CN106939315A

CN106939315A - 一种草酸脱羧酶的制备方法及应用

Info

Publication number: CN106939315A
Application number: CN201710015055.3A
Authority: CN
Inventors: 汪小锋; 汪卫; 吴玉峰; 宋保平
Original assignee: WUHAN KANGFUDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUHAN KANGFUDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2037-01-09
Also published as: CN106939315B

Abstract

本发明公开了一种草酸脱羧酶的制备方法，首先构建包含芽胞杆菌属的酸诱导启动子和分泌信号肽以及在其调控下配置的真菌来源的草酸脱羧酶基因的重组表达质粒载体，用该载体转化可以在pH≤4.5下正常生长的芽胞杆菌，制备草酸脱羧酶重组菌。将该重组菌在发酵培养基中培养补加酸后进行诱导，通过简单纯化回收产生的胞外草酸脱羧酶。本发明方法制备的胞外草酸脱羧酶用于诊断试剂原料，药物组合物、保健食品或特殊医学用途配方食品的原料。采用突变的酸诱导启动子替换重组表达载体中的原始酸诱导启动子，转化芽胞杆菌能获得更高的表达量。

Description

一种草酸脱羧酶的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物酶制备技术领域，具体而言，涉及一种草酸脱羧酶的制备方法及其应用。

背景技术

草酸(Oxalic acid)，又叫乙二酸(Ethanedioic acid)，是生物体的一种代谢产物，广泛分布于植物、动物和真菌体中，并在不同的生命体中发挥不同的功能。研究发现至少有100多种植物富含草酸，尤以菠菜、苋菜、甜菜、马齿苋、芋头、茶叶、可可、甘薯和大黄等植物的叶片和种子中含量最高，由于草酸可降低矿质元素的生物利用率，在人体中容易与钙离子形成草酸钙导致肾结石，所以草酸往往被认为是一种矿质元素吸收利用的拮抗物。草酸在人体内不容易被氧化分解掉，经代谢作用后形成的产物，属于酸性物质，可导致人体内酸碱度失去平衡，吃得过多还会中毒。而且草酸在人体内如果遇上钙和锌便生成草酸钙和草酸锌，不易吸收而排出体外，影响钙与锌的吸收。儿童生长发育需要大量的钙和锌，如果体内缺乏钙和锌，不仅可导致骨骼、牙齿发育不良，而且还会影响智力发育，过量摄入草酸还会造成人体内血液和尿液中的草酸含量过高，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶体，草酸钙晶体很容易形成泌尿系结石。因此，控制从饮食中摄取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸量，从而降低患结石风险。低草酸饮食或降解食物中草酸的防治草酸钙结石的策略在医学界已成为共识。

泌尿系结石是泌尿系统的常见病和多发病，该病的主要特点是临床治愈后复发率较高，给患者带来了极大的痛苦，给家庭带来了沉重的心理和经济上的负担。草酸钙是泌尿系结石的主要成分，占比达80％，导致草酸钙结石症的重要原因是人体内缺乏降解草酸的代谢途径。近年来，研究酶法降解草酸预防治疗草酸钙结石症成为该领域的研究热点(贺俊斌,林日辉,龙寒等.草酸降解酶预防治疗草酸钙结石症的研究进展.[J]广东医学,36(7):1132-1136)。

目前生物界降解草酸的酶包括草酸氧化酶(Oxalate oxidase,EC 1.2.3.4)、草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase,EC 4.1.1.2，以下简称OXDC)和草酰辅酶A脱羧酶(Oxaly1-coenzyme A decarboxylase,EC 4.1.1.8)。OXDC是将草酸分解为甲酸和二氧化碳的酶，其内部含有锰。迄今已知，许多细菌如芽胞杆菌(Bacillus)属，集胞藻和乳酸菌属等、霉菌如曲霉(Aspergillus)属等、金针菇(Flammulina velutipes)，彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)，疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),白腐菌(Trametes versicolor),褐腐菌属(Monilinia)等含有草酸脱羧酶基因(以下也称“oxdc基因”)。

草酸脱羧酶在上述物种中的表达量极低，而且多数菌种生长缓慢，成分复杂，分离提取纯化十分困难，不具备商业化应用可能，所以将草酸脱羧酶进行重组表达生产成为其商业化应用的必然选择。目前草酸脱羧酶中实现原核重组表达的还比较少，多数是在大肠杆菌中进行重组表达。金针菇来源的OXDC有通过烟草表达成功过报道，但表达量极低。但目前用芽胞杆菌中表达系统表达外源的OXDC尚未见有文献报道，尤其是来源于真核生物的OXDC。另外，大肠杆菌中表达真菌来源的OXDC存在酶活力低，不能实现分泌表达，非常易于形成包涵体，复性和纯化困难，用作食品原料和药物原料的OXDC在生产纯化过程中需要去除内毒素。真菌来源的OXDC多数在酸性pH条件下活力较高且较为稳定，溶解状态的OXDC对环境的pH比较敏感，而枯草芽胞杆菌中的最适生长pH一般在6.5-7.5之间，pH低于5.5几乎不生长，因此在枯草芽胞杆菌中和其它芽胞杆菌系统中表达真菌来源的OXDC还没有成功的案例。

发明内容

为了解决现有技术中真菌来源OXDC无法在芽胞杆菌表达系统中高效分泌表达，以及分泌到胞外的OXDC能在发酵液中维持稳定的这一技术问题，本发明提供一种高效生产真菌来源的草酸脱羧酶的方法。具体而言，本发明的目的在于提供对于高效生产真菌来源的重组草酸脱羧酶表达载体、使用该载体制备的重组菌和使用该重组菌的草酸脱羧酶生产方法及其应用。

一种高效生产真菌来源的重组草酸脱羧酶表达载体，包括含有酸诱导启动子、分泌信号肽、去原始信号肽的草酸脱羧酶基因和trpA终止子的表达质粒，其中，所述酸诱导启动子是在指pH值为1.5～4.5的条件下，能在芽胞杆菌中启动基因表达的启动子，所述分泌信号肽是指在芽胞杆菌中能促进真菌来源的草酸脱羧酶基因分泌表达信号肽序列。

如上所述的重组草酸脱羧酶表达载体，优选地，所述酸诱导启动子自枯草芽胞杆菌Bs168菌株的酸诱导启动子，所述分泌信号肽来源于解淀粉芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyQ或碱性蛋白酶、枯草芽胞杆菌的碱性蛋白酶aprE或α-淀粉酶amyE、地衣芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyL或碱性蛋白酶、嗜热脂肪地芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyS或碱性蛋白酶。

如上所述的重组草酸脱羧酶表达载体，优选地，所述去原始信号肽的草酸脱羧酶基因的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5任一所述的序列。

如上所述的重组草酸脱羧酶表达载体，优选地，所述酸诱导启动子的序列如SEQID NO.6所示，所述分泌信号肽的序列如SEQ ID NO.7所示，所述去原始信号肽的草酸脱羧酶基因的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5任一所述的序列，所述trpA终止子的序列如SEQ ID NO.8所示。

如上所述的重组草酸脱羧酶表达载体，优选地，酸诱导启动子为发生突变的酸诱导启动子，其序列如SEQ ID NO.9所示。

一种草酸脱羧酶的制备方法，将如上所述的重组草酸脱羧酶表达载体转化到在pH≤4.5下正常生长的耐酸性的芽胞杆菌中，制备草酸脱羧酶重组菌，在发酵培养基中培养该重组菌，并补加酸至pH值为3.0～4.5进行草酸脱羧酶的诱导表达。

如上所述的制备方法，优选地，所述耐酸性的芽胞杆菌为环状芽胞杆菌、嗜热脂肪地芽胞杆菌或解淀粉芽胞杆菌。

如上所述的制备方法，优选地，所述补加酸时所用的酸为盐酸、磷酸、硫酸、草酸/草酸盐、乙酸、丙二酸、丁二酸、柠檬酸或植酸。

如上所述的制备方法，优选地，培养重组菌至OD600达到0.8～3.0后，再补加酸，诱导表达结束后通过离心收集上清，调节该上清的pH值和硫酸铵沉淀实现重组草酸脱羧酶的初步纯化。

如上所述的制备方法制备的草酸脱羧酶在诊断试剂，药物组合物、食品制品中的应用。

本发明方法制备的胞外草酸脱羧酶用于诊断试剂原料，药物组合物、保健食品或特殊医学用途配方食品的原料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果在于：

本发明的重组表达方法，将真菌来源草酸脱羧酶基因oxdc成功通过耐酸性芽胞杆菌表达系统进行重组表达，直接重组草酸脱羧酶重组分泌到发酵液中，且分泌到发酵液中的OXDC稳定性较好，表达量高，不形成包涵体，无需细胞破碎和包涵体复性，提高了表达效率，简化生产和纯化步骤，降低了生产成本；且分泌的蛋白质产品中不会混杂有内毒素(热源性脂多糖)，具有生物安全性。本发明采用的芽胞杆菌系统具有较强的分泌能力，能在相对简单的培养基中能生长到很高的密度，生产成本低。

本发明还采用了突变的酸诱导启动子替换重组表达载体中的原始酸诱导启动子，转化芽胞杆菌获得更高的表达量。

附图说明

图1为包含酸诱导启动子的重组表达载体pHYAQ-oxdc的构建示意图。

图2为本发明一优选的重组菌株在不同pH值产OXDC的相对酶活力。

图3为本发明一优选的重组菌株采用不同的酸诱导产OXDC的相对酶活力。

图4为本发明优选的重组菌株与对照菌株的产OXDC的酶活力。

图5为本发明一优选的重组菌株产OXDC的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

本发明人为了发现高效生产真菌来源的OXDC的方法进行了反复研究。具体而言，使用五种真菌来源的OXDC作为代表，构建其高效生产系统。

首先，制作枯草芽胞杆菌属的酸诱导启动子，在该启动子的调控下连接有分泌信号肽和去原始信号肽的oxdc基因的重组表达质粒载体，所述的酸诱导启动子是在酸性条件下(pH 1.5～4.5)能在芽胞杆菌中启动基因表达的启动子，优选来自枯草芽胞杆菌Bs168菌株的酸诱导启动子。

信号肽是影响低pH稳定且有活力的草酸脱羧酶表达的关键因素，因此编码信号肽部分的基因必须能够高效引导外源草酸脱羧酶的分泌；所述的分泌信号肽来源于解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α-淀粉酶AmyQ或碱性蛋白酶，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的碱性蛋白酶aprE或α-淀粉酶amyE，地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)的α-淀粉酶AmyL或碱性蛋白酶，嗜热脂肪地芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶AmyS或碱性蛋白酶等，优选来自淀粉酶的信号肽，更优选来解淀粉芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyQ的信号肽。

优选地，上述真菌来源的OXDC序列(SEQ ID NO.1～5)是经过密码子优化的序列；所述密码子优化是将其密码子更换为更加适合于芽胞杆菌系统表达的密码子。然后，得到用该载体转化耐酸性性的芽胞杆菌属的菌株，得到系列重组菌。绝大多数的芽胞杆菌能在pH 5.5～9.0的范围生长，只有少数的几种芽胞杆菌耐酸性较强，能在pH≤4.5的培养基中正常生长。通常情况下，真菌来源的草酸脱羧酶很难在原核表达系统中表达成功。以上所述的耐酸性芽胞杆菌为环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)，嗜热脂肪地芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌，但不限于这三种菌，能在pH 4.5及以下的培养条件下正常生长的芽胞杆菌菌株都在上述耐酸性芽胞杆菌的范围。考察重组菌的草酸脱羧酶活力，结果发现三种耐酸性的重组芽胞杆菌都有草酸脱羧酶活性，优选解淀粉芽胞杆菌。

进一步的实验发现，使用发生突变的酸诱导启动子(突变型启动子)时可以进一步实现OXDC生产率的提高。另一方面，研究了以解淀粉芽胞杆菌为宿主的生产系统中的培养条件，确定了其最佳产酶条件，成功实现了真菌来源草酸脱羧酶在解淀粉芽胞杆菌中的高效分泌表达。

下面通过具体实施例来说明本发明，应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。

在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

本发明中用到的CICC编号的芽胞杆菌菌株均来源于CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心，http://www.china-cicc.org/)，大肠杆菌-芽胞杆菌穿梭质粒pHY300PLK来源于Takara公司(http://www.takara.com.cn/)；本发明中用到的所有的Phusion DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、磷酸化酶等分子生物学试剂从Thermofisher公司购买(http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/thermo-scientific.html)；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(http://www.vazyme.com/)；其它常用生化试剂均是市售分析纯。PCR产物回收和胶回收DNA的方法均采用omega公司的试剂盒的方法。

实施例1耐酸性芽胞杆菌的筛选

本发明人先后筛选了实验室保藏和菌种保藏中心购买的百余种芽胞杆菌物种，其中包含环状芽胞杆菌CICC10353、CICC10403、CICC21250和CICC23053等，嗜热脂肪地芽胞杆菌CICC10142、CICC10267、CICC10362、CICC10392、CICC10425、CICC10782和CICC10842等，解淀粉芽胞杆菌CICC10025、CICC10035、CICC10036、CICC10063、CICC10074、CICC 10081和CICC10079、CICC10163等。筛选到几株耐酸性较强的芽胞杆菌。筛选方法如下：

种子培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，葡萄糖10g/L，pH 6.0；筛选培养基(1L):玉米粉20g，玉米浆5g，酵母粉2g,氯化铵1.0g，氯化锰0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.91g，CaCl₂ 0.5g，pH 3.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L)500mL，培养过程维持pH值为3.5-4.0之间，初始装液量为250mL摇瓶装筛选培养液50mL，接种量为2％，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间48h。

培养结束后，测定各菌株的吸光度值OD600值，选择值较高的吸光度值(如OD600值大于20)作为候选的耐酸性宿主菌。芽胞杆菌的许多种属都较难遗传转化，用pHY300PLK质粒作为测试质粒，对候选宿主菌进行遗传转化，考察转化效率，选择转化率高(如转化率大于1)的菌株作为优选的宿主菌；最终发现，CICC10074，CICC10079，CICC10035和CICC10267等适合为宿主菌。

实施例2草酸脱羧酶基因的克隆

本发明中的真菌草酸脱羧酶基因是基于公共数据库中登录的真菌来源的oxdc基因，按照解淀粉芽胞杆菌的密码子进行优化得到优化基因，然后通过商业化的基因测序和合成公司全基因合成。以下是基于公共数据库中登录的真菌来源oxdc基因的进行密码子优化后，经实验验证获得的去原始信号肽的草酸脱羧酶基因的几个例子(微生物名：数据库名：原始基因登录号：优化的基因序列在序列表的序列编号)如下：

真姬菇(Hypsizygus marmoreus):GenBank:LUEZ01000002.1:SEQ ID NO.1；

灰盖鬼伞菌(Coprinopsis cinerea okayama):GenBank:XM_001836586.2:SEQ IDNO.2；

变色栓菌(Trametes versicolor):GenBank:XM_008041462.1:SEQ ID NO.3；

岛生异担子菌(Heterobasidion irregulare):GenBank:XM_009546343.1:SEQ IDNO.4；

毛韧革菌(Stereum hirsutum):GenBank:XM_0073008481:SEQ ID NO.5。

本发明的最大特征在于组合使用芽孢杆菌属来源的酸诱导启动子和真菌来源的oxdc基因在耐酸性芽胞杆菌表达系统中高效表达，并且真菌来源的oxdc基因的种类没有特别限制。因此，只要是迄今为止鉴定的真菌来源的oxdc基因原则上均可以采用，优选使用低pH值下稳定的可食用真菌来源的oxdc基因，即上述优化后去原始信号肽的oxdc基因序列如SEQ ID NO.1～5所示，均可实现在耐酸性芽胞杆菌表达系统中高效表达。

其中，序列SEQ ID NO.1所示的真姬菇的oxdc基因Hmoxdc，其对应的蛋白序列为SEQ ID NO.10所示。序列SEQ ID NO.1可全基因合成得到，也可PCR扩增获得，PCR扩增基因Hmoxdc可采用的上下游引物为HmOxDC-F1和HmOxDC-R1，扩增条件：50μL的PCR体系为：5XPhusion HF Buffer 10μL,10mM dNTP 1μL,10μM primer F/R各1.5μL，模版DNA 0.5μL，Phusion DNA Polymerase 0.5μL，dH₂O 35μL；PCR反应条件如下:98℃30s，30个循环(98℃10s，58℃30s，72℃50s)，72℃5min，4℃保温10min；其中HmOxDC-F1和HmOxDC-R1的序列如下：

HmOxDC-F1(SEQ ID NO.11)：5’-GCACCGGCACCTGCAGCATCATCT-3’

HmOxDC-R1(SEQ ID NO.12)：5’-TTACTTCGGACCAACCACCGTCAG-3’

SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.10的序列如下：

SEQ ID NO.1：

5’-GCACCGGCACCTGCAGCATCATCTTCAGCACCGACAGTGAGCACGGTGTCTTCAGTCATTGCACCGATCAGCCCGACGGCCGAAAGCTCAGTTGCTGCCTCCAGCGCCTCAAACAAACCGCGTCCGACGTCGACGGCGACAGCCACGGAACCGACAGCAACGGTGCCGTTCATTGACCTGGACCCGAATGAACCGCTTTGGAACGAAGACACACCGGGAATCCATCAACCGATTCATGGCTCACTTGGAGCCAAACTTCTGGGACCGACAAACAACGCGATCGTCAAACAGAACCCGGACTTACTGGCTCCGCCGACGACAGATCACGGCAGCGTACCGAATGCCAAATGGCCGTTCAGCCTTAGCCATAATCGTCTGCAAACAGGAGGCTGGGCGCGTGAAGAAAATATTGCTGTAATGCCGGTCGCCCAGGCTATGGCCAGCGTCAACATGCGCCTTGAAGCTGGTGCAGTACGTGAACTGCACTGGCATAAAACAGCAGAATGGGCATATGTTCTGAAAGGCTCCACGCAAGTCACAGCCGTGGATGCCGATGGGCGTAACTTCGTCTCCACGGTTGGCCCGGGTGACCTTTGGTACTTCCCGCCTGGTATCCCGCATTCACTTCAAGCAACGAATGACGACCCTGATGGTTCTGAATTCGTCTTAGTCTTCGACTCAGGCTCTTTTAGCGAAGATTCAACGTTCTTACTTACAGATTGGTTAGATCACGTTCCGGCTGAAGGTACATGGTCAATTCCGATCACGTTAGTATCTCTTAACTCCGGACATTTTCAGTATTGGCCGAAAATTTCCAAATGTCGCAACATCTCTGCCTTCGCACACATTCCTGCTGAGGAACTGTACATTTTCCCGGCTGCACTGCCGGAACCTGATAGCGCTGCTCCGAAAAGCCCGCAAGGCACAGTCCCGGATCCGTTTTCATTTTCAATGTCAAAAGTCAAACCGACGCAGCTGACGGGAGGCACGGTCAAAGTTGTGGATTCCACAACGTTCAAAATCTCCAAAACAATTGCCGCTGCAGAAGTCACAGTTGAACCGGGTGCAATTCGGGAGCTGCATTGGCACCCGACACAAGACGAATGGAGCTTCTTTATTGAGGGTGAAGGTCGTATGACGATTTTCGCCTCGCAGTCCAATGCCCGTACGTTCAACTATCAGGCTGGTGATATCGCAAAAACGAACCGCAGCACAGGGCATTACCTGGAGAACACCGGCAACACGACACTGCGGTTCCTGGAGATTTTCAAATCCGAGAAATTCCAGGATATCAGCTTAGCTCAGTGGCTTGCATTGACGCCGCCGAAATTAGTCAAAGAGCATTTAGGTTTCTCTGACGACGTCATTGCTCGGCTTTCGAAAACAAAACTGACGGTGGTTGGTCCGAAGTAA-3’

SEQ ID NO.2：

5’-GTGCCGTCTCCGTGGGTGAAACACATCCCGAGGGAGCTTGAGGGCAGCTTCTGGCCGCACCCGCCTAAACCGCAGTCTCAAAGCGAAATCCTTGGCGGCGGCACAGCTCCGCACTCAGGCAACGAGTCTCCGTCTACACCGCAGGATACGCCGAGCGCTTCAGGTACGGACACAGCTGTGCCGGCGCACGAAACGGTCCCGACAATTTCTTTGGACCGCAACGACCCGGTTTGGGACTCTAGCTTTGAGGGCCCGTTCGATGCTATCCGTGGACCGCTGGGCGCGACGATTATTGGCCCGAATAACCCGAACATCGCGGTTCAGAATCCGGACTTGTTCGCTCCGCCGTCTACGGATTCTGGTACAGTACCGAACGTCAAATGGCCGATGTCTTTGAGCCATAATCGCCTTCAAACGGGTGGATGGGCACGTCAACAGAACATTGATGTCATGCCGATCGCGAAAGCTATGGCTGGTGTGAACATGCGTTTGAAACCGGGAGCTATTCGTGAACTGCACTGGCATTCTACGGCAGAATGGGCTTATGTGATTAAAGGATCTACACAAGTCACATCTGTCGATGCTGAGGGTCGTAACTTCATCTCAACGGTTGGCCCGGGCGATTTGTGGTACTTCCCGCCGGGTATCCCGCATTCTTTGCAAGCTACAGGTGACGACCCGGAAGGCTCAGAGTTCTTGCTTGTGTTCGACGATGGCGCGTTCTCTGAAGACAATACATTCATGCTGACAGACTGGCTTGCTCACGTCCCGGCTGGAGTGCTGGAGAAAAACTTCCAACTTGGTGCTACAGCTTTCGCAGACCTTCCGGCTAAAGACCTGTACATCTTCCCGGCTGACGTCCCGGCAGACGACCAAGAAGCACCGGAGAGCCCGTTCGGAACAGTGCCGGACCCGTTCTCTTTCGCTCTTTCTAAAATGAACGCTACGCAATTTGAAGGTGGATCTGTGAAAATTGTCGATTCTACAACATTTAAAATCTCTAAAACGATTGCGGCTGCTGAGGTTACGGTTGAACCGGGTGCAATGCGTGAGCTTCACTGGCACCCGACACAGGACGAGTGGGATTTCTTCCTGGAGGGTCAAGGTCGTATCACAGTATTCGCTGCTCAGGGCAATGCTCGTACATTCGATTTCCAGGCTGGAGATGTTGGTTATATTCCGGCATCATTCGGACATTACATCGAGAACACGGGTAACACAACATTGAAATTCCTTGAAATTTGGAATACACCGAAATTCCAGGATATCTCTTTGGCTCAGTGGCTGGCTCTTATCCCGCCGTCTCTTGTCAAAGCTCATCTTGGATTCACGGACGAAGTGATCGAGAAATTGCCGAAAACGAAACCGGTTGTTGTAGTCCCGAAAAGCGCTTCTAAATAA-3’

SEQ ID NO.3：

5’-GCACCGGCTGCTGCGTCTTCTGGCATCGCGAGCAGCGCAGCTGCTACAGCGAGCTCAGCGGCTTCGTCGGCTGCGTTCGCGAGCGCTAGCTCTGCGGTCTCTAGCGTGTTTGCGTCTGCTAGCTCTGCTGTGGCTTCTAGCGACCTTCGCTCTAGCAAAACAGTGGCTCCGACAAGCTCTTTCTCAGCTGAACCGGCTTCTGTCACGGTGCCGTTCGCTAGCGATGACCCGAACGGCATGTTATGGGGCGAAGATTCTACAACAGACCCGCAGGCTATTCGTAACACGCTTGGTGCGACAATCATGGGCCCGCAGAACATTCCGATCGCGCTGCAGAACCCGGACCTTCTTGCGCCGCCGAGCACAGACGAAGGCAGCGTTCAGAATGCTAAATGGCCGTTCGCGCTGAGCCACAACCGCCTGCAAACGGGCGGATGGGCACGTCAGCAGAACATCGATGTGATGCCGATCGCGAAATCTATGGCTGGCGTTAACATGCGTCTTGAAGCGGGCGCGATTCGTGAACTTCACTGGCACAAAACAGCTGAATGGTCTTATGTTACAAAAGGCTCTGTTCAGGTGTCTTCTATCAACTCTGACGGCCAAAACTACCTTGCTACGGCGAGCGCGGGCGACCTCTGGTACTTCCCGCCGGGCGTGCCGCATTCTCTTCAGGCGACAGCTGATGACCCGGACGGCACGGAATTCCTGCTGGTCTTCGACGACGGCGCGTTCAGCGAAGACTCAACATTCCTGCTTACGGATTGGCTTGCACACGTCCCGAAAGAAGTGCTTGCGAAAAACTTCAAAACAAATATCTCTGCATTCGACCACATCCCGGCGAAACAGCTTTACATCTTCCCGTCTGCGCCGCCGCCGGACAACGCTCAGGCTCCGTCTGACCCGCAGGGTCAGATCCCGAGCCCGTTCGTGTTCCACCTGTCTCAGGTGAAAGCGACGGATCTGGACGGCGGCTCTGTCAAAGTCGTCGACTCTACAACATTCCCGGTTGCTCAGGCGATCGCTGTCGCTGAAGTCACAGTCGAGCCGGGAGCGATGCGTGAGCTTCACTGGCACCCGACACAGGACGAGTGGACATACTACCTTGAGGGCCAGGGCCGCGTGACGCTTTTCGCATCTAGCAGCAACGCGCGCACGTTCAACTACGAGGCGGGAGACGTCGGCTTCGTGCCGGCTTCTTTCGGACACTACGTCGAAAACACGGGCAACACAACGCTTCGCTTCCTTGAAATCTTCAACACGAACCGCTTCGAAGACATTTCTCTCAGCCAGTGGCTTGCGCTTACGCCGCCGGCTCTGGTTAAAGCGCACCTGGACCTTGACGACGAAACGATCGCTAACCTGAGCAAAACAAAACTGACAGTCGTCGGCCCGGCTTAA-3’

SEQ ID NO.4：

5’-GCACCGGCGAGCAACCCGTCTGCAGCGACATCTTCTACAGCTCTGGCATCTCCGGTATCTGTATCTAACTCTACGGATTCTACAGCGTCTGTCTCTGGACCGCCGTCTGCGACGTCTGACGCGTCAGCAGCTAGCCCGAGCCCGACGGTTCCGTTTGCGTCTGACGACCCGAACACAGTCATCTTCTCTCCGGGCGCAGACGTCCAGCCGGAAGCTCAACGTGGCACACTTGGCAGCACAGTTATCGGACCGCAGAATGTGCAAATCGATCGTCAAAATCCGGACTTCCTGGCACCGCCGACAACGGACAATGGAGACGTGTCTAATGCGAAATGGCCGTTTGGACTGAGCCACAATCGTATCCAGACAGGAGGCTGGGCACGTCAGCAAAACATCGAGAATATGCCGATTGCTACGCAGATGGCTGGAGTTGACATGCGTCTTGAACCGGGCGCTGTTCGTGAGCTTCATTGGCACAAAACGTCTGAATGGTCTTATGTCATCAAAGGCTCTACGCAAGTTACGGCTGTTGATCAAGACGGCAAAAACTATCTGGCTACAGTGAACGCAGGTGACCTTTGGTACTTCCCGCCGGGCATTCCGCACTCTCTTCAAGCGACGAATGACTCTGCAGAGGGCACAGAGTTCCTGCTGGTCTTCGACGATGGAGCTTTTAGCGAAGACGCTACATTTCTGCTGACAGATTGGCTTGCGCATGTCCCGAAAGAGGTCATCGCTAAAAACTTCCAGACAGACATTTCTGCGTTTGATGATATCCCGGGACGTGAGCTTTACATTTTCCCGGCTGCGGTTCCGTCTTCTGATGCTACAGCTGTCTCAGATCCGCAAGGCCAGGTTCCGAATGCTTTCTCTTTCGCTATGTCTAAAATCAATGCTACACAATTATCAGGTGGAACAGTTAAAATTGTGGATTCGACGACATTCCCGATCTCAACGACAATCGCTGCTGCGGACGTCACGGTTGAACCGGGAGCTATGCGTGAGTTACACTGGCATCCGACACAGGATGAATGGACGTATTTCATTGAAGGCGATGCTCGCATGACAATCTTTGCATCACAAAGCAACGCACGTACATTTGATTATCAAGCTGGCGATATTGGATATGTTCCGGCATCTTTCGGCCATTATGTCGAGAATATTGGAAATACGACACTGCACTACCTTGAGATCTTCAAAACGGATCGTTTCCAGGATGTCAGCCTGAGCCAGTGGCTTGCTCTTACACCGCCGGAGCTTGTCAAAGCTCATCTTGGCCTTTCTGATGCTACGATTGCAACGCTGAAAAAAACGAAACAAACGGTTGTTGGACCGTCTTAA-3’

SEQ ID NO.5：

5’-GCTCCGGCAGCTACGTCTTCTGACGCGTCTCTGTCTATCTCTGTCGAATCTTCTTCTACGGAAACAGCTTCTGCGTCTGCTGCTGCAGAATCTCCGTCTACAACAGTGTCTCTGGCACCGACGGCTCCGAATGGCCCGCTGTACACGCCGGGCGCAGACATCCAACCGGAACCGATCCGTGGAACGCTTGGAGGCACGATCCTGGGCCCGCAGAACATTGCTATCGACCAGCAGAATCCGGACATGCTTGCGCCGCCGACGACAGATCATGGCGACGTGCCGAACGCTAAATGGCCGTTTTCTCTGTCTCACAATCGTCTGCAAACAGGAGGATGGGCTCGTCAGCAGAACATTGAAGTAATGCCGATCGCAACACAGATGGCTGGCGTGGATATGCGTCTGGAACCGGGCGCAATTCGTGAACTGCACTGGCACACAAGCTCTGAATGGGCTTATGTCCTGAAAGGATCTACACAAGTCACAGCGGTAGATCAAAATGGCAAAAACTTTCTGGCTACGGTGGAACCGGGAGACCTGTGGTACTTCCCGCCGGGTATCCCGCACTCTCTGCAGGCTACGAACGAGTCTACAGAAGGCAGCGAGTTTCTGCTGGTATTCGATGATGGTGCTTTCTCTGAAGACGACACATTTTTACTGACAGACTGGTTAGCTCATGTCCCGAAAGAGGTCATCGCTAAAAACTTTCAGCTGGATATTTCTGACTTCAATTCTCTGCCGGGCGAAGAACTGTACATCTTCCCGGCAGAACCGCCGTCTCCGGATGCAGTAGCGCCGTCTGACCCGCTGGGCCAAGTACCGCAAGCTTTTTCTTTCGCTATGTCTAAAATGAATGCTACGCAGCTGAGCGGAGGCACAGTCAAAATCGTGGACTCTACAGTCTTCTCTGTTTCAACGACAATTGCTGCTGCGGATGTTACAGTCGAACCGGGCGCTATGCGTGAACTGCACTGGCACCCGACGCAGGACGAATGGTCATTCTTCATCGAAGGCACAGGACGTATGACAATCTTCGCATCTGACAGCAACGCTCAAACATTCGACTACGAAGCTGGCGATATTGGCTACGTGCCGGCTACATATGGCCACTACGTGGAAAACGTCGGCAACACGACGCTGCATTATCTGGAAATCTTCAAAACGGATCGCTTCCAGGACGTTTCTCTGGCTCAGTGGCTGGCACTGACACCGCCGGCTCTGGTCAAAGCTCACCTGGGCCTGTCTGACGAAGTCATCGCGCAGTTCAACAAAACAAAACAGGTCGTCGTCGGCCCGCGCCACTAA-3’

SEQ ID NO.10(真姬菇(Hypsizygus marmoreus)OXDC蛋白序列去信号肽部分)：APAPAASSSAPTVSTVSSVIAPISPTAESSVAASSASNKPRPTSTATATEPTATVPFIDLDPNEPLWNEDTPGIHQPIHGSLGAKLLGPTNNAIVKQNPDLLAPPTTDHGSVPNAKWPFSLSHNRLQTGGWAREENIAVMPVAQAMASVNMRLEAGAVRELHWHKTAEWAYVLKGSTQVTAVDADGRNFVSTVGPGDLWYFPPGIPHSLQATNDDPDGSEFVLVFDSGSFSEDSTFLLTDWLDHVPAEGTWSIPITLVSLNSGHFQYWPKISKCRNISAFAHIPAEELYIFPAALPEPDSAAPKSPQGTVPDPFSFSMSKVKPTQLTGGTVKVVDSTTFKISKTIAAAEVTVEPGAIRELHWHPTQDEWSFFIEGEGRMTIFASQSNARTFNYQAGDIAKTNRSTGHYLENTGNTTLRFLEIFKSEKFQDISLAQWLALTPPKLVKEHLGFSDDVIARLSKTKLTVVGPK。

实施例3酸诱导启动子的克隆

酸诱导启动子使用芽胞杆菌属来源的启动子，只要是迄今为止鉴定的芽胞杆菌属来源的酸诱导启动子原则上均可以采用，这里以枯草芽胞杆菌来源的酸诱导启动子为例。首先由枯草芽胞杆菌Bs168菌株通过常规方法获得染色体DNA。参考数据库上的枯草芽胞杆菌oxdc基因(Gene ID 938620)前的序列，设计特异性扩增酸诱导启动子区域的引物F2和R2，以枯草芽胞杆菌Bs168菌株的染色体DNA作为模板，使用设计好的引物(F2和R2)进行PCR，由此得到酸诱导启动子Poxdc的DNA片段，其序列如SEQ ID NO.6所示。

F2(SEQ ID NO.13)：5’-AGCTTGACCACTTCATTTTTC-3’

R2(SEQ ID NO.14)：5’-GAAATGTTTCCTCCTTACAT-3’

实施例4重组表达载体构建

在耐酸性的芽胞杆菌中表达真菌来源的重组OXDC表达载体中oxdc基因表达框由以下原件构成：酸诱导启动子序列，分泌信号肽序列，去原始信号肽序列的真菌来源oxdc基因序列，终止子序列。其中，所述分泌信号肽序列是指在芽胞杆菌中能促进真菌来源oxdc基因分泌表达信号肽序列，如以解淀粉芽胞杆菌作为表达宿主情况下优选来自解淀粉芽胞杆菌的分泌信号肽。以pHY300PLK穿梭载体为骨架，构建的重组OXDC表达载体如图1所示。

具体地，要获得分泌信号肽序列，先设计引物F3和R3，以解淀粉芽胞杆菌CICC10074的基因组DNA为模版，克隆编码解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶AmyQ基因信号肽的DNA序列，序列如SEQ ID NO.7所示，其对应的蛋白序列如SEQ ID NO.15所示。

分泌信号肽序列还可采用解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的碱性蛋白酶，枯草芽胞杆菌的碱性蛋白酶aprE或α-淀粉酶amyE，地衣芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyL或碱性蛋白酶，嗜热脂肪地芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyS或碱性蛋白酶等。

设计重叠PCR引物，通过重叠PCR的方法将酸诱导启动子Poxdc(SEQ ID NO.6)、解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶信号肽序列(SEQ ID NO.7)、真姬菇草酸脱羧酶基因Hmoxdc和trpA终止子序列(SEQ ID NO.8)拼接成一个完整的基因表达框序列，再用无缝克隆试剂盒的方法，将这一基因表达框插入到pHY300PLK载体中。具体地，第一步以实施例3和上述的描述分别扩增获得SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的DNA片段，以浓度1:1混合作为模版，设计重叠PCR引物扩增两个片段的融合片段，标记这个序列为片段a；第二步，真姬菇草酸脱羧酶基因Hmoxdc是按实施例2扩增获得，trpA终止子序列(SEQ ID NO.8)是直接合成得到，以真姬菇草酸脱羧酶基因Hmoxdc和trpA终止子DNA片段浓度的3:1混合物为模版，设计重叠PCR引物扩增两个片段的融合片段，标记这个序列为片段b；然后将片段a和片段b以浓度比1:2混合作为模版，设计重叠PCR引物扩增两个片段的融合片段即获得拼接的基因表达框序列；第三步，设计引物F4和R4线性化pHY300PLK载体；第四步，设计引物F5和R5扩增上述拼接的基因表达框序列，通过无缝克隆试剂盒的方法，将基因表达框序列整合到用引物F4和R4线性化后pHY300PLK载体中，转化大肠杆菌DH5α。用Inoue法制备DH5α超级感受态,方法参考《分子克隆实验指南(第3版)》，涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pHY-Hmoxdc；其中，采用F5和R5的扩增条件：50μL的PCR体系为：5X Phusion HF Buffer 10μL,10mM dNTP 1μL,10μM primer F5/R5各1.5μL，模版DNA 0.5μL，Phusion DNA Polymerase 0.5μL，dH₂O 35μL；PCR反应条件如下:98℃30s，30个循环(98℃10s，58℃30s，72℃60s)，72℃5min，4℃保温10min。

采用的引物序列如下：

F3(SEQ ID NO.16)：5’-ATGATTCAAAAACGAAAGCG-3’

R3(SEQ ID NO.17)：5’-GGCTGATGTTTTTGTAATCG-3’

F4(SEQ ID NO.18):

5’-TGAGCGGGCTTTTTTACGGATCCCCGGGAATTCCT-3’

R4(SEQ ID NO.19):5’-CGACCTGCAGATCTCTAGAAG-3’

F5(SEQ ID NO.20):

5’-GAGATCTGCAGGTCGAGCTTGACCACTTCATTTTTC-3’

R5(SEQ ID NO.21):5’-AAAAAAGCCCGCTCATTAGGC-3’。

其它序列如下：

SEQ ID NO.6：

5’-AGCTTGACCACTTCATTTTTCAATCGAAGTTGACTTTTCACTGGTTTTTTTCACTTAACAAAACAGAAGGGAAAACGAAAGGCCTTTCACCTTCTCTTTCTGCTATCACATTTAAATGTAAGGAGGAAACATTTC-3’

SEQ ID NO.7：

5’-ATGATTCAAAAACGAAAGCGGACAGTTTCGTTCAGACTTGTGCTTATGTGCACGCTGTTATTTGTCAGTTTGCCGATTACAAAAACATCAGCC-3’

SEQ ID NO.15：MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSA

SEQ ID NO.8：

5’-TGAATTCGAGCACTAGTGCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTT-3’

进一步，以启动子Poxdc(SEQ ID NO.6)为模版，通过定点突变的方法获得突变的酸诱导启动子(SEQ ID NO.9)，将该序列送到基因合成公司进行合成，然后将其连接到T载体上，采用F6(SEQ ID NO.22)(5’-ATGATTCAAAAACGAAAGCG-3’)和R4线性化pHY-Hmoxdc载体。具体地，采用F7和R7扩增，其扩增条件：50μL的PCR体系为：5X Phusion HF Buffer 10μL,10mM dNTP 1μL,10μM primer F7/R7各1.5μL，模版DNA0.5μL，Phusion DNA Polymerase0.5μL，dH₂O 35μL；PCR反应条件如下:98℃30s，30个循环(98℃10s，58℃20s，72℃10s)，72℃5min，4℃保温10min；模版是基因合成SEQ ID NO.9；扩增获得突变的的酸诱导启动子(SEQ ID NO.9)，通过无缝克隆试剂盒的操作方法，将通过用F6和R4线性化后的载体pHY-Hmoxdc中的酸诱导启动子替换成突变的酸诱导启动子即含有SEQ ID NO.9，转化大肠杆菌DH5α，涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pHY2-Hmoxdc。其中：

SEQ ID NO.9：

5’-ATCATGCAAGCAATGATTTTTCAATCGAAGTTGACTTTCACTGGTTTGGTTTCACTTAACAAATCAAAATTTTTAAAAATCGAAATCTCTTTCACCTTGTCTTTGTGCTATTACATTTAAATGTAAGGAGGAAACATCTT-3’

F7(SEQ ID NO.23)：

5’-GAGATCTGCAGGTCGATCATGCAAGCAATGATTTTTC-3’

R7(SEQ ID NO.24)：

5’-TCGTTTTTGAATCATAAGATGTTTCCTCCTTACAT-3’

实施例5重组表达菌株的构建

根据质粒抽提试剂盒说明书的方法提取上述实施例中制备的pHY300PLK、pHY-Hmoxdc和pHY2-Hmoxdc质粒，电转化到解淀粉芽胞杆菌CICC10074中，涂布到含有10μg/ml氯霉素抗性的LB固体培养基平板上筛选阳性克隆子。阳性克隆子命名为CICC10074-pHY-Hmoxdc和CICC10074-pHY2-Hmoxdc，即重组表达菌株，对照菌株为CICC10074-pHY300PLK。解淀粉芽胞杆菌CICC10074感受态细胞制备和电转化方法参考枯草芽胞杆菌的电转化的方法(参见文献：Xue GP et al.,High osmolarity improves the electro-transformationefficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacilluslicheniformis.J Microbiol Meth.1999,34(3):183-191.)。

实施例6分析方法

草酸HPLC测定方法:采用文献报道的方法(Clausen CA et al.,Oxalateanalysis methodology for decayed wood，International Biodeterioration andBiodegradation.2008,62:372-375)。草酸脱羧酶活力测定：将1ml 5mM草酸盐溶液(其中含50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.0)，在37℃预热10分钟后，加入0.05-0.1ml含草酸脱羧酶的适当稀释的发酵液上清，37℃，200rpm恒温震荡反应30分钟，加入50μL的2.5M H₂SO₄终止反应，立即将终止反应后的样品12000rpm离心10min，取上清用0.45μm膜过滤至液相进样瓶中，用HPLC测定残留草酸盐浓度。一个酶活力单位(U)为在此条件下，每分钟降解1μmol草酸盐所需的酶量。蛋白条带分析采用SDS-PAGE分析的方法。

实施例7重组菌的培养方法

上述制备的重组表达菌株在5mL种子培养基中，30℃，200rpm培养12h。种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl,5g/L，KH₂PO₄2g/L，葡萄糖10g/L，起始pH 6.0。以4％的接种量接种到发酵培养基中，初始装液量为250mL摇瓶装液50mL，接种量为2％，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养到OD600到达0.8～3.0之间开始补酸诱导，优选采用培养4小时左右，OD600到达1.0开始诱导。发酵培养基组成为：玉米粉20g/L，玉米浆5g/L，酵母粉2g/L,氯化铵1.0g/L，氯化锰0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.91g/L，CaCl₂ 0.5g/L，pH 4.8的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液500mL/L。

补加酸直到发酵液pH为3.0～4.5之间进行诱导草酸脱羧酶的表达，用20％的磷酸分别调节发酵培养基的pH为3.0,3.5,3.8,4.0,4.2和4.5,37℃诱导培养30h。

用实施例5制备的重组表达菌株CICC10074-pHY-Hmoxdc进行上述表达测试，采用实施例6所述的方法进行检测，结果如图2所示，结果表明在pH 4.0时酶活力最高。

补酸时采用盐酸、磷酸、硫酸、草酸/草酸盐、乙酸、丙二酸、丁二酸、柠檬酸和植酸，分别用以上的酸诱导剂调节发酵培养基的pH为4.0,37℃诱导培养30h，用实施例5制备的重组表达菌株CICC10074-pHY-Hmoxdc进行上述表达测试，采用实施例6所述的方法进行检测，结果如图3所示，表明用植酸作为酸诱导剂时，酶活力最高。

对比两种重组表达菌株和对照菌株的产酶效率，在发酵培养基中，发酵液的OD600达到1.0时，采用植酸调节发酵液pH为4.0，每隔4-8h取样一次，每次取样1mL，采用实施例6方法测定发酵液pH和发酵液上清的OXDC活力。结果如图4所示，酸诱导启动子能成功诱导真菌来源草酸脱羧酶的高效表达，突变的酸诱导启动子启动oxdc基因表达的效率比原始酸诱导启动子高，发酵60小时时重组表达菌株CICC10074-pHY2-Hmoxdc分泌的OXDC的活力比重组表达菌株CICC10074-pHY-Hmoxdc高30％左右，活力达到50,000U/L。

实施例8重组OXDC的初步纯化

采用实施例7所述的发酵条件进行发酵,收集重组表达菌株CICC10074-pHY2-Hmoxdc的发酵液1L，12000g，4℃离心10分钟，取上清到烧杯中，加热到55℃保温10分钟，用6M的HCl调节pH 2.5，12000g，4℃离心10分钟，上清倒入另外一个烧杯置于冰浴中，加入总体积25％的硫酸铵对蛋白进行沉淀45分钟，加入固体硫酸铵时，边加入边搅拌，12000g，4℃离心10分钟，沉淀用25mM的pH3.0的柠檬酸缓冲液溶解，对上述通过离心收集上清，调节pH值和硫酸铵沉淀等简单步骤的初步纯化获得的OXDC即真姬菇的OXDC，进行SDS-PAGE分析和酶活力测定分析。如图5是初步纯化后的真姬菇的OXDC，分子量大小约为50kDa，纯度在90％以上。

上述重组表达的OXDC直接分泌到发酵液中，稳定性较好，且不形成包涵体，无需细胞破碎和包涵体复性，表达量高，提高了表达效率，有效简化生产和纯化步骤，降低了生产成本。

将实施例4制备的重组表达载体转入到其它耐酸性的芽胞杆菌，如环状芽胞杆菌、嗜热脂肪地芽胞杆菌等均可获得稳定表达的OXDC，在此将不再赘述。

应当指出，以上所述仅为本发明的优选实施例，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉康复得生物科技股份有限公司

<120> 一种草酸脱羧酶的制备方法及应用

<130>

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcaccggcac ctgcagcatc atcttcagca ccgacagtga gcacggtgtc ttcagtcatt 60

gcaccgatca gcccgacggc cgaaagctca gttgctgcct ccagcgcctc aaacaaaccg 120

cgtccgacgt cgacggcgac agccacggaa ccgacagcaa cggtgccgtt cattgacctg 180

gacccgaatg aaccgctttg gaacgaagac acaccgggaa tccatcaacc gattcatggc 240

tcacttggag ccaaacttct gggaccgaca aacaacgcga tcgtcaaaca gaacccggac 300

ttactggctc cgccgacgac agatcacggc agcgtaccga atgccaaatg gccgttcagc 360

cttagccata atcgtctgca aacaggaggc tgggcgcgtg aagaaaatat tgctgtaatg 420

ccggtcgccc aggctatggc cagcgtcaac atgcgccttg aagctggtgc agtacgtgaa 480

ctgcactggc ataaaacagc agaatgggca tatgttctga aaggctccac gcaagtcaca 540

gccgtggatg ccgatgggcg taacttcgtc tccacggttg gcccgggtga cctttggtac 600

ttcccgcctg gtatcccgca ttcacttcaa gcaacgaatg acgaccctga tggttctgaa 660

ttcgtcttag tcttcgactc aggctctttt agcgaagatt caacgttctt acttacagat 720

tggttagatc acgttccggc tgaaggtaca tggtcaattc cgatcacgtt agtatctctt 780

aactccggac attttcagta ttggccgaaa atttccaaat gtcgcaacat ctctgccttc 840

gcacacattc ctgctgagga actgtacatt ttcccggctg cactgccgga acctgatagc 900

gctgctccga aaagcccgca aggcacagtc ccggatccgt tttcattttc aatgtcaaaa 960

gtcaaaccga cgcagctgac gggaggcacg gtcaaagttg tggattccac aacgttcaaa 1020

atctccaaaa caattgccgc tgcagaagtc acagttgaac cgggtgcaat tcgggagctg 1080

cattggcacc cgacacaaga cgaatggagc ttctttattg agggtgaagg tcgtatgacg 1140

attttcgcct cgcagtccaa tgcccgtacg ttcaactatc aggctggtga tatcgcaaaa 1200

acgaaccgca gcacagggca ttacctggag aacaccggca acacgacact gcggttcctg 1260

gagattttca aatccgagaa attccaggat atcagcttag ctcagtggct tgcattgacg 1320

ccgccgaaat tagtcaaaga gcatttaggt ttctctgacg acgtcattgc tcggctttcg 1380

aaaacaaaac tgacggtggt tggtccgaag taa 1413

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtgccgtctc cgtgggtgaa acacatcccg agggagcttg agggcagctt ctggccgcac 60

ccgcctaaac cgcagtctca aagcgaaatc cttggcggcg gcacagctcc gcactcaggc 120

aacgagtctc cgtctacacc gcaggatacg ccgagcgctt caggtacgga cacagctgtg 180

ccggcgcacg aaacggtccc gacaatttct ttggaccgca acgacccggt ttgggactct 240

agctttgagg gcccgttcga tgctatccgt ggaccgctgg gcgcgacgat tattggcccg 300

aataacccga acatcgcggt tcagaatccg gacttgttcg ctccgccgtc tacggattct 360

ggtacagtac cgaacgtcaa atggccgatg tctttgagcc ataatcgcct tcaaacgggt 420

ggatgggcac gtcaacagaa cattgatgtc atgccgatcg cgaaagctat ggctggtgtg 480

aacatgcgtt tgaaaccggg agctattcgt gaactgcact ggcattctac ggcagaatgg 540

gcttatgtga ttaaaggatc tacacaagtc acatctgtcg atgctgaggg tcgtaacttc 600

atctcaacgg ttggcccggg cgatttgtgg tacttcccgc cgggtatccc gcattctttg 660

caagctacag gtgacgaccc ggaaggctca gagttcttgc ttgtgttcga cgatggcgcg 720

ttctctgaag acaatacatt catgctgaca gactggcttg ctcacgtccc ggctggagtg 780

ctggagaaaa acttccaact tggtgctaca gctttcgcag accttccggc taaagacctg 840

tacatcttcc cggctgacgt cccggcagac gaccaagaag caccggagag cccgttcgga 900

acagtgccgg acccgttctc tttcgctctt tctaaaatga acgctacgca atttgaaggt 960

ggatctgtga aaattgtcga ttctacaaca tttaaaatct ctaaaacgat tgcggctgct 1020

gaggttacgg ttgaaccggg tgcaatgcgt gagcttcact ggcacccgac acaggacgag 1080

tgggatttct tcctggaggg tcaaggtcgt atcacagtat tcgctgctca gggcaatgct 1140

cgtacattcg atttccaggc tggagatgtt ggttatattc cggcatcatt cggacattac 1200

atcgagaaca cgggtaacac aacattgaaa ttccttgaaa tttggaatac accgaaattc 1260

caggatatct ctttggctca gtggctggct cttatcccgc cgtctcttgt caaagctcat 1320

cttggattca cggacgaagt gatcgagaaa ttgccgaaaa cgaaaccggt tgttgtagtc 1380

ccgaaaagcg cttctaaata a 1401

<210> 3

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gcaccggctg ctgcgtcttc tggcatcgcg agcagcgcag ctgctacagc gagctcagcg 60

gcttcgtcgg ctgcgttcgc gagcgctagc tctgcggtct ctagcgtgtt tgcgtctgct 120

agctctgctg tggcttctag cgaccttcgc tctagcaaaa cagtggctcc gacaagctct 180

ttctcagctg aaccggcttc tgtcacggtg ccgttcgcta gcgatgaccc gaacggcatg 240

ttatggggcg aagattctac aacagacccg caggctattc gtaacacgct tggtgcgaca 300

atcatgggcc cgcagaacat tccgatcgcg ctgcagaacc cggaccttct tgcgccgccg 360

agcacagacg aaggcagcgt tcagaatgct aaatggccgt tcgcgctgag ccacaaccgc 420

ctgcaaacgg gcggatgggc acgtcagcag aacatcgatg tgatgccgat cgcgaaatct 480

atggctggcg ttaacatgcg tcttgaagcg ggcgcgattc gtgaacttca ctggcacaaa 540

acagctgaat ggtcttatgt tacaaaaggc tctgttcagg tgtcttctat caactctgac 600

ggccaaaact accttgctac ggcgagcgcg ggcgacctct ggtacttccc gccgggcgtg 660

ccgcattctc ttcaggcgac agctgatgac ccggacggca cggaattcct gctggtcttc 720

gacgacggcg cgttcagcga agactcaaca ttcctgctta cggattggct tgcacacgtc 780

ccgaaagaag tgcttgcgaa aaacttcaaa acaaatatct ctgcattcga ccacatcccg 840

gcgaaacagc tttacatctt cccgtctgcg ccgccgccgg acaacgctca ggctccgtct 900

gacccgcagg gtcagatccc gagcccgttc gtgttccacc tgtctcaggt gaaagcgacg 960

gatctggacg gcggctctgt caaagtcgtc gactctacaa cattcccggt tgctcaggcg 1020

atcgctgtcg ctgaagtcac agtcgagccg ggagcgatgc gtgagcttca ctggcacccg 1080

acacaggacg agtggacata ctaccttgag ggccagggcc gcgtgacgct tttcgcatct 1140

agcagcaacg cgcgcacgtt caactacgag gcgggagacg tcggcttcgt gccggcttct 1200

ttcggacact acgtcgaaaa cacgggcaac acaacgcttc gcttccttga aatcttcaac 1260

acgaaccgct tcgaagacat ttctctcagc cagtggcttg cgcttacgcc gccggctctg 1320

gttaaagcgc acctggacct tgacgacgaa acgatcgcta acctgagcaa aacaaaactg 1380

acagtcgtcg gcccggctta a 1401

<210> 4

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcaccggcga gcaacccgtc tgcagcgaca tcttctacag ctctggcatc tccggtatct 60

gtatctaact ctacggattc tacagcgtct gtctctggac cgccgtctgc gacgtctgac 120

gcgtcagcag ctagcccgag cccgacggtt ccgtttgcgt ctgacgaccc gaacacagtc 180

atcttctctc cgggcgcaga cgtccagccg gaagctcaac gtggcacact tggcagcaca 240

gttatcggac cgcagaatgt gcaaatcgat cgtcaaaatc cggacttcct ggcaccgccg 300

acaacggaca atggagacgt gtctaatgcg aaatggccgt ttggactgag ccacaatcgt 360

atccagacag gaggctgggc acgtcagcaa aacatcgaga atatgccgat tgctacgcag 420

atggctggag ttgacatgcg tcttgaaccg ggcgctgttc gtgagcttca ttggcacaaa 480

acgtctgaat ggtcttatgt catcaaaggc tctacgcaag ttacggctgt tgatcaagac 540

ggcaaaaact atctggctac agtgaacgca ggtgaccttt ggtacttccc gccgggcatt 600

ccgcactctc ttcaagcgac gaatgactct gcagagggca cagagttcct gctggtcttc 660

gacgatggag cttttagcga agacgctaca tttctgctga cagattggct tgcgcatgtc 720

ccgaaagagg tcatcgctaa aaacttccag acagacattt ctgcgtttga tgatatcccg 780

ggacgtgagc tttacatttt cccggctgcg gttccgtctt ctgatgctac agctgtctca 840

gatccgcaag gccaggttcc gaatgctttc tctttcgcta tgtctaaaat caatgctaca 900

caattatcag gtggaacagt taaaattgtg gattcgacga cattcccgat ctcaacgaca 960

atcgctgctg cggacgtcac ggttgaaccg ggagctatgc gtgagttaca ctggcatccg 1020

acacaggatg aatggacgta tttcattgaa ggcgatgctc gcatgacaat ctttgcatca 1080

caaagcaacg cacgtacatt tgattatcaa gctggcgata ttggatatgt tccggcatct 1140

ttcggccatt atgtcgagaa tattggaaat acgacactgc actaccttga gatcttcaaa 1200

acggatcgtt tccaggatgt cagcctgagc cagtggcttg ctcttacacc gccggagctt 1260

gtcaaagctc atcttggcct ttctgatgct acgattgcaa cgctgaaaaa aacgaaacaa 1320

acggttgttg gaccgtctta a 1341

<210> 5

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gctccggcag ctacgtcttc tgacgcgtct ctgtctatct ctgtcgaatc ttcttctacg 60

gaaacagctt ctgcgtctgc tgctgcagaa tctccgtcta caacagtgtc tctggcaccg 120

acggctccga atggcccgct gtacacgccg ggcgcagaca tccaaccgga accgatccgt 180

ggaacgcttg gaggcacgat cctgggcccg cagaacattg ctatcgacca gcagaatccg 240

gacatgcttg cgccgccgac gacagatcat ggcgacgtgc cgaacgctaa atggccgttt 300

tctctgtctc acaatcgtct gcaaacagga ggatgggctc gtcagcagaa cattgaagta 360

atgccgatcg caacacagat ggctggcgtg gatatgcgtc tggaaccggg cgcaattcgt 420

gaactgcact ggcacacaag ctctgaatgg gcttatgtcc tgaaaggatc tacacaagtc 480

acagcggtag atcaaaatgg caaaaacttt ctggctacgg tggaaccggg agacctgtgg 540

tacttcccgc cgggtatccc gcactctctg caggctacga acgagtctac agaaggcagc 600

gagtttctgc tggtattcga tgatggtgct ttctctgaag acgacacatt tttactgaca 660

gactggttag ctcatgtccc gaaagaggtc atcgctaaaa actttcagct ggatatttct 720

gacttcaatt ctctgccggg cgaagaactg tacatcttcc cggcagaacc gccgtctccg 780

gatgcagtag cgccgtctga cccgctgggc caagtaccgc aagctttttc tttcgctatg 840

tctaaaatga atgctacgca gctgagcgga ggcacagtca aaatcgtgga ctctacagtc 900

ttctctgttt caacgacaat tgctgctgcg gatgttacag tcgaaccggg cgctatgcgt 960

gaactgcact ggcacccgac gcaggacgaa tggtcattct tcatcgaagg cacaggacgt 1020

atgacaatct tcgcatctga cagcaacgct caaacattcg actacgaagc tggcgatatt 1080

ggctacgtgc cggctacata tggccactac gtggaaaacg tcggcaacac gacgctgcat 1140

tatctggaaa tcttcaaaac ggatcgcttc caggacgttt ctctggctca gtggctggca 1200

ctgacaccgc cggctctggt caaagctcac ctgggcctgt ctgacgaagt catcgcgcag 1260

ttcaacaaaa caaaacaggt cgtcgtcggc ccgcgccact aa 1302

<210> 6

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

agcttgacca cttcattttt caatcgaagt tgacttttca ctggtttttt tcacttaaca 60

aaacagaagg gaaaacgaaa ggcctttcac cttctctttc tgctatcaca tttaaatgta 120

aggaggaaac atttc 135

<210> 7

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60

tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcc 93

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tgaattcgag cactagtgca gcccgcctaa tgagcgggct ttttt 45

<210> 9

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atcatgcaag caatgatttt tcaatcgaag ttgactttca ctggtttggt ttcacttaac 60

aaatcaaaat ttttaaaaat cgaaatctct ttcaccttgt ctttgtgcta ttacatttaa 120

atgtaaggag gaaacatctt 140

<210> 10

<211> 470

<212> PRT

<213> 真姬菇(Hypsizygus marmoreus) OXDC 蛋白序列去信号肽部分

<400> 10

Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ala Pro Thr Val Ser Thr Val

1 5 10 15

Ser Ser Val Ile Ala Pro Ile Ser Pro Thr Ala Glu Ser Ser Val Ala

20 25 30

Ala Ser Ser Ala Ser Asn Lys Pro Arg Pro Thr Ser Thr Ala Thr Ala

35 40 45

Thr Glu Pro Thr Ala Thr Val Pro Phe Ile Asp Leu Asp Pro Asn Glu

50 55 60

Pro Leu Trp Asn Glu Asp Thr Pro Gly Ile His Gln Pro Ile His Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Ala Lys Leu Leu Gly Pro Thr Asn Asn Ala Ile Val Lys

85 90 95

Gln Asn Pro Asp Leu Leu Ala Pro Pro Thr Thr Asp His Gly Ser Val

100 105 110

Pro Asn Ala Lys Trp Pro Phe Ser Leu Ser His Asn Arg Leu Gln Thr

115 120 125

Gly Gly Trp Ala Arg Glu Glu Asn Ile Ala Val Met Pro Val Ala Gln

130 135 140

Ala Met Ala Ser Val Asn Met Arg Leu Glu Ala Gly Ala Val Arg Glu

145 150 155 160

Leu His Trp His Lys Thr Ala Glu Trp Ala Tyr Val Leu Lys Gly Ser

165 170 175

Thr Gln Val Thr Ala Val Asp Ala Asp Gly Arg Asn Phe Val Ser Thr

180 185 190

Val Gly Pro Gly Asp Leu Trp Tyr Phe Pro Pro Gly Ile Pro His Ser

195 200 205

Leu Gln Ala Thr Asn Asp Asp Pro Asp Gly Ser Glu Phe Val Leu Val

210 215 220

Phe Asp Ser Gly Ser Phe Ser Glu Asp Ser Thr Phe Leu Leu Thr Asp

225 230 235 240

Trp Leu Asp His Val Pro Ala Glu Gly Thr Trp Ser Ile Pro Ile Thr

245 250 255

Leu Val Ser Leu Asn Ser Gly His Phe Gln Tyr Trp Pro Lys Ile Ser

260 265 270

Lys Cys Arg Asn Ile Ser Ala Phe Ala His Ile Pro Ala Glu Glu Leu

275 280 285

Tyr Ile Phe Pro Ala Ala Leu Pro Glu Pro Asp Ser Ala Ala Pro Lys

290 295 300

Ser Pro Gln Gly Thr Val Pro Asp Pro Phe Ser Phe Ser Met Ser Lys

305 310 315 320

Val Lys Pro Thr Gln Leu Thr Gly Gly Thr Val Lys Val Val Asp Ser

325 330 335

Thr Thr Phe Lys Ile Ser Lys Thr Ile Ala Ala Ala Glu Val Thr Val

340 345 350

Glu Pro Gly Ala Ile Arg Glu Leu His Trp His Pro Thr Gln Asp Glu

355 360 365

Trp Ser Phe Phe Ile Glu Gly Glu Gly Arg Met Thr Ile Phe Ala Ser

370 375 380

Gln Ser Asn Ala Arg Thr Phe Asn Tyr Gln Ala Gly Asp Ile Ala Lys

385 390 395 400

Thr Asn Arg Ser Thr Gly His Tyr Leu Glu Asn Thr Gly Asn Thr Thr

405 410 415

Leu Arg Phe Leu Glu Ile Phe Lys Ser Glu Lys Phe Gln Asp Ile Ser

420 425 430

Leu Ala Gln Trp Leu Ala Leu Thr Pro Pro Lys Leu Val Lys Glu His

435 440 445

Leu Gly Phe Ser Asp Asp Val Ile Ala Arg Leu Ser Lys Thr Lys Leu

450 455 460

Thr Val Val Gly Pro Lys

465 470

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gcaccggcac ctgcagcatc atct 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ttacttcgga ccaaccaccg tcag 24

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

agcttgacca cttcattttt c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gaaatgtttc ctccttacat 20

<210> 15

<211> 31

<212> PRT

<213> α-淀粉酶信号肽

<400> 15

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala

20 25 30

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

atgattcaaa aacgaaagcg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ggctgatgtt tttgtaatcg 20

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tgagcgggct tttttacgga tccccgggaa ttcct 35

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

cgacctgcag atctctagaa g 21

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gagatctgca ggtcgagctt gaccacttca tttttc 36

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

aaaaaagccc gctcattagg c 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

atgattcaaa aacgaaagcg 20

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gagatctgca ggtcgatcat gcaagcaatg atttttc 37

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

tcgtttttga atcataagat gtttcctcct tacat 35

Claims

1.一种高效生产真菌来源的重组草酸脱羧酶表达载体，其特征在于，包括含有酸诱导启动子、分泌信号肽、去原始信号肽的草酸脱羧酶基因和trpA终止子的表达质粒，其中，所述酸诱导启动子是在指pH值为1.5～4.5的条件下，能在芽胞杆菌中启动基因表达的启动子，所述分泌信号肽是指在芽胞杆菌中能促进真菌来源的草酸脱羧酶基因分泌表达信号肽序列。

2.如权利要求1所述的重组草酸脱羧酶表达载体，其特征在于，所述酸诱导启动子自枯草芽胞杆菌Bs168菌株的酸诱导启动子，所述分泌信号肽来源于解淀粉芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyQ或碱性蛋白酶、枯草芽胞杆菌碱性的蛋白酶aprE或α-淀粉酶amyE、地衣芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyL或碱性蛋白酶、嗜热脂肪地芽胞杆菌的α-淀粉酶AmyS或碱性蛋白酶。

3.如权利要求1所述所述的重组草酸脱羧酶表达载体，其特征在于，所述去原始信号肽的草酸脱羧酶基因如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5任一所述的序列。

4.如权利要求1所述所述的重组草酸脱羧酶表达载体，其特征在于，所述酸诱导启动子的序列如SEQ ID NO.6所示，所述分泌信号肽的序列如SEQ ID NO.7所示，所述去原始信号肽的草酸脱羧酶基因的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5任一所述的序列，所述trpA终止子的序列如SEQ ID NO.8所示。

5.如权利要求4所述所述的重组草酸脱羧酶表达载体，其特征在于，酸诱导启动子为发生突变的酸诱导启动子，其序列如SEQ ID NO.9所示。

6.一种草酸脱羧酶的制备方法，其特征在于，将如权利要求1-6任一所述的重组草酸脱羧酶表达载体转化到pH≤4.5下正常生长的耐酸性的芽胞杆菌中，制备草酸脱羧酶重组菌，在发酵培养基中培养该重组菌，并补加酸至pH值为3.0～4.5进行草酸脱羧酶的诱导表达。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述耐酸性的芽胞杆菌为环状芽胞杆菌、嗜热脂肪地芽胞杆菌或解淀粉芽胞杆菌。

8.如权利要求6所述所述的制备方法，其特征在于，所述补加酸时所用的酸为盐酸、磷酸、硫酸、草酸/草酸盐、乙酸、丙二酸、丁二酸、柠檬酸或植酸。

9.如权利要求6所述所述的制备方法，其特征在于，培养重组菌至OD600达到0.8～3.0后，再补加酸，诱导表达结束后通过离心收集上清，调节该上清的pH值和硫酸铵沉淀实现重组草酸脱羧酶的初步纯化。

10.如权利要求6-9任一所述的制备方法制备的草酸脱羧酶在诊断试剂、药物组合物和食品制品中的应用。