扩增产物用限制性内切酶EcoR I和Sal I进行双酶切，再将1060bp的酶切产物纯化后与用相同酶双酶切并经纯化的载体pBluescript SK+(Stratagene)用T4 DNA连接酶在16℃下反应20小时进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，用限制性内切酶EcoR I和Sal I进行酶切鉴定，经酶切获得1060bp和2900bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为引物5和引物6，对PCR产物进行测序，测序结果表明纳豆激酶前导肽和成熟肽的编码序列已插入pXB100中，且序列正确，将此含纳豆激酶前导肽和成熟肽的编码序列的重组载体，命名为pXB020.
2、构建含乳酸菌信号肽Usp45编码序列的中间载体pXB022
根据乳酸菌信号肽Usp45的编码序列(GenBank号：M60178)设计引物，并在引物序列的两端分别添加上限制性内切酶Sac I和EcoR I的识别位点，引物序列如下：引物7(上游引物)：5′-cgagctcgtatgaaaaaaaagattatctcagc-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I识别位点)
引物8(下游引物)：5′-ctagaattcagcgtaaacagctggc-3′(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)
以乳酸乳球菌MG1363的基因组DNA为模板，在引物7和引物8的引导下进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 20sec，共30个循环。反应结束后，对PCR扩增产物用限制性内切酶Sac I和EcoR I进行双酶切，再将100bp的酶切产物纯化后与用相同酶双酶切并经纯化的载体pXB020用T4 DNA连接酶在16℃下反应16小时进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，用限制性内切酶Sac I和EcoR I进行酶切鉴定，经酶切获得100bp和4000bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为引物7和引物8，对PCR产物进行测序，测序结果表明乳酸菌信号肽Usp45的编码序列已插入pXB020中，且序列正确，将此含乳酸菌信号肽Usp45编码序列，纳豆激酶前导肽和成熟肽编码序列的重组载体，命名为pXB022。
3、构建含乳链菌肽基因启动子PnisZ的中间载体pXB600
根据乳链菌肽基因启动子PnisZ的序列(GenBank号：L16226)设计引物，并在引物序列的两端分别添加上限制性内切酶EcoR I和Sac I的识别位点，引物序列如下：引物9(上游引物)：5′-cggaattcgatataggtttattgag-3′(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)
引物10(下游引物)：5′-tcagagctctttgagtgcctccttataa-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I识别位点)
以乳酸菌质粒pHJ201(陈秀珠，胡海菁，杨巍，还连栋，乳链菌肽前体基因(nisZ)在乳酸乳球菌中的克隆和表达，遗传学报，2001，28(3)：285-290)为模板，在引物9和引物10的引导下进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环。反应结束后，对PCR扩增产物用限制性内切酶EcoR I和Sac I进行双酶切，再将240bp的酶切产物纯化后与用相同酶双酶切并经纯化的载体pMG36e用T4 DNA连接酶在16℃下反应16小时进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100mg/L红霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，用限制性内切酶EcoR I和Sac I进行酶切鉴定，经酶切获得240bp和3400bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为引物9和引物10，对PCR产物进行测序，测序结果表明乳链菌肽基因启动子PnisZ片段已插入pMG36e中，且序列正确，将此含乳链菌肽基因启动子PnisZ的重组载体，命名为pXB600。
4、纳豆激酶诱导型分泌表达载体的获得
用限制性内切酶Sac I和Kpn I对载体pXB022进行双酶切，回收并纯化1200bp的小片段，将该片段与用相同酶双酶切并经纯化的载体pXB600用T4 DNA连接酶在16℃反应20小时进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100mg/L红霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，先对质粒用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定，再对质粒用限制性内切酶Kpn I+SacI进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图3所示(泳道1为1kb DNA分子量标准，泳道2为pXB622的EcoR I酶切产物，泳道3为pXB622的Kpn I+Sac I的双酶切产物)，经EcoR I酶切获得了330bp和4340bp的片段，经Kpn I+Sac I双酶切获得1200bp和3500bp的片段，与预期结果相符，得到了纳豆激酶的诱导型分泌表达载体，命名为pXB622。
实施例2、纳豆激酶在乳酸菌中的表达及表达产物的鉴定
一、纳豆激酶在乳酸菌中的表达
1、纳豆激酶在乳酸菌中的组成型表达
将实施例1构建的纳豆激酶的乳酸菌组成型表达载体pXB520转化乳酸乳球菌L.lactis MG1363，用含5μg/mL红霉素的GM17抗性平板(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，维生素C 0.05％，β-甘油磷酸钠1.9％，硫酸镁1mmol/L)筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，先对质粒用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定，再对质粒用限制性内切酶Kpn I+Sac I进行双酶切鉴定，经Kpn I+Sac I双酶切获得1200bp和3500bp的片段，与预期结果相符，得到了纳豆激酶组成型表达工程菌，命名为L.lactisMG1363/pXB520。将该工程菌接种于含有5μg/mL红霉素的GM17液体培养基的试管中，在30℃下静置培养12小时，再按1％接种量接种于GM17液体培养基中，30℃静置培养4-10小时。
2、纳豆激酶在乳酸菌中的诱导型表达
将实施例1构建的纳豆激酶的乳酸菌诱导型表达载体pXB622转化乳酸乳球菌NZ9000，用含5μg/mL红霉素的GM17抗性平板筛选阳性转化子，抽提阳性转化子中的重组质粒，先对质粒用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定，再对质粒用限制性内切酶Kpn I+Sac I进行双酶切鉴定，经Kpn I+Sac I双酶切获得1200bp和3500bp的片段，与预期结果相符，得到了纳豆激酶诱导型表达工程菌，命名为L.lactisNZ9000/pXB622。将该工程菌接种于含有5μg/mL红霉素的GM17液体培养基的试管中，在30℃下静置培养12小时，再按1％接种量接种于GM17液体培养基中，30℃静置培养3-6小时至OD600nm值为0.4-0.5，最高不超过0.6，然后加入终浓度为10-100ng/mL的乳酸链球菌素(Nisin)进行诱导，在30℃下静置培养4-10小时。
二、表达产物的Western-blot鉴定
对步骤一的组成型和诱导型表达产物12000rpm离心1min，分别收集上清液和沉淀，将沉淀用GM17液体培养基洗涤一次后重悬于1/20(V/V)GM17液体培养基中，超声波破碎菌体细胞，离心，分别收集上清液和沉淀，对上清和沉淀进行Western-blot鉴定，具体方法如下：
1)SDS-PAGE
采用Tris-甘氨酸电泳系统对收集的上清液和沉淀进行SDS-PAGE(分离胶浓度为12％)，方法为：取待测样品液10μL，加入样品缓冲液10μL(含100mmol/L Tris-HCl，pH6.8，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)，水浴煮沸5min，20μL全部上样，用25mA稳流电泳，约2h后停止电泳。
2)免疫杂交
SDS-PAGE电泳结束后，不对胶染色，进行Western-blot分析，具体方法为：将胶用蒸馏水冲洗并在电转移液(10mM碳酸氢钠，4mM碳酸钠，pH9.5，10％甲醇)中浸润，用电转移的方法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，转移在冰浴中进行，电流200mA，电转移时间约2.5h；转有蛋白的硝酸纤维素膜在溶液III(3-5％BSA，用溶液I(20mMTris-HCl，pH7.4，0.15M NaCl，1mM EDTA，0.1％Tween-20，0.04％NaN3)配制)中4℃封闭8-12h，然后与一抗溶液(用从B.Subtilis YF38(CGMCC No.1308)中纯化的纳豆激酶为抗体制备)37℃保温1h，用溶液I洗膜三次，每次10min；与二抗(羊抗兔IgG，华美生物工程公司)溶液37℃保温1h；用溶液I洗膜三次，每次10min；用水冲洗一次，溶液II冲洗一次；最后加入10mL溶液II和底物(50mg/mL NBT 66ul，50mg/mL BCIP 33uL)，37℃避光显色5-10min。纳豆激酶在乳酸菌中组成型表达产物的Western-blot检测结果如图4所示(泳道1为蛋白分子量标准(94kDa、62kDa、40kDa、30kDa、12kDa)，泳道2为B.subtilis YF38的发酵上清液(阳性对照)，泳道3为转化有空载体pMG36e的乳酸乳球菌L.lactis MG1363经发酵的菌体(阴性对照)，泳道4-7分别为组成型表达工程菌L.lactis MG1363/pXB520发酵8小时及10小时的菌体(泳道4、6)与上清液(泳道5、7)，在28kDa和36kDa大小处均出现两条特异的杂交条带(箭头所指)，分别与纳豆激酶成熟肽以及未加工的原肽的大小相符，表明重组菌经发酵后，菌体中产生能够与纳豆激酶的抗体特异性相互作用的蛋白，但有一部分表达产物还没有切除前导肽。纳豆激酶在乳酸菌中诱导型表达产物的Western-blot检测结果如图5所示(泳道1为经Nisin诱导发酵的工程菌L.lactisNZ9000/pXB622的菌体，泳道2为经Nisin诱导的工程菌L.lactisNZ9000/pXB622的发酵上清液，泳道3为未经诱导的诱导型表达工程菌L.lactis NZ9000/pXB622的发酵上清液(阴性对照)，泳道4为转化有空载体pMG36e的乳酸乳球菌NZ9000的发酵上清液(阴性对照)，泳道5为B.subtilis YF38的发酵上清液(阳性对照)，泳道6为蛋白分子量标准(94kDa、62kDa、40kDa、30kDa、20kDa、12kDa)，在Nisin的诱导下，纳豆激酶在所构建的诱导型表达工程菌L.lactis NZ9000/pXB622中成功表达并可有效地分泌到胞外。
实施例3、诱导表达的纳豆激酶的纤溶活性检测
检测实施例2诱导表达的纳豆激酶的纤溶活性，具体方法如下：
首先制作纤维蛋白检测平板：取10mL巴比妥钠缓冲液(含0.05M巴比妥钠，0.09MNaCl，0.0017M CaCl2，0.0007M MgCl2)熔化琼脂糖(0.6％)，再取10mL相同缓冲液溶解人血纤维蛋白原(购自中国药品鉴定检验所)(20mg/mL)，于45℃保温45min和10min后，加入10μL凝血酶(购自中国药品检验鉴定所)溶液(0.1BP/μL)混匀，与上述20mg/mL人血纤维蛋白原溶液混合后倒入水平无菌培养皿，室温放置1h后，用打孔器打孔。取30μL样品注入小孔，37℃温育16-18h，结果如图6所示(1为经Nisin诱导发酵的工程菌L.lactisNZ9000/pXB622的菌体，2为经Nisin诱导的工程菌L.lactis NZ9000/pXB622的发酵上清液，3为未经诱导的诱导型表达工程菌L.lactis NZ9000/pXB622的发酵上清液(阴性对照)，4为转化有空载体pMG36e的乳酸乳球菌NZ9000的发酵上清液(阴性对照)，5为B.subtilis YF38的发酵上清液(阳性对照))，用游标卡尺测定透明圈的直径，同时以尿激酶为标准品制作纤溶活性标准曲线，通过比较计算得到发酵液的纤溶活性单位.结果发酵上清液的纤溶活性最高可达41.7尿激酶单位/mL，分泌效率达94％，而转化有空载体pMG36e的乳酸乳球菌NZ9000的发酵上清液及未经诱导的工程菌L.lactis NZ9000/pXB622的上清液均没有检测到纤溶活性，进一步证明工程菌L.lactis NZ9000/pXB622中的纳豆激酶基因受Nisin诱导表达，且表达产物能够有效分泌到胞外。
实施例4、检测不同诱导温度、诱导时间及Nisin浓度对纳豆激酶诱导表达的影响
1、检测温度对纳豆激酶诱导表达的影响
在Nisin诱导浓度为50ng/mL，诱导时间为8小时情况下，分别在20℃，30℃和37℃对工程菌L.lactis NZ9000/pXB622进行培养，测定菌液的菌体浓度和纤溶活性。结果见图7A，30℃培养时菌体的生长情况最好，纳豆激酶的表达活性也最高。
2、检测诱导时间对纳豆激酶表达的影响
在Nisin诱导浓度为50ng/mL，诱导温度为30℃情况下，分别在发酵2小时，4小时，6小时，8小时，10小时和12小时时取样，测定菌液的菌体浓度和纤溶活性。结果见图7C，发酵6小时时菌液浓度达到最大，而到8小时纤溶活性才达到最大值。
3、检测Nisin浓度对纳豆激酶表达的影响
在诱导温度为30℃，诱导时间为8小时情况下，分别用10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL的Nisin进行诱导，测定菌液的菌体浓度和纤溶活性。结果见图7B，随着Nisin浓度的升高，乳酸菌的生长受到抑制，而在10-50ng/mL范围内，纤溶活性随Nisin浓度的升高而升高，而当Nisin浓度超过50ng/mL时，纤溶活性随Nisin浓度的升高反而降低。
上述试验结果表明，纳豆激酶在乳酸菌中诱导分泌表达的温度优选为30℃，诱导时间优选为8小时，诱导物Nisin的浓度优选为50ng/mL。
Claims (10)
1.用于表达纳豆激酶的载体，是含有组成型表达启动子、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌组成型表达载体，或是含有诱导型表达启动子、跨膜信号肽编码序列、纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的乳酸菌诱导型分泌表达载体；用于构建所述纳豆激酶乳酸菌组成型或诱导型分泌表达载体的出发载体为pMG36e、pMG36c、pIL253、pVE5523、pOri23、pOri59、pZTE32、pNZ9700、pNZ9800或pNZ9000；在所述乳酸菌组成型表达载体中，组成型表达启动子为乳酸菌启动子P32、P23、P59或Pnuc，组成型表达启动子位于纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的上游；在所述乳酸菌诱导型分泌表达载体中，诱导型表达启动子为乳链菌肽基因启动子PnisZ、PlacA或Pgad，跨膜信号肽编码序列与纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列形成融合基因，跨膜信号肽编码序列位于纳豆激酶前导肽及其成熟肽编码序列的5’端，诱导型表达启动子位子所述融合基因的上游。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述乳酸菌诱导型表达载体中的跨膜信号肽为乳酸菌信号肽Usp45或信号肽Nuc。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：以pMG36e为出发载体，构建的纳豆激酶乳酸菌组成型表达载体为如图1所示的pXB520。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：以pMG36e为出发载体，构建的纳豆激酶乳酸菌诱导型分泌表达载体为如图2所示的pXB622。
5.表达纳豆激酶的工程菌，是将权利要求1或2或3或4所述的载体导入乳酸乳球菌中得到的重组菌。
6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌L.lactisMG1363、L.lactisLM0230、L.lactisNZ9000、L.lactisNZ9700或L.lactisNZ9800。
7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述重组乳酸菌为L.lactisMG1363/pXB520或L.lactis NZ9000/pXB622。
8.一种纳豆激酶的表达方法，是发酵权利要求5所述的工程菌，得到纳豆激酶。
9.根据权利要求8所述的表达方法，其特征在于：所述发酵携带有诱导型分泌表达载体的重组乳酸菌表达纳豆激酶时需加入乳链菌肽Nisin，所加入Nisin的浓度为10-100ng/mL，诱导温度为15-30℃，诱导时间为6-10小时。
10.根据权利要求9所述的表达方法，其特征在于：所述乳链菌肽Nisin的浓度为50ng/mL，诱导温度为30℃，诱导时间为8小时。
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