CN113717915B

CN113717915B - 表面表达acc脱氨酶的水稻黄单胞菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN113717915B
Application number: CN202111141629.4A
Authority: CN
Inventors: 张莉莉; 杨杰; 赵璟; 陈丽莹
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2041-09-28
Also published as: CN113717915A

Abstract

本发明公开了重组水稻黄单胞菌及其构建方法与应用。本发明的重组水稻黄单胞菌的构建方法，包括将融合蛋白的编码基因导入受体水稻黄单胞菌，得到重组水稻黄单胞菌，所述融合蛋白是由细胞外膜表面展示所用的锚定蛋白与所述ACC脱氨酶融合而成的蛋白质。实验证明，本发明所构建的重组水稻黄单胞菌在保持了水稻黄单胞菌生理特性的基础上同时提高了ACC脱氨酶的活性，适用于接种植物来增加植物产量，有望进一步推广应用和产业开发。

Description

表面表达ACC脱氨酶的水稻黄单胞菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域中表面表达ACC脱氨酶的水稻黄单胞菌及其构建方法与应用。

背景技术

工程菌株可用于昆虫、动物、植物发挥人工设计的功能。例如：通过基因工程改造的沙雷氏菌SerratiaAS1在按蚊肠道定殖后发挥抗疟原虫感染的功能、大肠杆菌作为指示剂排入粪便中以指示特定的肠道病原体感染，将拮抗菌施加到土壤或喷洒至植物对相应的病原菌进行拮抗。

ACC脱氨酶，其编码基因为acdS，其在根瘤菌和多种根际细菌及真菌中被广泛发现，通过降解乙烯的前体ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)，降低植物的乙烯水平，进而促进植物生长。目前将ACC脱氨酶通过基因工程改造得到工程菌，用以促进植物生长的技术还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是如何以工程菌促进植物生长。

为了解决以上技术问题，本发明提供了表面表达ACC脱氨酶的水稻黄单胞菌及其构建方法。本发明所提供的构建重组水稻黄单胞菌的方法，包括将融合蛋白的编码基因导入受体水稻黄单胞菌，得到重组水稻黄单胞菌，所述融合蛋白是由细胞外膜表面展示所用的锚定蛋白与所述ACC脱氨酶融合而成的蛋白质。

上述方法中，所述ACC脱氨酶可为X1或X2的蛋白质：

X1、氨基酸序列是序列表中序列2第214-551位的氨基酸；

X2、将序列表中序列2第214-551位所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个以上氨基酸残基得到的与X1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有ACC脱氨酶活性的蛋白质；

X3、在X1或X2所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白和/或SUMO标签蛋白等。

上述方法中，所述融合蛋白的编码基因含有所述ACC脱氨酶的编码基因，所述ACC脱氨酶的编码基因可为x1-x4中的任一种DNA分子：

x1)其编码序列(CDS)是序列表中序列1第640-1656位的cDNA分子或基因组DNA；

x2)在严格条件下与x1)限定的DNA分子杂交且编码所述ACC脱氨酶的cDNA分子或基因组DNA；

x3)与x1)或x2)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码所述ACC脱氨酶的cDNA分子或基因组DNA。

上述方法中，所述锚定蛋白可为Inak-N蛋白。所述Inak-N蛋白可为Y1或Y2的蛋白质：

Y1、由序列表中序列2第1-211位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

Y2、在序列表中序列2第1-211位所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的细胞外膜表明展示特性的由Y1)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述融合蛋白的编码基因含有所述锚定蛋白的编码基因，所述锚定蛋白的编码基因可为y1-y4中的任一种DNA分子：

y1)其编码序列(CDS)是序列表中序列1第1-633位的cDNA分子或基因组DNA；

y2)在严格条件下与y1)限定的DNA分子杂交且编码所述细胞外膜表明表现的锚定蛋白的cDNA分子或基因组DNA；

y3)与y1)或y2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述细胞外膜表明表现的锚定蛋白的cDNA分子或基因组DNA。

上述方法中，所述融合蛋白具体可为A1或A2的蛋白质：

A1、由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2、在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有ACC脱氨酶活性和细胞外膜表明展示活性的由A1)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述融合蛋白的编码基因可为a1-a3中的任一种DNA分子：

a1)核苷酸序列为序列表中序列1的cDNA分子或基因组DNA；

a2)在严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA；

a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA。

上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述方法中，所述重组水稻黄单胞菌具有下述特性：所述重组水稻黄单胞菌的细胞外膜表面表达所述ACC脱氨酶。

上述方法中，所述编码细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的基因通过含有编码细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的基因表达盒的重组表达载体导入所述受体菌中。所述编码细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的基因表达盒中，可含有所述编码细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的基因和启动所述编码细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的基因转录的启动子。所述表达盒还可包括终止所述编码细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的基因转录的终止子。进一步，所述编码细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的基因表达盒还可包括增强子序列。

在本发明的一个实施方式中，所述含有编码细胞外膜表明展示的锚定蛋白与ACC脱氨酶的融合蛋白的基因表达盒的重组表达载体是将pHM1载体的HindⅢ和EcoRⅠ识别位点间的片段替换为序列表序列1所示的DNA片段得到的重组载体pHM1-inaK-N-acdS。

上述方法中，所述编码ACC脱氨酶的基因通过含有编码ACC脱氨酶的基因的重组表达载体导入所述受体菌中。

上述方法中，所述受体水稻黄单胞菌为水稻黄单胞菌菌株PXO99。

上述方法制备的重组水稻黄单胞菌也是本发明的保护范围。

在本发明的具体实施方式中，上述方法制备的重组水稻黄单胞菌具体为将pHM1-inaK-N-acdS导入所述水稻黄单胞菌菌株PXO99得到的重组水稻黄单胞菌PXO99-pHM1-inaK-N-acdS。

上述方法或上述方法制备的重组水稻黄单胞菌的应用也属于本发明的保护范围。所述应用为上述方法或上述方法制备的重组水稻黄单胞菌在U1-U7任一种或多种中的应用：

U1、促进ACC降解；

U2、降低植物的乙烯含量；

U3、促进植物生长；

U4、提供植物株高；

U5、增加植物根长；

U6、增加植物叶鲜重；

U7、增加植物根鲜重。

上述应用中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为水稻，如抗水稻黄单胞菌的水稻。

实验证明，本发明构建的重组菌在保持了水稻黄单胞菌生理特性的基础上同时提高了ACC脱氨酶的活性，适用于接种植物来增加植物产量，有望进一步推广应用和产业开发。

附图说明

图1为pHM1载体和pGH-inaK-N-acdS载体的双酶切产物电泳图。其中，泳道M：1kbmaker；泳道1：pHM1质粒；泳道2：双酶切后的pHM1，长度大约12kb；泳道3：双酶切后的pGH-inaK-N-acdS，其中inaK-N-acdS长度大约1668bp。

图2为PXO99-pHM1-inaK-N-acdS菌株ACC脱氨酶活性测定结果图。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，以t-test分析各组显著性差异，**代表显著性分析结果为P<0.01，。

图3为不同时期接种PXO99-pHM1-inaK-N-acdS或PXO99-pHM1植株的生物量统计。其中，图3的a图为株高统计图，图3的b图为根长统计图，图3的c图为叶鲜重统计图，图3的d图为根鲜重统计图。每个点或正方形表示1株植物，平均值和标准偏差由3次独立的接菌实验(每次3株植物)计算获得。以t-test分析各组显著性差异，*代表显著性分析结果为P＜0.05，**代表显著性分析结果为P<0.01，***代表显著性分析结果为P<0.001，****代表显著性分析结果为P<0.0001。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pGH载体是上海捷瑞生物工程有限公司公司产品。

下述实施例中的pHM1载体记载于非专利文献“Deng,CY.,Zhang,H.,Wu,Y.etal.Proteolysis of histidine kinase VgrS inhibits its autophosphorylation andpromotes osmostress resistance in Xanthomonas campestris.Nat Commun 9,4791(2018).https://doi.org/10.1038/s41467-018-07228-4”，公众可以从中国科学院微生物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的水稻抗水稻黄单胞菌(Xoo)的抗性植株Xa21记载于非专利文献“Chen X,Zuo S,Schwessinger B,et al.An XA21-associated kinase(OsSERK2)regulates immunity mediated by the XA21 and XA3 immune receptors.Mol Plant.2014；7(5):874-892.doi:10.1093/mp/ssu003”，公众可以从中国科学院微生物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的水稻黄单胞菌PXO99感受态的制备方法如下：

(1)从PSA平板中挑取水稻黄单胞菌PXO99一个单菌落，转到500mlPSA液体培养基的三角瓶中，28℃220rpm培养至OD₆₀₀＝0.6；

(2)将水稻黄单胞菌PXO99转到冰上放置30min，使培养物充分冷却。将离心管置于冰上冷却为获得最大转化效率，整个操作过程中细菌温度不超过4℃；

(3)将水稻黄单胞菌PXO99转移至冰冷的离心管中，4℃5000rpm离心5min,以回收水稻黄单胞菌PXO99；

(4)倒掉上清，在管中分别加入少量预先冷却的10％甘油，重悬菌体，加入大于40ml的10％甘油溶液，4℃5000rpm离心5min；

(5)倒掉上清，重复步骤(4)，至少洗4次，目的将离子洗净，加入1ml10％甘油重悬细胞；

(6)将菌液分装，每管50ul，立即放入液氮中，保存于-80℃。

下述实施例中所用PSA固体培养基的配制方法为：胰蛋白胨(Trytone)10g，蔗糖(Sucrose)10g，谷氨酸(Glutamic acid)1g，琼脂(Agar)15g溶解于蒸馏水中，定容至1L。

下述实施例中所用DF液体培养基的配制方法为：KH₂PO₄4g，Na₂HPO₄6g，MgSO₄·7H₂O0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸钠2g，柠檬酸2g，(NH₄)₂SO₄2g，组分一溶液0.1mL，组分二溶液0.1mL，溶解于蒸馏水中，定容至1L，调节其pH值至7.0。其中，组分一溶液的配制方法为：H₃BO₃ 10mg，MnSO₄·H₂O 11.19mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6mg，CuSO₄·5H₂O 78.22mg，MoO₃ 10mg，溶于100mL灭菌蒸馏水。组分二溶液的配制方法为：FeSO₄·7H₂O 100mg溶于10mL灭菌蒸馏水。

下述实施例中所用不含(NH₄)₂SO₄的DF液体培养基的配制方法为：KH₂PO₄ 4g，Na₂HPO₄ 6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸钠2g，柠檬酸2g，组分一溶液0.1mL，组分二溶液0.1mL，溶解于蒸馏水中，定容至1L，调节其pH值至7.0。其中，组分一溶液的配制方法为：H₃BO₃ 10mg，MnSO₄·H₂O 11.19mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6mg，CuSO₄·5H₂O 78.22mg，MoO₃10mg，溶于100mL灭菌蒸馏水。组分二溶液的配制方法为：FeSO₄·7H₂O 100mg溶于10mL灭菌蒸馏水。

实施例1

ACC脱氨酶，其编码基因为acdS，其在根瘤菌和多种根际细菌及真菌中被广泛发现，通过降解乙烯的前体ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)，降低植物的乙烯水平，进而促进植物生长。

InaK-N是一种从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)中分离得到的冰核蛋白(ice nucleation protein,Inak)N端的211个氨基酸，可以作为锚定基序，与其他蛋白融合并将融合蛋白表达在细胞外膜。其编码基因为inaK-N基因。

本发明将丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)inaK-N基因与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)acdS基因融合，使目标产物ACC脱氨酶通过Inak-N的引导定位于水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)菌株PXO99的外膜。获得的基因工程菌接种至水稻抗Xoo的抗性植株Xa21，通过Xoo的增殖在细胞表面高效表达ACC脱氨酶，从而降低水稻的乙烯水平，促进Xa21植株的生长和发育。

具体方法如下：

1、序列来源

在GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中得到丁香假单胞菌inaK-N基因序列(Accession No:AF013159,5’端1-633bp)和荧光假单胞菌acdS基因序列(Accession No:JQ646055,全长1-1017bp)。

2、融合蛋白表达载体的构建

本实施例构建的融合蛋白表达载体名称为pHM1-inaK-N-acdS，该载体中含有名称为inaK-N-acdS的融合蛋白Inak-N+ACC脱氨酶的编码基因，该inaK-N-acdS编码链的核苷酸序列见序列表的序列1(其中，第1-633位为Inak-N的编码序列(CDS)，第640-1656位为ACC脱氨酶的编码序列(CDS))，其编码的融合蛋白名称为Inak-N+ACC脱氨酶，氨基酸序列见序列表的序列2(其中，第1-211位为Inak-N蛋白序列，第214-551位为ACC脱氨酶蛋白序列)，设计的细胞外膜表面展示所用的锚定蛋白是丁香假单胞菌的Inak-N，脱氨酶ACC串连在其N端。

具体构建方法如下：

2.1构建克隆载体pGH-inaK-N-acdS

合成名称为inaK-N-acdS的DNA分子(核苷酸序列为序列表的序列1)，并用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切；用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pGH载体。将上述两者连接，得到如下重组载体：用inaK-N+acdS(核苷酸序列为序列表的序列1)替换pGH载体的限制性核酸内切酶HindⅢ和EcoRⅠ识别位点间的片段(包括HindⅢ识别位点和EcoRⅠ识别位点在内的小片段)，保持pGH载体的其它序列不变，得到的重组载体，命名为pGH-inaK-N-acdS。

2.2构建表达载体pHM1-inaK-N-acdS

用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ对克隆载体pHM1-inaK-N-acdS和表达载体pHM1分别进行双酶切(见图1)，凝胶电泳回收inaK-N-acdS基因片段和线性化的pHM1载体，以T4DNA连接酶16℃过夜连接。得到如下重组载体：用inaK-N-acdS(核苷酸序列为序列表的序列1)替换pHM1载体的限制性核酸内切酶HindⅢ和EcoRⅠ识别位点间的片段(包括HindⅢ识别位点和EcoRⅠ识别位点在内的小片段)，保持pHM1载体的其它序列不变，得到表达融合蛋白Inak-N+ACC脱氨酶(氨基酸序列见序列2)的重组表达载体，命名为pHM1-inaK-N-acdS。

3、重组菌PXO99-pHM1-inaK-N-acdS的获得

pHM1-inaK-N-acdS转化水稻黄单胞菌PXO99感受态，以含有100μg/mL壮观霉素的PSA固体培养基筛选阳性转化子，得到水稻黄单胞菌重组株，命名为PXO99-pHM1-inaK-N-acdS。水稻黄单胞菌PXO99-pHM1-inaK-N-acdS是将氨基酸序列是序列2的Inak-N+ACC脱氨酶的融合蛋白的编码基因(核苷酸序列是序列表的序列1)导入水稻黄单胞菌野生株PXO99得到的重组水稻黄单胞菌。

以空载体pHM1转化水稻黄单胞菌PXO99感受态得到的水稻黄单胞菌重组株PXO99-pHM1作为对照。

4、工程菌PXO99-pHM1-inaK-N-acdS表达ACC脱氨酶水平测定

4.1培养和收集菌体

挑取PXO99-pHM1-inaK-N-acdS的单克隆菌株，对照为PXO99-pHM1的单克隆菌株，各自于20mL PSA培养基中，28℃培养24h-48h，于4℃以8000rpm/min离心10min收集菌体；

用5mL不含(NH₄)₂SO₄的DF液体培养基洗涤菌体2次，每次洗涤后将菌悬液离心弃去上清液，2次洗涤后的菌体重悬于7.5mL不含(NH₄)₂SO₄的DF液体培养基中；

加入45μL经过滤除菌的0.5mol/L ACC水溶液，28℃培养24h，诱导产生ACC脱氨酶，于4℃以8000rpm/min离心10min收集菌体；

用5mL 0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)洗涤菌体2次，离心收集菌体用于进一步的酶活测定。

4.2酶活测定

将上述4.1获得的PXO99-pHM1-inaK-N-acdS或PXO99-pHM1菌株分别重悬于600μL0.1mol·L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中；

上述每种600μL菌悬液进行两组不同的处理，处理一为：在600μL菌悬液中加入30μL甲苯，迅速振荡30s破碎细胞；处理二为：不加甲苯；每个菌株制备得到两种粗酶液；

分装100μL粗酶液用于测定蛋白浓度，剩下约500μL粗酶液用于ACC脱氨酶活性测定；

将粗酶液按200μL分装两组，组一加入20μL 0.5mol·L^-1ACC水溶液混匀，组二不加ACC。置于30℃水浴反应15min；

加入1mL 0.56mol·L^-1 HCl终止反应，12000rpm/min离心5min，取上清1mL，加入800μL 0.56mol·L^-1 HCl和300μL 0.2％2,4-二硝基苯肼溶液(2mol·L^-1HCl中溶解)，30℃保温30min；

加入2mL 2mol·L^-1NaOH混匀，显色反应5min，540nm测吸光度值。

用试剂和ACC的吸光度值减去不含ACC的试剂混合物的吸光度值，计算ACC脱氨酶催化产生的α-酮丁酸的量。

对照α-酮丁酸标准曲线和牛血清白蛋白标准曲线计算菌株的酶活性。ACC脱氨酶活性的表示方法为：上述反应条件下，每毫克菌体蛋白每小时催化ACC脱氨形成α-酮丁酸的微摩尔数，单位是(μmolα-酮丁酸/h·mg蛋白)。其中，粗酶液蛋白含量测定方法如下：取100μL粗酶液，加入5ml考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3min，测定595nm处的吸光值A₅₉₅，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。实验重复三次。

上述方法测得PXO99-pHM1-inaK-N-acdS菌株ACC脱氨酶活性(见图2)无甲苯实验组为9.992μmolα-酮丁酸/h·mg蛋白，加甲苯实验组为14.538μmolα-酮丁酸/h·mg蛋白。

5、工程菌促进水稻生长发育的表型测定

5.1剪叶法接菌

将水稻抗水稻黄单胞菌(Xoo)的抗性植株Xa21在温室种植，种植后的第6周，通过剪叶法接种PXO99-pHM1-inaK-N-acdS，以接种PXO99-pHM1作为对照：

PXO99-pHM1-inaK-N-acdS和PXO99-pHM1这两种Xoo菌株均从-80℃接种至PSA固体培养基进行活化，分别在PSA液体培养基中培养过夜得到培养液，将培养液用无菌水1/100稀释至OD_600nm＝0.8得到菌液。用无菌剪刀蘸取菌液剪切水稻叶顶端的5-10cm的位置，每株水稻植株剪切3片叶子，完成接菌实验。

5.2促生表型测定

在接菌后的第10天、第15天、第20天和第30天分别取3株水稻样本进行生物量检测。量取水稻植株地上部分的株高和地下部分的根长，称取水稻地上部分的重量和洗净后的水稻根重。

结果表明：PXO99-pHM1-inaK-N-acdS接种的水稻植株与对照组PXO99-pHM1接种的植株相比，PXO99-pHM1-inaK-N-acdS表达的ACC脱氨酶显著增加了水稻的株高(图3的a图，接菌后第10天和第15天)和根长(图3的b图，接菌后的第10天至第30天)；显著增加了地上部分的叶鲜重(图3的c图，接菌后的第10天至第30天)和地下部分的根鲜重(图3的d图，接菌后的第10天至第30天)。

说明接种工程菌PXO99-pHM1-inaK-N-acdS水稻植株的促生长效果好。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 表面表达ACC脱氨酶的水稻黄单胞菌及其构建方法与应用

<130> GNCSY212621

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactctcg acaaggcgtt ggtgctgcgt acctgtgcaa ataacatggc cgatcactgc 60

ggccttatat ggcccgcgtc cggcacggtg gaatccagat actggcagtc aaccaggcgg 120

catgagaatg gtctggtcgg tttactgtgg ggcgctggaa ccagcgcttt tctaagcgtg 180

catgccgatg ctcgatggat tgtctgtgaa gttgccgttg cagacatcat cagtctggaa 240

gagccgggaa tggtcaagtt tccgcgggcc gaggtggttc atgtcggcga caggatcagc 300

gcgtcacact tcatttcggc acgtcaggcc gaccctgcgt caacgtcaac gtcaacgtca 360

acgtcaacgt taacgccaat gcctacggcc atacccacgc ccatgcctgc ggtagcaagt 420

gtcacgttac cggtggccga acaggcccgt catgaagtgt tcgatgtcgc gtcggtcagc 480

gcggctgccg ccccagtaaa caccctgccg gtgacgacgc cgcagaattt gcagaccgcc 540

acttacggca gcacgttgag tggcgacaat cacagtcgtc tgattgccgg ttatggcagt 600

aacgagaccg ctggcaacca cagtgatcta attgagctca tgaacctgaa tcgttttgaa 660

cgttatccgc tgaccttcgg tccttctccc atcacgccct tgaaacgcct cagcgaacac 720

ctgggcggca aggtcgagct gtatgccaaa cgcgaagact gcaacagtgg cctggccttt 780

ggcggcaaca agacgcgcaa gctcgaatac ctgattcctg aagccatcga gcagggctgc 840

gacaccctgg tgtccatcgg cgggatccag tcgaaccaga cccgccaagt cgctgccgtc 900

gccgcccacc tgggcatgaa gtgtgtgctg gtccaggaaa actgggtgaa ctactccgac 960

gccgtgtatg accgggtcgg caatatcgaa atgtctcgca tcatgggcgc cgacgtacga 1020

ctggacgccg ccgggttcga catcggcatt cggcccagct gggagaaggc catgagcgac 1080

gtggtggagc ggggcggcaa gccgttcccg attccggcgg gttgttccga gcatccttat 1140

ggcggcctcg gcttcgtcgg tttcgccgag gaagtccggc agcaggaaca ggcactgggc 1200

ttcaaattcg actacatcgt cgtgtgctcc gtgaccggca gtacccaggc gggcatggtt 1260

gtcggtttcg ccgccgacgg ccgttcgaaa aacgtcatcg gtatcgacgc ttcggccaaa 1320

ccggaaaaga ccagggcgca gatcctgcgt atcgcccggc acaccgctga actggtggag 1380

ctgggtcgcg aaatcaccga agaggatgtg gtgctcgaca cgcgcttcgc ctatccggaa 1440

tacggtttgc cgaacgatgg cacgctggaa gccattcgtc tgtgcgggcg tcttgaaggc 1500

gtgctgactg acccggtgta tgagggcaaa tccatgcacg ggatgattga aatggtccgc 1560

cgtggcgaat tccctgaagg ctcgaaagtg ctgtacgcgc acctgggcgg ggtaccggcg 1620

ctgaatgcct acagcttctt gtttcgcaac ggctga 1656

<210> 2

<211> 551

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Leu Asp Lys Ala Leu Val Leu Arg Thr Cys Ala Asn Asn Met

1 5 10 15

Ala Asp His Cys Gly Leu Ile Trp Pro Ala Ser Gly Thr Val Glu Ser

20 25 30

Arg Tyr Trp Gln Ser Thr Arg Arg His Glu Asn Gly Leu Val Gly Leu

35 40 45

Leu Trp Gly Ala Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ser Val His Ala Asp Ala

50 55 60

Arg Trp Ile Val Cys Glu Val Ala Val Ala Asp Ile Ile Ser Leu Glu

65 70 75 80

Glu Pro Gly Met Val Lys Phe Pro Arg Ala Glu Val Val His Val Gly

85 90 95

Asp Arg Ile Ser Ala Ser His Phe Ile Ser Ala Arg Gln Ala Asp Pro

100 105 110

Ala Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Met Pro

115 120 125

Thr Ala Ile Pro Thr Pro Met Pro Ala Val Ala Ser Val Thr Leu Pro

130 135 140

Val Ala Glu Gln Ala Arg His Glu Val Phe Asp Val Ala Ser Val Ser

145 150 155 160

Ala Ala Ala Ala Pro Val Asn Thr Leu Pro Val Thr Thr Pro Gln Asn

165 170 175

Leu Gln Thr Ala Thr Tyr Gly Ser Thr Leu Ser Gly Asp Asn His Ser

180 185 190

Arg Leu Ile Ala Gly Tyr Gly Ser Asn Glu Thr Ala Gly Asn His Ser

195 200 205

Asp Leu Ile Glu Leu Met Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Tyr Pro Leu

210 215 220

Thr Phe Gly Pro Ser Pro Ile Thr Pro Leu Lys Arg Leu Ser Glu His

225 230 235 240

Leu Gly Gly Lys Val Glu Leu Tyr Ala Lys Arg Glu Asp Cys Asn Ser

245 250 255

Gly Leu Ala Phe Gly Gly Asn Lys Thr Arg Lys Leu Glu Tyr Leu Ile

260 265 270

Pro Glu Ala Ile Glu Gln Gly Cys Asp Thr Leu Val Ser Ile Gly Gly

275 280 285

Ile Gln Ser Asn Gln Thr Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Ala His Leu

290 295 300

Gly Met Lys Cys Val Leu Val Gln Glu Asn Trp Val Asn Tyr Ser Asp

305 310 315 320

Ala Val Tyr Asp Arg Val Gly Asn Ile Glu Met Ser Arg Ile Met Gly

325 330 335

Ala Asp Val Arg Leu Asp Ala Ala Gly Phe Asp Ile Gly Ile Arg Pro

340 345 350

Ser Trp Glu Lys Ala Met Ser Asp Val Val Glu Arg Gly Gly Lys Pro

355 360 365

Phe Pro Ile Pro Ala Gly Cys Ser Glu His Pro Tyr Gly Gly Leu Gly

370 375 380

Phe Val Gly Phe Ala Glu Glu Val Arg Gln Gln Glu Gln Ala Leu Gly

385 390 395 400

Phe Lys Phe Asp Tyr Ile Val Val Cys Ser Val Thr Gly Ser Thr Gln

405 410 415

Ala Gly Met Val Val Gly Phe Ala Ala Asp Gly Arg Ser Lys Asn Val

420 425 430

Ile Gly Ile Asp Ala Ser Ala Lys Pro Glu Lys Thr Arg Ala Gln Ile

435 440 445

Leu Arg Ile Ala Arg His Thr Ala Glu Leu Val Glu Leu Gly Arg Glu

450 455 460

Ile Thr Glu Glu Asp Val Val Leu Asp Thr Arg Phe Ala Tyr Pro Glu

465 470 475 480

Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Glu Ala Ile Arg Leu Cys Gly

485 490 495

Arg Leu Glu Gly Val Leu Thr Asp Pro Val Tyr Glu Gly Lys Ser Met

500 505 510

His Gly Met Ile Glu Met Val Arg Arg Gly Glu Phe Pro Glu Gly Ser

515 520 525

Lys Val Leu Tyr Ala His Leu Gly Gly Val Pro Ala Leu Asn Ala Tyr

530 535 540

Ser Phe Leu Phe Arg Asn Gly

545 550

Claims

1.构建重组水稻黄单胞菌的方法，其特征在于：包括将融合蛋白的编码基因导入受体水稻黄单胞菌，得到重组水稻黄单胞菌，所述融合蛋白是由细胞外膜表面展示所用的锚定蛋白与ACC脱氨酶融合而成的蛋白质；

所述ACC脱氨酶为X1或X2的蛋白质：

X1、氨基酸序列是序列表中序列2第214-551位的氨基酸；

X2、在X1所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；

所述锚定蛋白为由序列表中序列2第1-211位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因包括ACC脱氨酶的编码基因，所述ACC脱氨酶的编码基因为编码序列是序列表中序列1第640-1656位的cDNA分子或基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因包括所述锚定蛋白的编码基因，所述锚定蛋白的编码基因为编码序列是序列表中序列1第1-633位的cDNA分子或基因组DNA。

4.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因为核苷酸序列为序列表中序列1的cDNA分子或基因组DNA。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组水稻黄单胞菌的细胞外膜表面表达所述ACC脱氨酶。

6.由权利要求1-5中任一所述的方法构建的重组水稻黄单胞菌。

7.权利要求1-5中任一所述方法或权利要求6所述重组水稻黄单胞菌在U1-U7任一种或多种中的应用：