CN114574472B

CN114574472B - 一种重组多糖降解酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN114574472B
Application number: CN202011402573.9A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 孙明; 王文霞
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: CN114574472A

Abstract

本发明公开了一种重组多糖降解酶及其编码基因与应用，属于基因工程领域。双功能酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，双功能酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酶具有将甘露糖醛酸C‑5差向异构和裂解褐藻胶两种功能。利用基因工程的技术方法，将该酶的基因克隆到表达载体上，获得可异源表达该酶的重组菌株，异源表达的酶，能高效的将β‑D‑甘露糖醛酸(M)转化为α‑L‑古罗糖醛酸(G)以及将褐藻胶裂解为低聚糖。本发明提供的双功能酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药等领域。

Description

一种重组多糖降解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种重组多糖降解酶及其编码基因与应用，属于基因工程领域。

背景技术

褐藻胶作为褐藻细胞壁的填充物质，其生物功能类似于陆生植物的纤维素，来源丰富，在褐藻中含量相对较高，可占到藻体干重的20％-40％。褐藻胶是一种线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)和它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(Guluronate,G)两种糖醛酸残基通过β-1,4糖苷键连接而成。虽然褐藻胶只有β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸两种组成成分，但不同单体构成以及糖链序列所呈现出的特性却是多种多样的。目前研究人员将褐藻胶中的糖链序列模式分为三种，全部由β-D-甘露糖醛酸组成的聚甘露糖醛酸片段(polyβ-D-Mannuronate,polyM)，全部由α-L-古罗糖醛酸组成的聚古洛糖醛酸片段(polyα-L-Guluronate,polyG)，由两种糖醛酸交替排列组成的甘露糖醛酸-古洛糖醛酸杂合片段(polyMG)。如下结构式所示：

褐藻胶寡糖是褐藻胶的降解产物，水溶性好，具有免疫调节、血糖血脂调控、抗炎、抑制肿瘤、促进植物生长、诱导植物抗性等多种生物活性，目前已被开发为多种产品，应用于食品、制药、农业等多个领域。褐藻胶寡糖的活性与其结构密切相关，而制备方法又是其结构控制的关键环节。目前褐藻胶寡糖的制备方法主要包括化学法、物理法以及生物法，其中化学法反应条件苛刻，反应时间较长，且产物质量不易控制；物理法需要多种仪器以及方法联用，操作繁琐，而且产物聚合度通常较大，很难达到活性要求；生物法主要以酶法为主，反应条件较为温和，低碳环保，反应过程容易控制，产品生物活性高。而且目前研究发现有一些褐藻胶裂解酶对底物具有不同的降解偏好性，因此利用酶降解的方法在实现聚合度控制的基础上，还可以利用酶对底物的偏好性，对降解产物的单糖组成达到一定程度的控制。

褐藻胶寡糖M/G的比例对其生物活性也有很大的影响，如富含M的褐藻胶寡糖具有抗肿瘤、免疫调节等作用，而富含G的褐藻胶寡糖具有抗艾滋病等重要应用价值。最新在医药领域的研究表明：由寡M段褐藻胶寡糖制备的I类候选新药“GV971”能抑制β-淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，可用于治疗轻中度阿尔兹海默症，已经获批上市。这些研究表明，特定M/G的比例的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，因此实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

研究发现自然界中存在可以将β-D-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)转化为它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(Guluronate,G)的酶，这类酶被命名为甘露糖醛酸C-5差向异构酶(Mannuronan C-5epimerase)，一般来源于海藻、假单胞菌属以及棕色固氮菌属。

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)中含有两类不同的甘露糖醛酸C-5差向异构酶。其中AlgE是一个包括了7个成员的异构酶家族，该家族的酶可实现多聚物M到G的催化转化，发挥作用时依赖于Ca²⁺的存在，Ca²⁺作为阳离子可稳定蛋白的结构。其中AlgE7，分子量为90.4kD，同时具有差向异构和裂解两种活性，产物为GG和MG片段。但该酶的分子量较大，异源表达和实际应用时常会受到一定程度的限制。棕色固氮菌中的另一个甘露糖醛酸C-5差向异构酶AlgG是一个定位于周质的蛋白，其差向异构酶活性可以不依赖于Ca²⁺，然而添加钙离子也会适度刺激酶活性。比较特殊的是，该酶的产物只有MG片段，而且该酶的异构化活性会被锌离子阻断。来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的甘露糖醛酸C-5差向异构酶也定位于胞质外，该酶可以将最小单元为9碳糖的褐藻胶寡糖进行M到G的催化变位，且酶反应过程同样不需要钙离子的参与，最终产物古洛糖醛酸单体的含量可达到75％，研究发现AlgG不具备裂解酶活性。2016年研究人员成功实现了来源于褐藻中的甘露糖醛酸C-5差向异构酶ManC5-E，在大肠杆菌中的异源表达，证明其具有体外异构酶活性，然而该酶并没有裂解酶的活性，其与专一降解古洛糖醛酸的AlyA1协同作用时，由于发挥了异构酶的作用，可增加AlyA1的降解能力。

近年来，研究人员对双功能酶的催化机制进行了更深入的研究，发现Alg7E的甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性和裂解酶活性，来源于同一活性位点。而最近报道的来源于门多萨甲单胞菌的甘露糖醛酸C-5差向异构酶PmC5A，也具有裂解酶的活性，但两种酶活性的活性位点却有所不同，具体两种活性的呈现比例会受到温度的调控。

应用甘露糖醛酸C-5差向异构酶可以进一步实现对褐藻胶寡糖结构的调控，而同时具有裂解酶的双功能酶在聚合度和M/G比例调控中应用优势更加明显，遗憾的是目前已报道的异构酶和裂解酶活性同时具备的双功能酶屈指可数，且存在分子量大、活性低等不足，极大地限制了这类酶在实际产品开发中的应用。

发明内容

本发明利用PCR技术对全长双功能褐藻胶裂解酶PmC5A截掉17个氨基酸残基，获得了截短酶，截短酶的表达量可达5.96g/L发酵液，约为全长蛋白表达量的1.83倍，两种酶活性也有不同程度的提高，其中裂解酶活性提高23.4％，异构酶活性提高21.1％。

截短的重组甘露糖醛酸C-5差向异构酶，同时具有裂解酶的活性，具有分子量低，易于异源表达，变位活性高，作用底物范围广，稳定性好等特点，可以应用于不同结构褐藻胶寡糖的制备及产品开发。

本发明的第一个目的是提供一种截短的重组甘露糖醛酸C-5差向异构/褐藻胶裂解的双功能酶PmC5A-J及其编码基因，将其应用于褐藻胶寡糖的降解制备过程中，可以在实现聚合度控制的同时，同时实现一定范围内的M/G的比例控制。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型双功能酶PmC5A-J的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的双功能酶PmC5A-J基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种双功能酶PmC5A-J在褐藻胶降解利用和差向甘露糖醛酸中的应用。

一种双功能酶基因PmC5A-J，所述双功能为差向甘露糖醛酸以及断裂褐藻胶；其全长蛋白酶来源于海胆肠胃中分离纯化的门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina，从中扩增出的双功能酶PmC5A编码基因，本发明利用PCR技术对全长双功能褐藻胶裂解酶PmC5A截掉17个氨基酸残基，获得了截短酶，截短酶基因的核苷酸序列具有如下特征中的一种、二种或二种以上：

1)具有SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个、两个或两个以上核苷酸取代和/或缺失和/或添加而得到的编码具有双功能酶活性的核苷酸序列；

4)与SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码差向甘露糖醛酸将β-D-甘露糖醛酸转化为α-L-古罗糖醛酸/断裂褐藻胶的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

本发明还提供了双功能酶基因PmC5A-J编码的氨基酸序列，具有如下特征中的一种、二种或二种以上：

1)具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列；

2)具有SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-452位氨基酸残基序列，其中200-350位为具有双功能酶PmC5A-J活性的氨基酸序列；

3)对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列(从氨基端开始的第1-452位氨基酸残基)进行一个或两个以上氨基酸取代和/或缺失和/或添加而形成具有双功能酶活性的氨基酸序列。

本发明的双功能酶PmC5A-J的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的双功能酶PmC5A-J的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

本发明还提供了一种含有所述双功能酶基因的重组质粒。

本发明还提供了一种含有所述的双功能酶的重组基因工程菌。

本发买还提供了所述双功能重组酶PmC5A-J的制备方法，是将双功能酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的双功能酶。

进一步地，所述双功能酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种、二种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个、两个或两个以上核苷酸取代和/或缺失和/或添加而得到的编码具有双功能酶活性的核苷酸序列。

进一步地，所述的重组表达载体包括大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

进一步地，所述宿主细胞即用于重组表达双功能酶PmC5A的重组菌或转基因细胞系，包括大肠杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞包括Escherichia coli BL21、Escherichiacoli JM109或Escherichia coli DH5α；所述乳酸菌宿主细胞包括Lactic acid bacteriaCOCC101；所述酵母菌宿主细胞包括Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris或Kluyveromyceslactis；所述枯草杆菌宿主细胞包括Bacillus subtilis R25或Bacillussubtilis9920；所述放线菌宿主细胞包括Streptomyces spp.；所述丝状真菌宿主细胞包括Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger或Aspergillusnidulans；所述昆虫细胞包括Bombyxmori或Antharaea eucalypti；所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK或中国仓鼠肺细胞CHL。

本发明的双功能酶PmC5A-J的基因序列是通过PCR技术对来源于门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的双功能酶PmC5A截短获得的。该基因编码区长1377bp，包含多个结构域。

本发明还提供了一种所述的双功能酶在褐藻胶降解和差向甘露糖醛酸中的应用。

进一步地，所述应用，包括下述中的一种、二种或二种以上：

1)在断裂褐藻胶的糖苷键，获得单糖或褐藻胶寡糖中的应用；

2)在差向甘露糖醛酸C-5键，获得不同结构的褐藻胶中的应用；

3)在褐藻胶寡糖M/G比例调控中的应用。

本发明所提供的双功能酶，活性不受钙离子的影响。

本发明所提供双功能酶的应用，可以在降低褐藻胶聚合度的同时，在G含量0-60％的范围内调控降解产物的M/G比例；在降解褐藻胶时，产物为MG或GG片段；可生成最低平均聚合度为4的褐藻胶寡糖，G含量可达60％。

本发明提供的截短的重组双功能酶，具有异构和裂解的双重活性，与全长的酶相比，截短了17个氨基酸，分子量降低，在工程菌种表达量升高，达到5.96g/L，是全长蛋白表达量的1.83倍，而且截短酶的酶活与全长蛋白相比也有不同程度的升高，其中裂解酶活性提高23.4％，异构酶活性提高21.1％。

利用基因工程的技术方法，将截短的重组双功能酶的基因克隆到表达载体上，获得可异源表达该酶的重组菌株，异源表达的酶，能高效的将β-D-甘露糖醛酸(M)转化为α-L-古罗糖醛酸(G)以及将褐藻胶裂解为低聚糖。本发明提供的双功能酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药等领域。

本发明所提供的截短酶PmC5A-J具有分子量低，易于异源表达，变位活性高，作用底物范围广，稳定性好等特点，可以成为不同结构褐藻胶寡糖制备的有效工具，在新型的褐藻胶寡糖产品开发中具有应用前景。

附图说明

图1为双功能酶基因PmC5A-J琼脂糖凝胶电泳检测；泳道1：核酸标准；泳道2：PmC5A扩增产物；泳道3：PmC5A-J扩增产物。

图2为双功能酶PmC5A-J表达的SDS-PAGE图；各泳道加入的样品分别是：泳道Marker：Marker蛋白分子量标准，泳道1：PmC5A粗酶液，泳道2：PmC5A-J粗酶液。

图3为双功能酶PmC5A与PmC5A-J酶活力的比较。

图4为双功能酶PmC5A-J作用于不同聚合度/不同G含量褐藻胶的¹H NMR图谱。

图5为双功能酶PmC5A-J对海藻多糖作用产物的液相色谱图。

图6为双功能酶PmC5A-J对海藻多糖作用产物的质谱图。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1截短酶基因克隆

对门多萨假单胞菌的PmC5A双功能酶基因序列(通过发明专利申请201910340709.9方法获得)进行分析后，设计简并引物SEQ ID NO.3：PmC5A-J-F:5’-CGTCTCGGCGATGAACCAGCTCACCGGTGTACCAAGATCTCGATGATCAT-3’；SEQ ID NO.4：PmC5A-J-R:5’-GCCGCCGACGATGATCATCGAGATCTTGGTACACCGGTGAGCTGGTTCAT-3’，以获得的门多萨假单胞菌的PmC5A基因为模板，扩增截短双功能酶成熟蛋白的基因序列。PCR反应条件为：94℃2min，1个循环；94℃10s，55℃30s，72℃7min，30个循环；72℃10min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pET21a上后测序。

实施例2截短双功能酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的截短双功能酶基因(命名为PmC5A-J)编码区长1377bp，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。PmC5A-J编码452个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为50.67kDa。

实施例3 PmC5A-J基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入NdeI和XhoI酶切位点。将PCR清洁产物PmC5A-J和表达载体pET21a分别用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经清洁回收后，用T₄DNA连接酶连接(连接体系：(5μLT₄DNA Ligase 0.5μL，10×T₄DNA LigaseBuffer 0.5μL，pET21a 2μL，PCR产物2μL)，连接条件：室温过夜连接。)。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 2所示的PmC5A-J基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pET21a-PmC5A-J。

将pET21a-PmC5A-J转化E.coli BL21(DE3)，对其进行诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测双功能酶PmC5A-J的表达情况，结果如图2所示。双功能酶PmC5A-J在电泳胶上的位置与预测的分子量相吻合。

用同样的方法进行PmC5A的表达，相同条件下，发现突变酶的分子量明显降低，与其理论分子量50.67kDa相符，而且表达量提高。通过蛋白含量测定，截短酶表达量提高约30％。

实施例4 PmC5A-J基因在食品级乳酸菌中的重组表达及纯化

PmC5A-J编码基因序列的5’端前加入NcoⅠ酶切位点、Usp45的信号肽碱基序列，3’端终止密码子前加入6×His标签，终止密码子后加入HindIII酶切位点。因引入了酶切位点NcoI，为不引起移码突变，在信号肽前补1个A碱基，序列送至基因公司，进行乳酸菌表达密码子的优化，合成全基因。合成基因重组于PUC57-PmC5A-J质粒以及乳酸菌表达载体PNZ8148经内切酶NcoI、HindIII双酶切，回收目的基因片段以及表达载体片段，二者加入T4DNA连接酶过夜连接，转化于化学感受态大肠肝菌MC1061中，获得的阳性克隆载体PNZ8148-PmC5A-J送华大基因测序确认正确。

制备乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，加入阳性克隆载体PNZ8148-PmC5A-J，转移至2mm电击杯中，调节好电转仪BTX Gemini X2参数(电压1800V，200欧姆，25μF)，电击约4.5ms后，加入1mL冰预冷的GM17MC恢复培养基，30度静置2h，取上述液体分10、100和900μL进行涂板(GM17C固体培养基)厌氧培养2d。挑取单菌落，于5mL的GM17C液体培养基中过夜培养。获得含有目的基因的阳性乳酸菌L.lactis NZ9000/PNZ 8148-PmC5A-J,阳性克隆测序确认。同样方法转化空载体PNZ8148作阴性对照，菌株为NZ9000/PNZ8148。

将重组表达菌L.lactis NZ9000/PNZ 8148-PmC5A-J以1：100的体积比接种于GM17C液体培养基，30度条件下静置培养过夜；将过夜培养物以1：50的体积比接种于GM17C液体培养基，继续培养约2.5h至细菌OD600≈0.5；分为诱导组和对照组(不诱导)，诱导组加入Nisin至终质量浓度为1ng·mL^-1，诱导6h后终止培养，4度、12000r离心10min，分别得到菌体沉淀和培养液上清。菌体沉淀重悬于10mM咪唑溶液中，功率400W，超声4s，间隔6s，超声次数200次，破碎后分离上清与沉淀，沉淀用PBS缓冲液重悬。破碎上清液与沉淀各取50uL，加入10μL 6×Protein loading buffer。培养液上清用脱氧胆酸盐三氯乙酸沉淀法进行检测；取1mL培养液上清，加入10μL脱氧胆酸钠溶液和150μL三氯乙酸溶液，4度条件下静置30min后，12 000r·min^-1离心15min，加入1mL预冷的丙酮洗涤沉淀2次，将沉淀溶解于50μL50mmol·L^-1的NaOH溶液中，加入10μL的6×Protein loadingbuffer。各处理样品同时作空载对照。将上述处理好的破碎上清液、破碎沉淀、培养液上清样品进行SDS-PAGE电泳。

蛋白纯化选用GE公司的纯化柱及镍填料纯化目的蛋白，选择不同浓度的咪唑溶液(20～200mmol·L^-1)梯度洗脱，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE分析，确定洗脱液的最佳咪唑溶液浓度。并用BCA法测定蛋白浓度。选择最佳浓度进行，用透析袋进行浓缩，以便后续进行活性等测试。

目前，褐藻裂解/C-5差向异构双功能酶已经可以通过大肠杆菌表达系统获得，大肠杆菌表达系统具有培养周期短、成本低、产量高的优势，但其以异丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)等有毒物质进行诱导，而且大肠杆菌本身含有内毒素和有毒蛋白，需经过分离纯化过程，这是该表达系统的不足。与之相比，乳酸菌表达系统，可以免除复杂繁琐的提纯步骤，更为重要的是，乳酸菌为非致病性微生物，本专利提供的携载了PmC5A-J的重组乳酸菌是食品级的，不含外源抗生物抗性基因。利用该乳酸菌表达双功能酶在食品、医药领域有更广泛的应用。

实施例5重组酶PmC5A-J的裂解酶活性测定

以1000μL 0.5％(w/v)的褐藻胶为底物，加入500μL在乳酸菌中重组表达的重组酶PmC5A-J，反应30min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得PmC5A-J的活性。与相同条件下与全长的PmC5A的活性相比，裂解酶活性提高23.4％(图3)。

实施例6重组酶PmC5A-J异构酶活性测定

将0.5％(w/v)海藻多糖(G含量为36％)与在乳酸菌中重组表达的重组酶PmC5A-J按2:1(体积比)的比例混合后，在30℃条件下反应2h，通过高分辨核磁共振(NMR)对其产物进行分析。如图4所示，PmC5A-J作为差向异构酶可以引入G残基，同时该G残基的引入更加有利于裂解酶对底物的降解。对NMR谱图进行深入分析，发现PmC5A-J在最初反应过程中提高了底物的G含量从36％提高至60％，与全长的PmC5A的异构酶活性相比提高21.1％。随后尽管裂解反应一直进行，但是该G含量稳定在一定范围。对端基结构进行进一步解析，可以发现G作为主要的还原端。采用液相色谱和质谱进行褐藻胶寡糖聚合度分布分析(图5、图6)，两种方法均显示褐藻胶寡糖的聚合度为DP2-6，采用比色法进行褐藻胶寡糖产物平均聚合度分析，平均聚合度约为4。

因此，PmC5A-J可用于海藻酸低聚糖的制备以及与海藻酸改性相关方面的研究，包括农业、食品、饲料添加、医药及海藻酸低聚糖制备等领域。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种重组多糖降解酶及其编码基因与应用

<130> 2020

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1367

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

atggaagcgc ccaagctgcc ggacctgtcc ggctacacca aggaggccgt gctggccaag 60

attccgcgtg acaaacgcgg caaggtagtg gtgcggcgca tgctgcgcca ggacgcgctg 120

aaggacttca ccggcggcaa cgaacgcctg cgcgaatgga tcaagcgcca gcagggcatg 180

ccccaggcga tcttcatcga aggtggcctg gtcaccgccc aggatctggc caaggcgctg 240

cccgacagcc agttcgccga acaggaacct ggcgtgtacc tcgctcgcct gcccatcgtc 300

gtcgccgagg gcgccgcgct gcatgtcggc aaggaaaccc gcgaactgcg cctgtcgcag 360

gagcgcggtt cgttcctggt caacgacggc ctgatgttcc tcaccgacac ccgcgtcacc 420

gcctggcgcg aggccgacaa cggcccggcg accatgcgcg acaacggcaa ggaattccgc 480

ccgttcctgg tctcctgggg cggcagcgag ctgtatatcg cgggcagcgt gatcaccagc 540

ctgggctacg acaactccaa gtcctacggg gtgtcgatca cccagtacac gccgaacatg 600

cacgaacgcc tcaagcgcga cgagccgacc ggctggctga tcgactccga gttcgtcgac 660

cactggtacg gtttctactg ctacgaagcg cagaacgtgg tgatcaaggg caacacctac 720

cgcgacaaca tcgtctacgg catcgacccg cacgaccgct cccacggcct gatcatcgcc 780

gagaacaccg tgttcggcac caagaagaag cacggcatca tcatctcgcg cgaggtcaac 840

gacagctgga tcatcaacaa cgagagctac gacaacaagc tctccggcgt ggtcatcgac 900

cgtaacagcg aacgcaacct aatcgcctac aaccgcgtgc acggcaatca ctccgacggc 960

atcaccctgt acgagagcgg cgacaacctg ctgtggggca accatgtact gggcaaccag 1020

cgccacggca ttcgcatccg cagcagcgag aacattcgcc tctacgacaa cgtctcggcg 1080

atgaaccagc tcaccggtgt accaagatct cgatgatcat cgtcggcggc accctggccg 1140

gcaacggctc cagcccgatc aacatcgact cgccgctgtc ggtcgagctg taccgcgtga 1200

agatgctcgc gccgcgcaag agcagcggca tccagctcgc cggcatcctc ggcgagaaac 1260

aggacgaaat ccttgacctc atggtgcgcc agcgcctgcc cgtgctgatc gatccgatcg 1320

agcccgagac gcagaccaac ctcgagcacc accaccacca ccactga 1367

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Met Glu Ala Pro Lys Leu Pro Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Glu Ala

1 5 10 15

Val Leu Ala Lys Ile Pro Arg Asp Lys Arg Gly Lys Val Val Val Arg

20 25 30

Arg Met Leu Arg Gln Asp Ala Leu Lys Asp Phe Thr Gly Gly Asn Glu

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Trp Ile Lys Arg Gln Gln Gly Met Pro Gln Ala Ile

50 55 60

Phe Ile Glu Gly Gly Leu Val Thr Ala Gln Asp Leu Ala Lys Ala Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Gln Phe Ala Glu Gln Glu Pro Gly Val Tyr Leu Ala Arg

85 90 95

Leu Pro Ile Val Val Ala Glu Gly Ala Ala Leu His Val Gly Lys Glu

100 105 110

Thr Arg Glu Leu Arg Leu Ser Gln Glu Arg Gly Ser Phe Leu Val Asn

115 120 125

Asp Gly Leu Met Phe Leu Thr Asp Thr Arg Val Thr Ala Trp Arg Glu

130 135 140

Ala Asp Asn Gly Pro Ala Thr Met Arg Asp Asn Gly Lys Glu Phe Arg

145 150 155 160

Pro Phe Leu Val Ser Trp Gly Gly Ser Glu Leu Tyr Ile Ala Gly Ser

165 170 175

Val Ile Thr Ser Leu Gly Tyr Asp Asn Ser Lys Ser Tyr Gly Val Ser

180 185 190

Ile Thr Gln Tyr Thr Pro Asn Met His Glu Arg Leu Lys Arg Asp Glu

195 200 205

Pro Thr Gly Trp Leu Ile Asp Ser Glu Phe Val Asp His Trp Tyr Gly

210 215 220

Phe Tyr Cys Tyr Glu Ala Gln Asn Val Val Ile Lys Gly Asn Thr Tyr

225 230 235 240

Arg Asp Asn Ile Val Tyr Gly Ile Asp Pro His Asp Arg Ser His Gly

245 250 255

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Val Phe Gly Thr Lys Lys Lys His Gly

260 265 270

Ile Ile Ile Ser Arg Glu Val Asn Asp Ser Trp Ile Ile Asn Asn Glu

275 280 285

Ser Tyr Asp Asn Lys Leu Ser Gly Val Val Ile Asp Arg Asn Ser Glu

290 295 300

Arg Asn Leu Ile Ala Tyr Asn Arg Val His Gly Asn His Ser Asp Gly

305 310 315 320

Ile Thr Leu Tyr Glu Ser Gly Asp Asn Leu Leu Trp Gly Asn His Val

325 330 335

Leu Gly Asn Gln Arg His Gly Ile Arg Ile Arg Ser Ser Glu Asn Ile

340 345 350

Arg Leu Tyr Asp Asn Val Ser Ala Met Asn Gln Leu Thr Gly Val Tyr

355 360 365

Gly His Thr Lys Ile Ser Met Ile Ile Val Gly Gly Thr Leu Ala Gly

370 375 380

Asn Gly Ser Ser Pro Ile Asn Ile Asp Ser Pro Leu Ser Val Glu Leu

385 390 395 400

Tyr Arg Val Lys Met Leu Ala Pro Arg Lys Ser Ser Gly Ile Gln Leu

405 410 415

Ala Gly Ile Leu Gly Glu Lys Gln Asp Glu Ile Leu Asp Leu Met Val

420 425 430

Arg Gln Arg Leu Pro Val Leu Ile Asp Pro Ile Glu Pro Glu Thr Gln

435 440 445

Thr Asn Leu Glu

450

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

cgtctcggcg atgaaccagc tcaccggtgt accaagatct cgatgatcat 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

gccgccgacg atgatcatcg agatcttggt acaccggtga gctggttcat 50

Claims

1.一种双功能酶基因，其特征在于：所述双功能为差向甘露糖醛酸以及断裂褐藻胶；其核苷酸序列为编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所述的双功能酶基因编码的双功能酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述双功能酶基因的重组质粒。

4.一种含有权利要求2所述的双功能酶的重组基因工程菌。

5.一种权利要求2所述的双功能酶的制备方法，其特征在于：将双功能酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的双功能酶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的重组表达载体包括大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种、二种或二种以上。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

8.一种权利要求2所述的双功能酶在褐藻胶降解和差向甘露糖醛酸中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种、二种或二种以上：

1）在断裂褐藻胶的糖苷键，获得单糖或褐藻胶寡糖中的应用；

2）在差向甘露糖醛酸C-5键，获得不同结构的褐藻胶中的应用；

3）在褐藻胶寡糖M/G比例调控中的应用。