CN115807023A - 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合 - Google Patents
一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程和食品领域，具体涉及提高α‑乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合和其应用。本发明将一系列分子伴侣或优化后的分子伴侣组合在α‑乳白蛋白乳酸克鲁维表达菌株中共表达。筛选出的一些分子伴侣和优化后的组合可以显著提高α‑乳白蛋白表达量。以分子伴侣组合KAR2‑SLY1为例，导入乳酸克鲁维表达菌株后，α‑乳白蛋白的表达量提高了2.2倍，摇瓶产量达到76 mg/L，在5 L发酵罐中的产量达到600 mg/L以上。
Description
技术领域
本发明属于生物工程和食品领域，具体涉及提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合和其应用。
背景技术
我国乳清蛋白依赖进口并且年进口量逐年攀升，亟需推动我国乳清蛋白类蛋白产品的生产研发。α-乳白蛋白(alpha-lactalbumin)是乳清蛋白中含量最高的蛋白质组分，也是牛乳清中第二大丰富的蛋白质。α-乳白蛋白具备多种重要的生理功能，首先，作为小分子蛋白质，更易肠道吸收利用，有助于提高蛋白质的生物利用度，降低蛋白质总量，从而有效减轻肾脏负担；其次，α-乳白蛋白含有丰富的色氨酸，色氨酸被认为是调节婴儿睡眠、情绪和食欲的重要氨基酸，有助于婴儿睡眠，促进大脑发育；另外，α-乳白蛋白的水解肽段能够增强自身抵抗力，抗炎抗氧化，减少过敏反应发生；α-乳白蛋白也是人体必需氨基酸的最佳来源，能促进神经发育，调节肠道的菌群平衡。基于其突出的生理和营养功能，α-乳白蛋白成为国内外婴幼儿配方奶粉的重要原料，伊利乳业将α-乳白蛋白配方作为其婴幼儿配方奶的专利组分。目前国内市场中乳白蛋白均为乳提取产品，实现α-乳白蛋白的自主研发和微生物制造具有重要的战略意义。
α-乳白蛋白的专利较少，相关专利表明目前已实现在大肠杆菌、酵母、藻类等体系中生产，例如US9732351B2、WOUS90007438。但现有技术中涉及的微生物生产α-乳白蛋白的产量均较低，与乳提取产品的成本相比没有优势。中国专利CN114292324A(一种共表达分子伴侣蛋白生产α-乳白蛋白的菌株及其应用)公布了一种在毕赤酵母中共表达分子伴侣以提高α-乳白蛋白产量的方法。但存在的主要问题是：首先，产量不高，摇瓶发酵产量6.0mg/mL；其次，毕赤酵母的发酵培养需要添加有毒性的诱导物甲醇，是食品安全需要严格禁止的有毒有害物质，因此毕赤酵母不是我国获批的任何一种类型的食品安全菌株；另外，生产场所需要添加防爆设备，以保证发酵过程的安全，对发酵工艺要求高。
多数情况下，蛋白质折叠、内质网氧化应激反应、以及蛋白在内质网和高尔基体中转运过程常常成为外源蛋白分泌生产的瓶颈，这些过程涉及到数十种关键酶蛋白的独立或协同作用。基于转录组学分析等(https://doi.org/10.1002/biot.20160 0584)方法，已经鉴定出一系列对外源蛋白分泌有促进作用的分子伴侣和运输蛋白。
发明内容
本发明探索了一系列分子伴侣对乳酸克鲁维分泌表达α-乳白蛋白的影响。通过研究，本发明以分泌表达α-乳白蛋白的乳酸克鲁维酵母为出发菌株，通过过表达分子伴侣或其组合，促进α-乳白蛋白在乳酸克鲁维表达系统中的正确折叠和高效分泌，增强α-乳白蛋白的分泌表达。
本发明提供内质网分子伴侣蛋白KAR2、ERV2或SLY1。在增强酵母菌株表达α-乳白蛋白的能力中的应用，其中内质网分子伴侣蛋白KAR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、ERV2的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、SLY1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白，优选地所述内质网分子伴侣蛋白KAR2与α-乳白蛋白共表达；优选地，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。分子伴侣蛋白KAR2、ERV2或SLY1所述来源Kluyveromyces lactis，更具体来源于Kluyveromyces lactisvar.drosophilarum CBS 2105基因组。
本发明还提供一种内质网分子伴侣蛋白的组合在增强酵母菌株表达α-乳白蛋白的能力中的应用，其中所述内质网分子伴侣蛋白的组合是下述分子伴侣之间的组合：
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的钙联接蛋白CNE1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的内质网氧化还原酶ERO1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的FAD-结合巯基氧化酶ERV2；
氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2；
氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的转录因子HAC1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的KAR2；
氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的二硫键异构酶PDI；
氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的与高尔基体和细胞膜之间的囊泡运输相互作用的转运蛋白SEC1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的调节内质网和高尔基体之间的转运蛋白SLY1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的调节内质网的氧化应激的过氧化物歧化酶SOD1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的糖基转移酶STT3；
或者来源Kluyveromyces lactis且与上述各序列号所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白。
优选地，所述组合为两个分子伴侣蛋白的组合。
优选地，所述内质网分子伴侣蛋白的组合是分子伴侣KAR2、ERV2或SLY1之间的两两组合；
优选地，内质网分子伴侣蛋白的组合与α-乳白蛋白共表达；
优选地，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。
更具体地，所述内质网分子伴侣蛋白KAR2与其他分子伴侣的组合是串联连接，优选地通过自裂解肽2A作为连接肽进行连接，例如F2A的氨基酸序列长度75bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13；
优选地，所述的α-乳白蛋白来源牛Bostaurus，更优选地，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。
本发明因此提供一种含有分子伴侣和α-乳白蛋白的编码基因的重组菌株，其中所述分子伴侣是内质网分子伴侣蛋白KAR2、ERV2或SLY1，或它们之间的两两组合，或与其他分子伴侣的组合，优选地所述内质网分子伴侣蛋白KAR2与其他分子伴侣的组合是通过自裂解肽2A作为连接肽进行连接，例如F2A的氨基酸序列长度75bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO.13。
优选地，所述其他分子伴侣选自下述任意之一：
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的钙联接蛋白CNE1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的内质网氧化还原酶ERO1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2；
氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的转录因子HAC1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的二硫键异构酶PDI；
氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的与高尔基体和细胞膜之间的囊泡运输相互作用的转运蛋白SEC1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的调节内质网的氧化应激的过氧化物歧化酶SOD1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的糖基转移酶STT3；
或者来源Kluyveromyces lactis且与上述各序列号所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白。
优选地，所述内质网分子伴侣蛋白的组合是串联连接，优选地通过自裂解肽2A作为连接肽进行连接，例如F2A的氨基酸序列长度75bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13。
优选地，所述的α-乳白蛋白来源牛Bostaurus，更优选地，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。
优选地，基础质粒是pUDP025，且删除了编码SpCas9的基因序列、gRNA序列以及核酶Hammerhead ribozyme和HDV ribozyme序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供含有所述的表达载体的重组菌株，优选为酵母菌；优选地，所述α-乳白蛋白的基因整合在菌株的基因组上。
优选地，为乳酸克鲁维酵母菌，更优选为乳酸克鲁维酵母GG799。
本发明提供一种增加表达α-乳白蛋白的方法，其特征在于，包括培养发酵所述的重组菌株，收集α-乳白蛋白的步骤，任选地还包括纯化α-乳白蛋白的步骤；
优选地，是将所述重组菌株接种于含有潮霉素的YPGal液体培养基中，经乳糖、棉子糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、纤维二糖、山梨糖或半乳糖诱导发酵。
本发明的优势在于：首先，α-乳白蛋白的表达宿主乳酸克鲁维酵母被FDA认定为食品安全级GRAS菌株，也是我国法律规定的保健食品生产安全菌株；其次，乳酸克鲁维酵母碳源利用范围广，可以利用乳糖、半乳糖、棉子糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖以及一些不易被酵母利用的碳源如纤维二糖、山梨糖等获取能量。本技术使用的诱导剂为半乳糖，无食品安全隐患和生产安全隐患，更可以探索低价原料来降低生产成本；另外，本发明利用的表达系统以及分子伴侣组合，α-乳白蛋白的生产水平远高于现有技术。综上所述，本发明相比现有技术具备明显优势。
本发明将筛选了一系列分子伴侣或优化后的分子伴侣组合在α-乳白蛋白乳酸克鲁维菌株中共表达。筛选出三个分子伴侣ERV2、KAR2、SLY1和组合KAR2-SLY1、KAR2-ERV2、SLY1-ERV2可以显著提高α-乳白蛋白表达量。分子伴侣组合KAR2-SLY1表现出最优的提升效果，α-乳白蛋白的表达量提高了2.2倍，摇瓶产量达到76mg/L，在5L发酵罐中的产量达到600mg/L以上。
附图说明
图1基础质粒pUDP025-simple图谱示意图
图2pUDP025-simple-chaperone质粒图谱示意图
图3为单个分子伴侣影响α-乳白蛋白的表达量western-blot图，图3A中1为GG799-pKLAC1阴性对照，2为GG799-α-LA，3为GG799-α-LA-pUDP025-simple，4-7为GG799-α-LA-CNE1、GG799-α-LA-ERV2、GG799-α-LA-ERO1、GG799-α-LA-KAR2，8为1μgα-LA标品；图3B中1-7为GG799-α-LA-SLY1、GG799-α-LA-GPX2、GG799-α-LA-HAC1、GG799-α-LA-PDI、GG799-α-LA-SEC1、GG799-α-LA-SOD1、GG799-α-LA-STT3，8为1μgα-LA标品。
图4为不同分子伴侣组合对α-LA产量的影响。其中1为GG799-α-LA，2-4分别为GG799-α-LA-KAR2-SLY1、GG799-α-LA-KAR2-ERV2和GG799-α-LA-SLY1-ERV2，5为1μgα-LA标品。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进一步进行阐述，但并不构成对本发明的限制。
实施例一：乳酸克鲁维酵母表达α-乳白蛋白的初始菌株构建
由华大基因有限公司经过密码子优化后人工合成牛α-乳白蛋白的基因序列，使用无缝克隆的连接方式构建至质粒pKLAC1中的Xho I和Not I酶切位点之间。将合成的重组载体pKLAC1-α-LA经Sac II酶切线性化，线性化产物经过片段纯化后转化至宿主菌GG799感受态细胞中。将转化的菌株涂布于含有5mM乙酰胺的YCB固体平板上，30℃培养3-5天获得转化子。转化子通过菌落PCR扩增目标基因来确认阳性转化子。最终，得到表达α-乳白蛋白的初始重组菌GG799-α-LA。
培养基：
YCB固体平板(100mL)：3mL 1M Tris-HCl pH 7.5；1.17g YCB；2g琼脂粉加水至99mL，121℃20min灭菌后，加入1mL过滤灭菌的0.5M乙酰胺。
YPGal(1L)：10g酵母粉；20g蛋白胨溶于800mL水中，121℃20min灭菌后，加入200mL过滤灭菌的10％半乳糖。
实施例二：分子伴侣表达质粒的构建
以实验室保存的质粒pUDP025(addgene#103874)为模板，并对其进行改造。删除编码SpCas9的基因序列、gRNA以及Hammerhead ribozyme和HDV ribozyme序列；保留抗性序列，自主复制序列等。以P1/P2和P3/P4为引物对，扩增模板分别获得两个片段，序列长度为1585bp和4268bp。以Gibson方式组装连接两片段，化学法转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布氨苄抗性平板。获得的单菌落利用引物对P5/P6进行菌落PCR，产物片段长度为2112bp即组合正确，并在华大公司测序验证。成功获得的质粒大小5853bp，并将其命名为pUDP025-simple。
表1构建质粒pUDP025-simple的引物序列
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| P1 | gttcttaaaaacataatcaacaatgtgagcggttttgtataactaaataa |
| P2 | tatcgacaaaggaaaaggggcctgttttgtttgtttatgtgtgtttattc |
| P3 | gaataaacacacataaacaaacaaaacaggccccttttcctttgtcgata |
| P4 | ttatttagttatacaaaaccgctcacattgttgattatgtttttaagaac |
| P5 | aatgttcaacaatctataatcag |
| P6 | tgttacatgcgtacacgcgt |
将各个分子伴侣序列插入至ScTDH3启动子和CYC1终止子序列之间。同样使用Gibson无缝克隆的方式，以上述质粒pUDP025-simple为模板，利用表2中P025-vector正反向引物扩增载体序列。利用表2中各个分子伴侣的正反向引物扩增分子伴侣序列，将两片段连接。连接产物化转至大肠杆菌DH5a感受态，涂布氨苄抗性平板。使用各自的正向引物和上表中的P6引物检测是否连接成功，并测序验证序列的正确性。获得的质粒分别命名为pUDP025-simple-CNE1、pUDP025-simple-ERO1、pUDP025-simple-ERV2、pUDP025-simple-GPX2、pUDP025-simple-HAC1、pUDP025-simple-KAR2、pUDP025-simple-PDI、pUDP025-simple-SEC1、pUDP025-simple-SLY1、pUDP025-simple-SOD1、pUDP025-simple-STT3。
各分子伴侣的氨基酸序列如下：
CNE1氨基酸序列：
MNPLLLLSQIGFGTLAVAINPMVKGDYRIEHPNMTDLSDLQSKLSSDSYFESFQYSSHDEFIHNWVISELEMEHVDETMSRAFPGLWKLESPYLVPGFSNDLALVLGSSQTRSAIAHKLDHEISVKTKEKLVVQYEVKLQKMLECGGAYMKLLKTNADDLSQYDHSADDYVLVFGPDSCSMYTNEVHFILKRENPISEEFEDKYLTEAPLSGLDQPITRLYTLILDSADQSFEIRIDGEVVKAGNLLAEGTFRPSLNPPREIEDPSASQPADWDSRSMIPDPTAIKPEDWDENEPKWIPDPMFKKPEEWDDSISEYIEDESRSKPDWWNDKVDGRWIAPLIVNPSCYTKQGCGKWRPKMVENEKYRGTWKAEMIPNPNYQGEWKAPLIANPNYYEDKTPANIDAITAISFDIWSSASDISFDNIYVGKSIEEAELVGNSTFLPKLSLEKKELEVVMEKAHSEDVNEVDTSEESSKKTPYKNVVDKENHLDYLKLIDEKIKSCKTLQTFIAWFLQVDDLYKGFLISAFMVVVVSISCMGMLKFLMWSQGIDLSSSSNASRKPKKIENETSDGPSANTVTEIAASTGYSTPSSKVISQRTIQLQGDSDFDEELEISIVEESGSASDSEDK(SEQ ID NO：2)；
Ero1氨基酸序列：
MVKVLQLCFLSAISLVQALNSTVDQKDEAKVDINTVFDNDSTNFCRMDKTEAIGATCDVTFHEINEVNNNIRPQLLSLVQSDFFKYFKLDLYKECPFWSDNNGYCVNRACAVDVVEDWDSLPEYWQPEILGNIENATTDITDDECSFLDELCDKPRFEAEKDIEYCDTNDFNSQHSVLVDLTANPERFTGYGGEQSSQIWSSIYKENCFSLGDENQCLAKDAFYRLISGLHASIGTHLSNEHLNTETGKWEPNLELFMTRVGNFPDRVSNIYFNFAVVAKALWKIRPYMNELGFCNAYNEDVKGMIDGVVSQLNSKVFNEDLLFHDEVSGQLKDDFRIRFKNVTKIMDCVQCDRCRLWGKVQTTGYATSLKILFEMDNDDDVARQHVVDKLTKYELIALFNTFDRLSKSVEAVNRFEEMYNYQLKSPGEKLASFFQLDNFFKVLNDKFNSANHSSQEKESVSNVEKKVNEFNDLKMPEKKKETHTEVREQASGVFKEAWDVEWKNFKQALRFIVTSYTDLPSTVSKYTVLKLNKLWNKFIGVPNYLEEGEELEYPSYNYEE(SEQ ID NO：3)；
Erv2氨基酸序列：
MSIKLKVGLHKQRIVTITTLLMIGLLWFTFSNSQLPIEGSPSLGGTKSDLFGGLSANAKNDDASGTIMPKMPDQEAKKALGRASWKYFHTLLARFPDEPTEQEKTKLREFLYLYAELYPCGECSYHFVKMLKKYPPQVASRTTAALWGCHIHNLVNDHLEKPRYDCNTILEDYDCGCTDENGNIDPSLKMNKVTLNKEEKQLG(SEQ ID NO：4)；
GPX2氨基酸序列：
MSKFYELAPKDKKGEPFPFTQLEGKVVLIVNVASKCGFTPQYKELEALYKKYEDKGFIVLGFPCNQFGHQEPGTDEEISQFCQLNYGVSFPILKKVDVNGSEADPVYDFLKNEKSGLLGFKGIKWNFEKFLVDKKGTVVERYSSLTKPSSLEEPIEKLLNE(SEQ ID NO：5)
HAC1氨基酸序列：
MTGKNSVSDIPVNFKPTLPPRKRAKTQEEKEQRRIERILRNRRAAHQSREKKRLHVQRLEEKCHLLEGILKMVDLDILSENNAKLSGMVEQWREMQVSDSGSISSHDSNTGMLDSPESLTSSPDKKDHYSHSSHSTSISSSSSSSSPSNLPHGMVTDNGMLDEDNNSLNYILGQQNYQLSSTPVVKLEEDHSMLLENNGDADLNDVGISFIAEDGTNSDNKNIDMRNQETGEGWNLLLTVPPELNSDLSELEPSDIISPIGLDTWRNPEAQSSMLAVDFDDLMD(SEQ ID NO：6)；
KAR2氨基酸序列：
MFSARKSSVGWLVSSLAVFYVLLAVIMPIALTGSQSSRVVARAAEDHEDYGTVIGIDLGTTYSCVAVMKNGKTEILANEQGNRITPSYVSFTDDERLIGDAAKNQAASNPKNTIFDIKRLIGLQYNDPTVQRDIKHLPYTVVNKGNKPYVEVTVKGEKKEFTPEEVSGMILGKMKQIAEDYLGKKVTHAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGAIAGLNILRIVNEPTAAAIAYGLDKTEDEHQIIVYDLGGGTFDVSLLSIENGVFEVQATAGDTHLGGEDFDYKLVRHFAQLFQKKHDLDVTKNDKAMAKLKREAEKAKRSLSSQTSTRIEIDSFFNGIDFSETLTRAKFEELNLALFKKTLKPVEKVLKDSGLQKEDIDDIVLVGGSTRIPKVQQLLEKFFNGKKASKGINPDEAVAYGAAVQAGVLSGEEGVEDIVLLDVNALTLGIETTGGVMTPLIKRNTAIPTKKSQIFSTAVDNQKAVRIQVYEGERAMVKDNNLLGNFELSDIRAAPRGVPQIEVTFALDANGILTVSATDKDTGKSESITIANDKGRLSQDDIDRMVEEAEKYAAEDAKFKAKSEAR(SEQ ID NO：7)；
PDI氨基酸序列：
MLFKNTVRFGLAALMAASCSAQGDAVAPEDSAVVKLDADTFHEFIKEHPLVLAEFFAPWCGHCKTLAPEYVKAADELESKDIPLAQIDCQENQQFCQEQGIPGYPSLKLFKNGNPEAAGEYQGGRDAKAIVNYMLKQSEPAVQVVEDEKAFNEIIAKNLDNTYVVDGSVPEFNETFYQVADSLRDDYSFIQHGSDGKLSIYLPGESEPIVYEGEDFDAETISTWIAVEAFPYFGDVNGETYQAYMAVKVPLAYFFYTSPEEREEYESHFVDLAKKFRGKVNFAGLDASKFGRHAENLNQKQQFPLFAIHDTIKDLKYGLPQLADEEFAALEKPITLATEEITKFVEDFLEGKAEPIVKSEEIPEIQENSVFKIVGKNHEEIVRDPKKDVLVEYYAPWCGHCKKLAPTYESMAEFAHENDELKDKVLIAKIDATANDVQSVEIPGFPVLYLWPAGEETEPILFEGPRTAEAFLAFIKENGSHGVDGLALYEEYLVEVEKKKQEEEEAQKAKEVEEVAEEDSELEQDEL(SEQ ID NO：8)；
SEC1氨基酸序列：
MSNLVELQRNFIINILKEVRTEHNIKFLVIDDVVDQLIDSLFADRNDLLTYVTAVDRIDSPKRKGQSSVEVIYLLKATKFNINCMDADFGNHSIKYKRAHIRFLSEFPRNLVDHFNKRRYLTSNVADLKVINCAFTPKEYQYFETLGIDKPLQIFYNPTCKDLVDIGIYKTVQSLLNVCIITGEYPIVRYSEPTAEEYALNEATLLPKRVAMAFQQELDDYARDHNDFPPENSRPRAIMVITDRVLDLFSPVLHDFSYQALAYDISKNIDRRTDTYSYKVENETGVMEPKTSRLSDLLDPDWVTMKHFHIVDASEYLTSKVNELIAKNPLLVDRANVKDTSDLLNVVAHLKDFDEERRRIALHRTLLDECFEHSKTCKLAEHAEIEQILAGYGTDFDGEKCKHISEKLIEHLSDTSSAVTDRVRYIIEYALYRGGIIDFDFIKLLAFIGVDKSNSWFKHFMQLFKNFNYLGFKLVKDKPKDKPFQKEWTHDTIVNDSTIYQTSRYIPSVGNILGKVITNPLLLKEEQFPYVKDKPIELLEADVADSLNTKSTQPTSLRNPRHKAAWAKTTTQPKGNRQRFFYYVIGGITYSEIKACYDQSKLNNKDVFVGSDSIWTPLQFMANVEDLTKPRELLRLREDAPVREEPPEFLTASNPPIATAPKHIHTVSISQPSRKVERDTTNKEPEVAKKQSKLSRFLKRK(SEQ ID NO：9)；
SLY1氨基酸序列：
MLNSELSLRDRQILSIEKMLLFNSDKGTEAATSNLDEQEIVWKVLIMDARSTAIISSVMRVNDLLKSNVTVHALITQQRSPLPDVPAVYFVEPTEANIDAIVQDLKEDKYSETYINFTTTLKRDLLETFASKASATGKSDRIKQVYDQYLDFVVTEPEMFSLEMPGTYGLINNPQSSEDVITNLCDSIATGIFNAIVTIGTIPIIRAQRGGAAEMVAQKLETKLRDYVNGTRSSASGSTSFERFVLVIVDRNIDIASMFAHSWIYQCLVFDVFKLSRNTITMPTTNEQNEEVIKKMDIDPKDFFWIANSHLPFPDAVENVETELSNYKKDAEEITKKTGVSNLTDLDPTGQSDTIQIQEAVKKLPLLTARKSTIDTHMTVLAGLLKQLESKGLDSFFELEQSSDSSKTRQDFLAALKDGKTNNIEDKARTYIIMYLTAQEILPSAFVKEVEQYFQSVEYDISALKYIYDLRHMFKLSSMALQNKSLETHTSANSEGQDGNASQLLSGLSNKLYGLTEGKIQGVSSLLSGIKQLLPEKKTIPITNIVEAIMDPLNSSKKNLHITSEYLYFDPRSTRGSHEKLPKSQTYNKSLVFVVGGGNYFEYQNLQEWVHQHENSNKKVIYGSTDIISPNGFLKEISGFKK(SEQ ID NO：10)；
SOD1氨基酸序列：
MVNAVAVLKGDSSVSGIVRFEQESEDQQTKISWEITGNDANALRGFHIHTFGDNTNGCTSAGPHFNPFNKNHGAPEDEERHVGDLGNIPTDAQGISKGSLTDKHIKLLGPLSIVGRTVVVHAGQDDLGKGGDAESLKTGNAGARHACGVIGISNA(SEQ ID NO：11)；
STT3氨基酸序列：
MKQSTLLALEGFQTVLKALIFIAIFGVAISSRLFSVIRFESIIHEFDPWFNFRATKYLVSHSFYEFLNWFDDRTWYPLGRVTGGTLYPGLMTTSGAIWHILRKIGLPIDIRNICVLFAPAFSGFTAWATYEFTKELKDSSAGLLAAAFMAIAPGYISRSVAGSYDNEAIAITLLMVTFMFWIKAQKTGSILYSMLAALFYFYMVSAWGGYVFITNLIPLHVFILILMGRYQSKLYSAYTTWYAIGTLASMQIPFVGFLPIRSNDHMAALGVFGLIQIVALGDYIKSQVSGERFKVVMFISLGLIISIGISGLFFLTYMGYIAPWTGRFYSLWDTNYAKIHIPIIASVSEHQPPAWPSFFFDNQFLIWLFPAGVFLLFLELKDEHVFVLAYSVLCSYFAGVMIRLMLTLTPIICVTGAIAISKLFDIYLDFSVALSTKSPKDVKSVKLDKEKKETSDLEQEDDDYEAELVVDYEPSSKARWFDITAKAVVSSTFLMYLFLFVYHCTYVTSNFYSSPSVVMPSQNPDGSVALIDDFREAYYWLRMNTAEDAKVAAWWDYGYQIGGMADRTTLVDNNTWNNTHIAIVGKAMSSPEEKAYEILKAHDVDYVLVVFGGALGYSGDDLNKFLWMVRISEGIWPDEVKERNFFTSRGEYRVDADATKTMKDSLMYKLSYHDFPSIYPNGVGHDRTRNQKITNNEVGPLDYFEEVFTSEIWLVRIYKLKSPDALGRDHGEAAKFDRNLQSGVKKRLVKKPELELRV(SEQ ID NO：12)；
表2扩增分子伴侣的引物序列
实施例三、组合表达分子伴侣质粒的构建
双分子伴侣的构建，以实施例二中构建好的单分子伴侣质粒为骨架，以F2A肽和拟插入的第二分子伴侣作为插入片段构建到第一个分子伴侣的序列下游。其中，本实施例采用F2A核苷酸序列如下：GGTTCTGGTGTCAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTCAAGTTGGCCGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGACCC(SEQ ID NO：13)。
以pUDP025-simple-KAR2-SLY1为例，设计引物KSP1/KSP2扩增F2A片段；以pUDP025-simple-SLY1为模板，使用KSP3和SLY1-反向引物对扩增SLY1片段。PCR纯化两个片段，使用一步重叠PCR将F2A和SLY1两片段连接为一个片段，并通过胶回收获得F2A-SLY1片段。使用KSP4和P025-vector正向引物，以pUDP025-simple-KAR2为模板扩增载体片段vector-KAR2，胶回收纯化片段。同样使用实施例二的Gibson的方法将vector-KAR2和F2A-SLY1片段连接起来。转化大肠杆菌，氨苄平板中长出的菌落使用KAR2正向和SLY1反向引物检测，并测序验证。
pUDP025-simple-KAR2-ERV2的构建，引物KSP1/KEP5扩增F2A片段，KEP6和ERV2反向引物扩增ERV2片段，同样的一步重叠PCR方法连成一条片段F2A-ERV2，载体片段同上vector-KAR2，两片段连接和转化方式同上。使用KAR2正向和ERV2反向引物检测转化子，并测序验证。
pUDP025-simple-SLY1-ERV2的构建，引物SEP7/KEP5扩增F2A片段，KEP6和ERV2反向引入扩增ERV2片段，同样的一步重叠PCR方法连成一条片段F2A-ERV2-2。使用引物SEP8和P025-vector正向引物，以pUDP025-simple-SLY1为模板扩增载体片段vector-SLY1，胶回收纯化片段，两片段连接和转化方式同上。使用SLY1正向和ERV2反向引物检测转化子，并测序验证。
表3构建组合分子伴侣的引物序列
实施例四、分子伴侣重组α-乳白蛋白乳酸克鲁维的构建和表达表征
提取实施例二和三中测序验证正确的pUDP025-simple-chaperone质粒，利用ZymoResearch公司的酵母转化试剂盒Frozen-EZ Yeast Transformation IITMKit(货号：T2001)转入乳酸克鲁维酵母GG799-α-LA菌种中。涂布于含有浓度150μg/mL的潮霉素YPGal固体平板上，30℃培养3-5天，直至长出单菌落。
将上述单菌落接入含有150μg/mL潮霉素的YPGal液体培养基中进行培养，培养24小时后以1％的接菌量重新接入含有150μg/mL潮霉素的YPGal液体培养基中，诱导72小时后，收集发酵液上清。以不含分子伴侣质粒的初始重组菌GG799-α-LA发酵液上清作为对照。利用12％SDS-PAGE检测表达产物、通过western blot来确证产物。其中一抗为APPLYGEN/普利莱(生产)的鼠抗α乳白蛋白单克隆抗体(9E9)(货号：C1385-50)；二抗为Easybio/柏奥易杰(生产)的Goat Anti-Mouse IgG(H&L)-HRP Conjugated羊抗鼠(货号：BE0102-100)。
如图3所示：本发明所制备的重组GG799-α-LA-chaperone菌株中，pUDP025-simple-ERV2、pUDP025-simple-KAR2和pUDP025-simple-SLY1可以明显提高α-LA的分泌量，分别可以增加35％、48％和20％的产量。表达水平提升最高的分子伴侣是KAR2，其他的单分子伴侣不能显著提高α-LA的分泌量(表4)。
表4不同分子伴侣和组合对α-LA产量的影响
选取表现好的分子伴侣组合表达，检测组合后对α-LA表达的影响。如图4所示：不同分子伴侣组合对α-LA产量的影响。三种分子伴侣组合pUDP025-simpleK-KAR2-SLY1、pUDP025-simple-KAR2-ERV2和pUDP025-simple-SLY1-ERV2都可以增强α-LA的分泌表达，重组菌α-LA的表达量分别是原来的2.2、1.8和1.53倍。KAR2-SLY1组合使得a-乳白蛋白的表达量提高了2.2倍，摇瓶产量达到76mg/L，在5L发酵罐中的产量达到600mg/L以上。
Claims (10)
1.一种内质网分子伴侣蛋白KAR2、ERV2或SLY1在增强酵母菌株表达α-乳白蛋白的能力中的应用，其中内质网分子伴侣蛋白KAR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、ERV2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、SLY1的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白，优选地所述内质网分子伴侣蛋白KAR2与α-乳白蛋白共表达；优选地，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。
2.一种内质网分子伴侣蛋白的组合在增强酵母菌株表达α-乳白蛋白的能力中的应用，其中所述内质网分子伴侣蛋白的组合是下述分子伴侣之间的组合：
氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的KAR2；
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的钙联接蛋白CNE1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的内质网氧化还原酶ERO1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的FAD-结合巯基氧化酶ERV2；
氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2；
氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的转录因子HAC1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的二硫键异构酶PDI；
氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的与高尔基体和细胞膜之间的囊泡运输相互作用的转运蛋白SEC1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的调节内质网和高尔基体之间的转运蛋白SLY1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的调节内质网的氧化应激的过氧化物歧化酶SOD1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的糖基转移酶STT3；
或者来源Kluyveromyces lactis且与上述各序列号所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白；
优选地，所述组合为两个分子伴侣蛋白的组合。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述内质网分子伴侣蛋白的组合是分子伴侣KAR2、ERV2或SLY1之间的两两组合；
优选地，内质网分子伴侣蛋白的组合与α-乳白蛋白共表达；
优选地，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述内质网分子伴侣蛋白的组合是串联连接，优选地通过自裂解肽2A作为连接肽进行连接，例如F2A的氨基酸序列长度75bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13；
优选地，所述的α-乳白蛋白来源牛Bostaurus，更优选地，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。
5.一种含有分子伴侣和α-乳白蛋白的编码基因的重组菌株，其特征在于，所述分子伴侣是内质网分子伴侣蛋白KAR2、ERV2或SLY1，或它们之间的两两组合，或与其他分子伴侣的组合，优选地所述内质网分子伴侣蛋白KAR2与其他分子伴侣的组合是通过自裂解肽2A作为连接肽进行连接，例如F2A的氨基酸序列长度75 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13；
其中内质网分子伴侣蛋白KAR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、ERV2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、SLY1的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白。
6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述其他分子伴侣选自下述任意之一：
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的钙联接蛋白CNE1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的内质网氧化还原酶ERO1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2；
氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的转录因子HAC1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的二硫键异构酶PDI；
氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的与高尔基体和细胞膜之间的囊泡运输相互作用的转运蛋白SEC1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的调节内质网的氧化应激的过氧化物歧化酶SOD1；
氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的糖基转移酶STT3；
或者来源Kluyveromyces lactis且与上述各序列号所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白。
7.含有如权利要求5所述的的重组菌株，其特征在于，基础质粒是pUDP025，且删除了编码SpCas9的基因序列、gRNA序列以及核酶Hammerhead ribozyme和HDV ribozyme序列。
8.如权利要求5至7任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为酵母菌；所述α-乳白蛋白的基因整合在菌株的基因组上。
9.如权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，为乳酸克鲁维酵母菌，更优选为乳酸克鲁维酵母GG799。
10.一种增加表达α-乳白蛋白的方法，其特征在于，包括培养发酵如权利要求5至9任一项所述的重组菌株，收集α-乳白蛋白的步骤，任选地还包括纯化α-乳白蛋白的步骤；
优选地，是将所述重组细胞菌接种于含有潮霉素的YPGal液体培养基中，经乳糖、棉子糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、纤维二糖、山梨糖或半乳糖诱导发酵。
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